Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.

Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.

Orientador: Marcelo Cristianini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-27T18:44:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_ThalesLeandroCoutinhode_D.pdf: 2386676 bytes, checksum: bc4655fa6960e3332639a4ca75c75545 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A redução do cloreto de sódio nas formulações de alimentos processados representa um grande desafio para indústria moderna, tendo em vista a relação estabelecida entre o consumo elevado de sódio e a ocorrência da hipertensão arterial, principal fator de risco associado à ocorrência de distúrbios do cérebro e cardiovasculares. Em produtos cárneos, além de atuar sobre aspectos sensoriais e de textura, o sal desempenha papel chave sobre sua estabilidade microbiológica. Uma simples redução pode resultar em produtos instáveis durante sua vida de prateleira. Logo, para que estratégias de redução de sal sejam implementadas de maneira segura, faz-se necessário a aplicação de tecnologias ou agentes de preservação complementares. Tecnologias emergentes não-térmicas de inativação microbiana como o processamento à Alta Pressão (HPP - High Pressure Processing) surgem como opções factíveis para tal propósito, eliminando a dependência de conservantes químicos em face à redução de sal. A adição de agentes antimicrobianos naturais como barreiras adicionais à HPP (Tecnologia de Múltiplas Barreiras), visando potencializar os efeitos conservadores, têm sido apontada como uma promissora tendência na literatura moderna. Diante deste exposto, após determinação da formulação de trabalho com teor reduzido de sódio, a pesquisa objetivou ajustar as variáveis de processo "carga de pressão" e "tempo de residência" (utilizando baixas temperaturas de 25°C) para o processamento de embutido de peito peru fatiado embalado a vácuo (tipo "Blanquet"). Foram avaliadas respostas de inativação microbiana pós-processo (reduções logarítmicas) para populações inoculadas do patógeno Listeria monocytogenes e bactérias ácido láticas deterioradoras incluindo as espécies Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus sakei; também foram avaliados os atributos de qualidade incluindo cor, atividade de água, pH, sinerese, textura e oxidação lipídica. Em adição, visando à utilização de tecnologia de múltiplas barreiras para conservação, foi estudado o efeito da adição do componente bioativo carvacrol em concentrações de 200ppm, na formulação do produto. Empregando estratégia de simples redução, sem a adição sais substitutos, após avaliação de aspectos físico-químicos, sensoriais e microbiológicos, concluiu-se que níveis de 30% de redução de sal (cerca de 25% menos sódio) sobre o controle formulado com 20g/kg, são viáveis; entretanto, foi evidenciada redução da estabilidade microbiológica. Após avaliação de diferentes faixas de pressão e tempo de processo, seguindo os critérios exigidos de desempenho para inativação pós-processo de Listeria monocytogenes (4-5 reduções logarítmicas), um valor de 600MPa/180 segundos a 25°C se apresentou como um tratamento adequado para o produto com baixo teor de sódio estudado, promovendo reduções logarítmicas eficazes contra o patógeno-alvo estudado e a microbiota deteriorante. Alterações instrumentais (p<0.05) em alguns dos atributos de qualidade avaliados puderam ser destacadas principalmente sinerese, oxidação lipídica e textura; porém são necessários estudos mais amplos de análise sensorial. Adicionalmente, dados apresentados demonstraram que os consumidores não foram capazes de diferir o produto low-sodium processado por alta pressão isostática (600MPa/180sec/25°C) de um não pressurizado; de fato, apesar dos efeitos instrumentais significativos, estas alterações parecem não ser identificadas pelos consumidores. A adição de uma barreira natural complementar, o carvacrol, em níveis sensorialmente aceitáveis, foi capaz de potencializar os efeitos de inativação pós-processo (reduções logarítimicas) dos grupos microbianos alvo; efeitos benéficos combinados ao longo da estocagem refrigerada do produto também foram evidenciados por meio de reduzidas taxas de crescimento e fase lag aumentada, maximizando assim o potencial de conservação. A utilização combinada de HPP e carvacrol representou uma alternativa promissora contra fenômenos de injúrias sub-letais e recuperação celular. Sugere-se que a intensidade do processo HPP (em termos de carga de pressão, tempo de processo e temperatura) necessária para inativar microrganismos em níveis requeridos, possa ser reduzida na presença de barreiras antimicrobianas adicionais, garantindo a qualidade total do produto processado em condições mais amenas. Em adição, uma série de vantagens industriais podem ser destacadas tais como a redução de custos para a instalação de equipamento inicial e de manutenção (equipamentos operando em cargas mais baixas); e maximização da produção de processamento por ciclos efetivamente encurtados (ciclos de produtividade mais elevados por hora) / Abstract: The reduction of sodium chloride in processed food formulations represents a great challenge for modern industry, considering the relationship established between high sodium intake and the occurrence of arterial hypertension, the major risk factor associated with the occurrence of cardiovascular diseases and strokes. In meat products, in addition to acting on sensory quality and texture, salt plays a key role on the microbiological stability. A simple reduction can result in unstable products during their shelf-life. Therefore, for the success of salt reduction strategies implemented safely, it is necessary the application of complementary technologies or alternative preservatives. Non-thermal emerging technologies for microbial inactivation, such as High Pressure Processing (HPP), appear as feasible alternative for this purpose, eliminating the dependence of chemical preservatives considering the reduction of salt barrier. The addition of natural antimicrobial agents as additional hurdles (Multi Hurdle Technology) to the HPP, aiming to enhance the preservative effects, has been identified as a promising trend in modern literature. Given this exposed, after determination of low-sodium working formulation, this research aimed adjust the processing variables "pressure load" and "dwell time" (using low-processing temperatures of 25°C) for sliced vacuum-packaged ready-to-eat turkey breast. Post-processing microbial inactivation responses were evaluated (by logarithmic reductions) against inoculated populations of the target pathogen Listeria monocytogenes and spoilage lactic acid bacteria including Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus sakei; were also evaluated quality-attributes including color, water activity, pH, syneresis, texture and lipid oxidation. In addition, in order to use multiple barriers for preservation technology, was studied the effect of adding bioactive component, carvacrol at concentrations of 200ppm in the product formulation. Employing a simple reduction strategy, without adding salt substitutes, after evaluation of physicochemical aspects, sensory and microbiological, it was concluded that levels of 30% NaCl reduction (aproximatelly 25% less sodium) on the control made with 20g/kg, are viable; however, problems with microbiological stability were evidenced. After evaluation of different pressure ranges and processing time, following the performance criteria required for post-inactivation process Listeria monocytogenes (4-5 log reduction), a value of 600MPa/180 seconds at 25°C was presented with an adequate treatment for studied product with low sodium content, promoting effective logarithmic reductions against the studied target pathogen and spoilage LAB. Instrumental changes (p<0.05) in some of the evaluated quality attributes could be revealed mainly in syneresis, lipid oxidation and texture; however, a sensory confirmation needs to be established. Additionally, data presented showed that consumers have not been able to differ low-sodium products processed by HPP (600MPa/180sec/25°C) and unpressurised; in fact, despite significant instrumental effects, these changes seems to be not identified by consumers. The addition of natural barrier, such as carvacrol at acceptable sensory levels (200ppm), was able to potentiate the effects of post-process inactivation (logarithmic reductions) of the target microbial groups; combined benefit effects along the refrigerated product storage were also evidenced by reduced growth rates and increased lag phases, thus maximizing their potential for conservation. The combination of HPP and carvacrol represented a promising weapon against phenomena of sub-lethal injuries and cell recovery. It is suggested that the intensity of the HPP process (in terms of pressure load, process time and temperature) required to inactivate microorganisms in required levels, may be reduced in the presence of additional microbial barriers, ensuring the overall quality of the processed product under mild processing conditions. In addition, a number of industrial advantages can be highlighted such as reduced costs for the initial installation and maintenance equipment (low required pressure loads) and maximization of production by effectively processing cycles shortened (higher productivity cycles per hour) / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutor em Tecnologia de Alimentos