Made available in DSpace on 2018-08-02T00:16:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_2690_dissertaçãoversão partes suprimidas ultima versão.pdf: 1126830 bytes, checksum: 1224f0ace7cac0587e6ad5afd8cbc6a5 (MD5) Previous issue date: 2006-12-20 / RESUMO O mercado consumidor está buscando uma vida saudável, se destacando o consumo de produtos semelhantes ao alimento natural, que propiciem características visuais, organolépticas e nutricionais, e que seja seguro do ponto de vista microbiológico. A Alta pressão hidrostática (HHP) se destaca, por eliminar microrganismos e enzimas deteriorantes dos alimentos, causando mínimas alterações nos componentes do flavor e dos nutrientes. A de HHP afeta apenas ligações químicas não covalentes; deixando intactas as ligações covalentes (vitaminas e os compostos voláteis) que conferem o sabor dos alimentos. Esse trabalho demonstra a eficiência da HHP na conservação de polpa de frutas tropicais (mamão e manga), analisando a microbiota e equivalência substancial, durante 28 dias, sob temperaturas de 4 e 28 oC. As polpas foram tratadas com pressões de 150 a 400 MPa por 10 min, e submetidas a análises microbiológicas. O resultado foi um crescimento de microrganismos inversamente proporcional ao valor de pressão aplicado. A fim de se obter um valor de pressão e um tempo mínimo de tratamento, submetemos a polpa a um tratamento por 5 minutos. Resultando em polpas estéreis, por um período de 28 a 4 e a 28 oC, ao mesmo tempo que as propriedades de equivalência substancial foram conservadas. Sob a temperatura de 4 oC há melhor conservação das características naturais em relação as polpas armazenadas a 28 oC. Os resultados obtidos demonstram a eficiência da HHP no processamento de polpas de mamão e manga, e sua vantagem em relação à pasteurização. Palavras-chave: Alta pressão hidrostática, conservação de alimentos, frutas tropicais, alimentos seguros.

A produção de proteínas recombinantes é uma ferramenta essencial para a indústria biotecnológica e suporta a expansão da pesquisa biológica moderna. Uma variedade de hospedeiros pode ser utilizada para produzir estas proteínas e dentre eles, as bactérias E. coli são as hospedeiras mais utilizadas. No entanto, a expressão heteróloga de genes em E. coli frequentemente resulta em um processo de enovelamento incompleto que leva ao acúmulo de agregados insolúveis, conhecidos como corpos de inclusão (CI). Altas pressões hidrostáticas são capazes de desfavorecer interações intermoleculares hidrofóbicas e eletrostáticas, levando à dissociação dos agregados e por isso são úteis para solubilizar e renaturar proteínas agregadas em CI. O presente trabalho teve como objetivo o estudo do processo de desagregação dos CI e de renaturação das proteínas oligoméricas subunidade B da toxina colérica (CTB) e região globular da fibra adenoviral (RGFA) utilizando altas pressões hidrostáticas. A toxina colérica (CT) é composta por uma subunidade A e cinco subunidades B combinadas em uma holotoxina AB5. A CTB é a porção pentamérica não tóxica da CT, responsável pela ligação da holotoxina ao receptor gangliosídeo GM1. A fibra do adenovírus é uma proteína homotrimérica que forma parte do capsídeo viral, organizada em três regiões: a cauda N-terminal, a haste central e a região C-terminal (região globular). A RGFA se liga à proteína de membrana CAR nas células hospedeiras e promove a internalização do vírus. Os estudos apresentados neste trabalho demonstraram que a alta pressão hidrostática foi eficaz na desagregação dos CI da CTB e da RGFA. As condições de renaturação foram otimizadas utilizando-se diferentes proporções do par redox glutationa oxidada e reduzida, concentrações de agentes caotrópicos, presença de aditivos e esquemas diferenciados de compressão/descompressão daqueles previamente descritos na literatura. CTB solúvel e pentamérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI a 2,4 kbar por 16 horas em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,5, 1 mM de tween 20 e descompressão direta seguida de incubação em pressão atmosférica. O rendimento de renaturação da CTB solúvel e pentamérica foi de até 45 % e 288 mg de CTB/litro de cultura bacteriana. Esta proteína apresentou estrutura regular e atividade biológica. RGFA trimérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,0 e 0,5 M de L-arginina a 2,4 kbar por 1,5 horas e 0,4 kbar por 16 horas antes da completa descompressão. O rendimento de proteína solúvel trimérica da RGFA foi de 4 %, porém não foi possível obter a atividade biológica desta proteína. / The production of recombinant proteins is an essential tool for the biotechnology industry and supports the expansion of modern biological research. Recombinant proteins can be produced by a variety of hosts and among them the bacteria E. coli is the most commonly used. However, the expression of heterologous genes in E. coli often results in an incomplete folding process that leads to the accumulation of insoluble aggregates known as inclusion bodies (IB). The application of high hydrostatic pressure impairs intermolecular hydrophobic and electrostatic interactions of proteins in solution, leading to dissociation of aggregates and is therefore useful tool to solubilize and refold aggregated proteins in IB. This work aimed to study the process of disaggregation of IB and refolding of oligomeric proteins the B subunit of cholera toxin (CTB) and the globular region of the adenoviral fiber (RGFA) using high hydrostatic pressure. The cholera toxin (CT) comprises one A subunit and five B subunits, combined in the AB5 holotoxin. The pentameric CTB is non-toxic moiety of CT which is responsible for binding to the receptor ganglioside GM1 holotoxin. The adenovirus fiber is a homotrimeric protein wich forms part of the viral capsid and it is organized into three regions: the N-terminal tail, the central rod and the C-terminal region (globular region). The RGFA binds to membrane protein CAR in host cells and promotes the internalization of virus. The studies presented here demonstrate that high hydrostatic pressure was effective in the disaggregation of the CTB and RGFA IB. The refolding conditions were optimized using different proportions of the redox couple oxidated and reduced glutathione, concentrations of chaotropic agents, presence of additives and pressure/decompression schemes distinguished from the previously described in the literature. Soluble pentameric CTB was obtained when the suspension of IB were compressed at 2.4 kbar for 16 hours in 50 mM of Tris-HCl buffer pH 8.5, 1 mM of tween 20, followed by direct decompression and incubation at atmospheric pressure. The yield of refolded soluble pentameric CTB was up to 45 % and 288 mg of CTB/ liter of bacterial culture. This protein was shown to presented regular structure and biological activity. Trimeric RGFA was obtained by compression of the suspension of IB in 50 mM of Tris-HCl buffer pH 8.0, 0.5M L-arginine at 2.4 kbar for 1.5 hours and at 0.4 kbar for 16 hours prior to the complete decompression. The yield of soluble trimeric RGFA was 4 %, however this protein did not present biological activity.

A produção de proteínas recombinantes é uma ferramenta essencial para a indústria biotecnológica e suporta a expansão da pesquisa biológica moderna. Uma variedade de hospedeiros pode ser utilizada para produzir estas proteínas e dentre eles, as bactérias E. coli são as hospedeiras mais utilizadas. No entanto, a expressão heteróloga de genes em E. coli frequentemente resulta em um processo de enovelamento incompleto que leva ao acúmulo de agregados insolúveis, conhecidos como corpos de inclusão (CI). Altas pressões hidrostáticas são capazes de desfavorecer interações intermoleculares hidrofóbicas e eletrostáticas, levando à dissociação dos agregados e por isso são úteis para solubilizar e renaturar proteínas agregadas em CI. O presente trabalho teve como objetivo o estudo do processo de desagregação dos CI e de renaturação das proteínas oligoméricas subunidade B da toxina colérica (CTB) e região globular da fibra adenoviral (RGFA) utilizando altas pressões hidrostáticas. A toxina colérica (CT) é composta por uma subunidade A e cinco subunidades B combinadas em uma holotoxina AB5. A CTB é a porção pentamérica não tóxica da CT, responsável pela ligação da holotoxina ao receptor gangliosídeo GM1. A fibra do adenovírus é uma proteína homotrimérica que forma parte do capsídeo viral, organizada em três regiões: a cauda N-terminal, a haste central e a região C-terminal (região globular). A RGFA se liga à proteína de membrana CAR nas células hospedeiras e promove a internalização do vírus. Os estudos apresentados neste trabalho demonstraram que a alta pressão hidrostática foi eficaz na desagregação dos CI da CTB e da RGFA. As condições de renaturação foram otimizadas utilizando-se diferentes proporções do par redox glutationa oxidada e reduzida, concentrações de agentes caotrópicos, presença de aditivos e esquemas diferenciados de compressão/descompressão daqueles previamente descritos na literatura. CTB solúvel e pentamérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI a 2,4 kbar por 16 horas em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,5, 1 mM de tween 20 e descompressão direta seguida de incubação em pressão atmosférica. O rendimento de renaturação da CTB solúvel e pentamérica foi de até 45 % e 288 mg de CTB/litro de cultura bacteriana. Esta proteína apresentou estrutura regular e atividade biológica. RGFA trimérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,0 e 0,5 M de L-arginina a 2,4 kbar por 1,5 horas e 0,4 kbar por 16 horas antes da completa descompressão. O rendimento de proteína solúvel trimérica da RGFA foi de 4 %, porém não foi possível obter a atividade biológica desta proteína. / The production of recombinant proteins is an essential tool for the biotechnology industry and supports the expansion of modern biological research. Recombinant proteins can be produced by a variety of hosts and among them the bacteria E. coli is the most commonly used. However, the expression of heterologous genes in E. coli often results in an incomplete folding process that leads to the accumulation of insoluble aggregates known as inclusion bodies (IB). The application of high hydrostatic pressure impairs intermolecular hydrophobic and electrostatic interactions of proteins in solution, leading to dissociation of aggregates and is therefore useful tool to solubilize and refold aggregated proteins in IB. This work aimed to study the process of disaggregation of IB and refolding of oligomeric proteins the B subunit of cholera toxin (CTB) and the globular region of the adenoviral fiber (RGFA) using high hydrostatic pressure. The cholera toxin (CT) comprises one A subunit and five B subunits, combined in the AB5 holotoxin. The pentameric CTB is non-toxic moiety of CT which is responsible for binding to the receptor ganglioside GM1 holotoxin. The adenovirus fiber is a homotrimeric protein wich forms part of the viral capsid and it is organized into three regions: the N-terminal tail, the central rod and the C-terminal region (globular region). The RGFA binds to membrane protein CAR in host cells and promotes the internalization of virus. The studies presented here demonstrate that high hydrostatic pressure was effective in the disaggregation of the CTB and RGFA IB. The refolding conditions were optimized using different proportions of the redox couple oxidated and reduced glutathione, concentrations of chaotropic agents, presence of additives and pressure/decompression schemes distinguished from the previously described in the literature. Soluble pentameric CTB was obtained when the suspension of IB were compressed at 2.4 kbar for 16 hours in 50 mM of Tris-HCl buffer pH 8.5, 1 mM of tween 20, followed by direct decompression and incubation at atmospheric pressure. The yield of refolded soluble pentameric CTB was up to 45 % and 288 mg of CTB/ liter of bacterial culture. This protein was shown to presented regular structure and biological activity. Trimeric RGFA was obtained by compression of the suspension of IB in 50 mM of Tris-HCl buffer pH 8.0, 0.5M L-arginine at 2.4 kbar for 1.5 hours and at 0.4 kbar for 16 hours prior to the complete decompression. The yield of soluble trimeric RGFA was 4 %, however this protein did not present biological activity.

Orientadores: Carlos Francisco Sampaio Bonafé, Cláudio Chrysostomo Werneck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:27:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_RicardoDuraesde_M.pdf: 7651307 bytes, checksum: 3194190cf6a33de3b0cdc4ddb7424afd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A exposição à alta pressão é um método eficiente na inativação bacteriana, o qual é importante para a esterilização de alimentos. Neste trabalho, examinamos a inativação por alta pressão hidrostática em Aeromonas hydrophila AH 191, produtora de aerolisina, a qual possui atividades citotóxica, enterotóxica e hemolítica. Trinta min a 250 MPa (25 °C em PBS 0,1 M, pH 7,4), resultou em 9 log de UFC/mL de inativação bacteriana (a partir de 109 UFC/mL para <10 UFC/mL), porém, os tratamentos não alteraram a atividade hemolítica, enterotóxica e citotóxica produzidas por A. hydrophila AH 191. O sobrenadante de cultura bacteriana e o leite contaminado por A. hydrophila AH 191, pressurizado ou não, foram aplicados sobre células Vero e CaCo2, suspensões de hemácias humanas e de carneiro, e injetadas por via oral gástrica em camundongos Swiss, reproduzindo o ensaio de Dean. Os resultados mostram que os títulos das toxinas em amostras pressurizadas permaneceram iguais aos do controle, assim como as toxinas presentes nos sobrenadantes de cultura e no leite foram capazes de produzir acúmulo de líquidos no intestino de camundongos recém-nascidos. Estes resultados indicam a relevância do estudo na inativação de bactérias para a segurança alimentar e realça a importância de cautela no uso de alta pressão para a esterilização de alimentos, pois embora as bactérias possam ser inativadas, as toxinas produzidas por este micro-organismos podem continuar ativas, representando uma ameaça à saúde humana / Abstract: Exposure to high pressure is an efficient method for bacterial inactivation, which is important for the food sterilization. We examine the inactivation by high hydrostatic pressure in A. hydrophila AH 191, producer of aerolysin, which has cytotoxic, enterotoxic and hemolytic activities. A 30 min treatment at 250 MPa (25 °C in 0.1 M PBS, pH 7,4) resulted in 9 log CFU/mL of bacteria inactivation (from 109 CFU/mL to <10 CFU/mL). However, the treatment did not inactivate the hemolytic, enterotoxic and cytotoxic activities produced by A. hydrophila AH 191. The supernatant of bacterial culture and milk contaminated with A. hydrophila AH 191 pressurized or not were applied to Vero and CaCo2 cells, suspensions of human and sheep erythrocytes, and injected into mice via oral gastric Swiss reproducing the Dean test. The results show that evidence of toxins in samples pressurized remained similar to that of control, and the toxins in culture supernatants and milk were able to produce fluid accumulation in the intestine of suckling mouse. These results indicate the relevance of the study for bacteria inactivation to food security and enhance the importance for caution in the use of high prssure in foods sterilization, since although the bacteria can be inactivated, the toxins produced by micro-organisms continue to be active, representing a human health threat / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carlos Francisco Sampaio Bonafe / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T01:21:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_JoseLuisdaRocha_D.pdf: 2961900 bytes, checksum: 8d0413331d106601d34efccd4f8e6bb7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os vírus são estruturas auto-associaveis muito eficientes, porém, pouco é conhecido sobre a termodinâmica que governa essa associação dirigida. Em altos níveis de pressão ocorre dissociação do TMV ou desnaturação quando a pressão é combinada com uréia. Para um melhor entendimento de tais processos nós calculamos os parâmetros termodinâmicos aparentes de dissociação e desnaturação do TMV, assumindo uma condição de estado estacionário "steady-state condition". Esses processos podem ser monitorados pela diminuição de espalhamento de luz da solução virai devido ao processo de dissociação e pelo desvio para o vermelho do espectro de emissão de fluorescência, que ocorre com o processo de desnaturação. Nós determinamos a estequiometria aparente de uréia considerando a reação de equilíbrio de dissociação e desnaturação das subunidades do TMV, as quais forneceram, respectivamente, 1,53 e 11,1 mols de uréia/mol de subunidade de TMV. As condições de dissociação e desnaturação foram atingidas em uma via próxima da reversível, permitindo a determinação de parâmetros termodinâmicos. Analises de gel filtração em HPLC, microscopia eletrônica e dicroísmo circular confirmaram os processos de dissociação e desnaturação. Os cálculos das estequiometrias aparentes de uréia de vários vírus baseados em resultados espectroscópicos de artigos recentes mostraram que os processos de dissociação e desnaturação seguem uma estequiometria similar, sugerindo uma interação similar uréia-vírus entre estes sistemas. A desnaturação do TMV utilizando GndHCl foi mais eficiente que a uréia, apresentando estequiometria de 7,50 mols de GndHCl /mol de subunidade de TMV / Abstract: Viruses are very efficient self-assembly structures, but little is understood about the thermodynamics governing this directed assembly. At higher levels of pressure occurs dissociation of TMV or when pressure is combined with urea, denaturation occurs. For a better understanding of such processes, we investigated the apparent thermodynamic parameters of dissociation and denaturation by assuming a steady-state condition. These processes can be measured considering the decrease of light scattering of a viral solution due to the dissociation process, and the red shift of the fluorescence emission spectra, that occurs with the denaturation process. We determined the urea stoicbiometry considering the equilibrium reaction of TMV dissociation and subunit denaturation, which furnished, respectively, 1.53 and 11.1 mois of urea/mol of TMV subunit. The denaturation and dissociation conditions were arrived in a near reversible pathway, allowing the determination of thermodynamic parameters. Gel filtration HPLC, electron microscopy and circular dichroism confirmed the dissociation and denaturation processes. The calculation of apparent urea stoicbiometry of several other viruses based on spectroscopic results from earlier papers showed that dissociation and denaturation processes follow similar stoichiometrics, suggesting a similar virus-urea interaction among these systems. The TMV denaturation was more efficient in the presence of GndHCl, with stoichiometry of 7.50 mois of GndHCl /mol of TMV subunit / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.

Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.

Orientador: Carlos Francisco Sampaio Bonafe / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:45:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bispo_JoseAiltonConceicao_D.pdf: 6481701 bytes, checksum: eac9f13bfaae7f2d8718ad2773ff3e57 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Sistemas reacionais em fase líquida compreendem boa parte dos processos físicoquímicos que são estudados para fins de pesquisa e aplicação industrial. Estes estudos são conduzidos em geral de forma a se obter parâmetros de caracterização que tornem possível a padronização e otimização de processos, sejam eles de aplicação químico industrial ou biotecnológica. Em meio a esta necessidade de compreensão de diversos processos físicoquímicos, um ponto que chama a atenção de muitos grupos de pesquisa é a necessidade de aperfeiçoamento dos sistemas de caracterização e modelagem destes processos de forma a tornálos mais informativos e eficientes, tanto no que diz respeito à sua capacidade de caracterização quanto à sua capacidade de previsão. Neste contexto, a maior parte dos sistemas estudados têm como base a metodologia de caracterização desenvolvida por Gibbs-Duhem a aprtir do comportamento de gases ideais. Desvios no comportamento pressão volume são, nestes casos, corrigidos através do parâmetro definido como atividade. Assim, a estrutura de base desenvolvida por Gibbs-Duhem para gases ideais é mantida, deixando praticamente inalterada a relação que expressa a variação do potencial químico. No presente estudo observou-se que este tipo de abordagem e caracterização não produz resultados satisfatórios para o processo de dissociação por pressão de grandes agregados protéicos, e em alguns casos gerou dificuldades matemáticas que impediram a sua implementação em processos bastante comuns. A solução encontrada e o objetivo desta tese foram então o de conduzir uma nova abordagem para a caracterização destes sistemas que envolvem a dissociação por pressão de macromoléculas a partir de equações mais flexíveis para as mudanças de volume que as dos g ases ideais utilizadas por Gibbs-Duhen. O resultado desta nova abordagem foram relações com grande potencial de informação, de fácil aplicação e com uma alta capacidade de previsão / Abstract: The reaction processes involving macromolecules in liquid phase represent a significant part of the studies aiming industrial and technological applications.These studies are in general performed aiming access the parameters of characterization that allows the optimiz ation of chemical and biotechnological processes. In this view, the needing of understand distinct physicochemical processes represent a point that deserves the attention of many laboratories due to the needing of improvement modeling systems that furnish more efficient and precise information about the protein behavior under solution. Although the most of the studies performed aiming to reach this goal are based on the processes of characterization developed by Gibbs-Duhen, deviations on the pressure/volume furnished by the ideal gas equation are usually observed and corrected by means of the activity coefficient. Thus, the structural basis of the Gibbs-Duhem approach is maintained in despite of more complexes systems sho ws a nonlinearbehavior that produces in some cases significant deviations. In the present studie s we observed that the processes of pressure dissociation/denaturation of macromolecules leads to significant errors in respect to the experimental data. In this case the correction of these approach by means of the activity coefficient was not possible since the characterization equations became very complex. The goal of the present work was than to find a new description for these complex systems that allows to determine the properties of system and a precise thermodynamic modeling of these kind of processes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carlos Francisco Sampaio Bonafé, Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:59:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AncelmoRabelo_M.pdf: 2604011 bytes, checksum: 68977693022bd1bef29d71963a2562d5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Mycobacterium abscessus é um importante patógeno de origem hospitalar que contamina materiais cirúrgicos e biofarmacêuticos. Estes quando mal esterilizados tornam-se agentes infectantes gerando graves patologias nas pessoas que os utilizam. A crescente incidência desse patógeno, as dificuldades de tratamento, a gravidade clínica e, a dificuldade de esterilizar fômites contaminados com este patógeno motivou a investigação de processos alternativos de esterilização. Atualmente, utiliza-se a alta pressão hidrostática como método bastante adequado para reduzir a carga microbiana e esterilizar materiais hospitalares e biofarmacêuticos que são sensíveis à autoclave. Desta forma, investigou-se a inativação de M. abscessus induzida por pressão em diferentes condições de temperatura e de pH visando progredir em direção a um método de esterilização. De acordo com os resultados obtidos, tratamentos a 250 MPa não inativaram significativamente (5 a 8 ordens de magnitude) a bactéria em até 90 min a 20°C. Entretanto em -15°C a inativação foi completa. O tratamento a 250 MPa a 60ºC por 45 min promoveu significativa inativação bacteriana de até 9 unidades logarítmicas, incluindo o teste com PVC. Além disso, extremos de pH (4 ou 9) também diminuíram acentuadamente o número de bactérias tratados por alta pressão (250 MPa), com inativação completa após 45 min. Assim, este trabalho torna-se de suma importância, uma vez que aponta para o melhoramento de protocolos de descontaminação de fômites hospitalares / Abstract: Mycobacterium abscessus is an important hospital-acquired pathogen which induces infections from medical surgical and biopharmaceutical materials. The increasing incidence of this pathogen, the difficulties of treatment and clinical seriousness motivates the investigation of alternatives in sterilization processes. High hydrostatic pressure is a very adequate method for reducing microbial load and for sterilization of hospital materials and biopharmaceutical that are sensitive to autoclaving. We investigated the pressure-induced inactivation of M. abscessus combined with different temperatures and pH conditions aiming improvements toward a sterilization methodology. According to our findings, treatment at 250 MPa did not inactivate the bacteria significantly (5 to 8 orders of magnitude) up to 90 min at 20 oC, nevertheless at -15°C the inactivation was complete. The treatment at 250 MPa and 60ºC or above by 45 min promoted significant bacteria inactivation, at least 9 logarithmic units, including the test PVC. Extremes of pH values (4 or 9) also decrease very much the bacteria number induced by pressure (250 MPa), with complete inactivation at 45 min. The better knowledge of the effect of high hydrostatic pressure in micobacteria may contribute to improvements in the decontamination of medical materials and pharmaceuticals / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LimaNeto_DanielFerreira_D.pdf: 8189026 bytes, checksum: 64631e8e2ed546b6da6a944505049080 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular