Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1998. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2000. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juillet 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2000. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

L'enzyme UGT2B7 est un membre de la superfamille des UDP-glucuronosyltransférases (UGT), impliquée dans la glucuronidation. Cette réaction de conjugaison de l'acide glucuronique permet l'inactivation et l'élimination de certains composés alimentaires, polluants environnementaux, substances endogènes ainsi que d'environ 35% des médicaments présentement sur le marché. L'activité enzymatique de cette voie métabolique est sujette à une importante variabilité interindividuelle qui, dans le cas d'UGT2B7, n'est pas expliquée par la présence de polymorphismes génétiques. De nouvelles évidences suggèrent que l'épissage alternatif est un mécanisme qui pourrait contribuer à cette variabilité interindividuelle via la formation de nouveaux transcrits d'ARN messagers et de peptides pouvant avoir des rôles opposés, une fonction régulatrice ou encore une distribution tissulaire différentielle dans le cas des UGT. L'objectif de mon projet de recherche était de caractériser l'épissage alternatif du gène UGT2B7 humain avec l'objectif futur d'établir si ce phénomène est à l'origine de la variabilité de cette voie métabolique.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2014-2015 / La réaction de glucuronidation prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases est une voie majeure du système de détoxification cellulaire qui influence la biodisponibilité de molécules endogènes et exogènes. Notre laboratoire a récemment découvert l’existence de nouvelles protéines UGT nommées i2 dérivées de l’épissage alternatif du gène UGT1A. Ces protéines sont dépourvues d’activité transférase. Nous avons démontré par immunohistochimie que les enzymes i1 et les protéines alternatives i2 sont coexprimées dans plusieurs tissus du tractus gastro-intestinal, ainsi que dans les mêmes types cellulaires de ces tissus. Les i2 sont localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) avec les i1, mais sont également présentes dans le cytosol. Étant donné la proximité physique des i1 et i2 au RE, nous avons généré des modèles cellulaires surexprimant différentes combinaisons d’enzymes i1 et de protéines i2. Nos données démontrent que la coexpression de ces deux types de protéines diminue l’activité de glucuronidation de 20 à 80 % dépendamment du substrat et de l’enzyme testés. Par co-immunoprécipitation, nous avons démontré que cette répression survient via l’interaction physique des i1 avec les i2. À l’inverse, l’augmentation de l’activité de glucuronidation suite à la répression des formes i2 endogènes a permis de confirmer ce rôle de modulateur négatif des i2. Il semble aussi que les i2 soient en mesure de moduler significativement l’activité UGT même lorsque leur niveau d’expression est inférieur à celui des i1, tel que retrouvé dans plusieurs tissus humains. Nos données supportent également l’influence de ces protéines alternatives sur la réponse pharmacologique. En effet, la répression de l’expression des i2 endogènes dans une lignée de cancer de côlon entraîne un avantage de survie sous traitement chimiothérapeutique. Enfin, l’identification de l’interactome tissulaire des isoformes des UGT1A démontre qu’elles ont le potentiel d’interagir avec des enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique et la migration cellulaire. Nos données supportent que les i2 ont même la capacité de modifier le potentiel migratoire de cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les i2 ont la capacité de moduler le stress oxydatif cellulaire, entre autres via l’interaction avec des protéines antioxydantes, telle la catalase. En conclusion, nos résultats démontrent que les protéines alternatives i2 auraient le potentiel de moduler le système de défense cellulaire à plusieurs niveaux, en plus d’influencer la réponse aux médicaments. / The glucuronidation reaction mediated by the UDP-glucuronosyltransferases (UGT) enzymes is a major pathway of cellular detoxification system and has a clear effect on xenobiotic and endobiotic bioavailability. We have recently discovered nine new UGT proteins, named i2, which are derived from UGT1A alternative splicing. Those proteins are devoid of transferase activity. Using immunohistochemistry, we have demonstrated that i1 enzymes and i2 alternative proteins are coexpressed in multiple tissues of the gastrointestinal tract and also in the same cell types. Alternative i2 are localized in the endoplasmic reticulum (ER) membrane along with i1, but are also detected in the cytosol. Given the physical proximity of i1 and i2 at the ER, we have generated cellular models overexpressing different combinations of enzymes and i2 alternative proteins. Our data revealed that coexpression of those two types of proteins leads to a decrease of 20 – 80 % of the glucuronidation activity depending on the substrate and enzyme tested. By co-immunoprecipitation experiments, we have demonstrated that this modulation occurs via the physical interaction of i1 and i2. We have confirmed the negative modulator function of i2 alternative proteins by RNA interference. Our results demonstrates that repression of endogenous i2 leads to a significant increase of cellular glucuronidation activity. Data also support the importance of expression ratio of i2 :i1. Indeed, even an expression of i2 below the level of i1, as found in several tissues, consistently resulted in a significant modulation of UGT activity. Our data also support the role of i2 alternative proteins on pharmacological response. Repression of endogenous i2 in a colon cancer cell line leads to an increased cell viability under chemotherapeutic treatment. Furthermore, identification of UGT1A endogenous interactome reveals their capacity to physically interact with protein implicated in energy metabolism and cell migration. Our data support that i2 alternative proteins have the capacity to modulate migration potential of cancer cells. We have also demonstrated that i2 alternative proteins are able to modulate cellular oxidative stress, in part via protein-protein interaction with anti-oxidant proteins, such as catalase. In conclusion, our results demontrate that i2 alternative proteins have the potential to modulate the cellular defense system at multiple levels in addition to influence pharmacological response.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / L'une des principales voies du métabolisme des médicaments est prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT). Nos récentes découvertes ont mis à jour l'existence de nouvelles protéines nommées isoformes 2 (i2) produites par épissage alternatif du gène UGT1A humain. Ces produits d'épissage ne possèdent pas d'activité enzymatique mais démontrent une distribution tissulaire similaire à celles des isoformes 1 actives. Les enzymes i 1 et les nouvelles formes i2 sont présentes notamment au foie, dans le tractus digestif et le rein et leur localisation subcellulaire est similaire. Par immunohistochimie, nous avons également pu observer leur présence dans les tissus tumoraux. Basé sur les profils d'expression tissulaire, nous avons démontré un impact significatif de l'expression hétérologue stable d'i2 sur la conjugaison de divers médicaments, en présence d'il. Nous avons établi diverses lignées cellulaires surexprimant différentes combinaisons d'il et i2. Une réduction significative de 20 à 82% de la production de metabolites glucuronides est observée en essais enzymatiques pour plusieurs substrats dont l'agent anticancéreux SN-38 et de l'immunosuppresseur MPA. Les expériences de co-immunoprécipitation supportent que cette répression survient via l'interaction directe des protéines il et i2 dans la membrane du reticulum endoplasmique, formant ainsi des complexes inactifs. La fonction répressive d'i2 sur l'activité UGT a en parallèle été validée par des expérimentations en cellules intactes visant la répression des isoformes i2 endogènes par interférence à l'ARN qui entraînaient pour leur part une augmentation significative de l'activité de glucuronidation. Ce phénomène pourrait donc avoir une importance physiologique et pharmacologique significative, alors que l'abondance relative des formes il et i2 interagissant sous la forme de complexes actifs (il-il) et inactifs il-i2) serait déterminante de l'activité de glucuronidation cellulaire. Nous avons également identifié la présence de sept nouvelles isoformes d'UGT2B4 qui sont inactives. Toutefois, la co-expression de trois d'entre elles avec la forme active classique d'UGT2B4 (il) provoque une diminution de l'activité de conjugaison. En conclusion, nos résultats démontrent que des événements d'épissage alternatif des gènes UGT humains influencent la voie de glucuronidation suggérant un mécanisme d'auto-régulation, et par conséquent pourraient modifier la susceptibilité et la réponse au traitement de plusieurs pathologies telles que le cancer.

L’épissage alternatif en 3’ du gène UGT1A entraîne la production d’enzymes actives, les isoformes 1 (i1), et de protéines tronquées, les isoformes 2 (i2), qui ne possèdent pas de domaine transmembranaire (TMD) et d’activité de glucuronidation, mais plutôt des propriétés modulatrices sur l’activité enzymatique des i1 via des interactions protéiques. Nous croyons que les interactions i1-i2 impliquent plusieurs domaines d’interactions et qu’ils sont différents de ceux impliqués dans l’homo-oligomérisation des i1. Des expériences de co-immunoprécipitation démontrent que les isoformes i1 dépourvues du signal peptide +/- le TMD empêchent l’homo-oligomérisation sans affecter l’interaction i1-i2. De plus, la présence de complexes de hauts poids moléculaires observée par immunobuvardages en conditions non-réductrices démontre l’implication potentielle de ponts disulfures dans la formation des complexes i1-i2, et ce via plusieurs résidus cystéines. En somme, les résultats obtenus supportent que l’interaction i1-i2 implique plusieurs domaines protéiques et qu’ils diffèrent de ceux impliqués dans les complexes i1-i1. / Alternative splicing of UDP-glucuronosyltranferase UGT1A gene results in the production of enzyme, isoforms i1 and i2. Unlike the active i1 proteins, i2 are truncated proteins which lack the transmembrane domain and glucuronic acid transferase activity, but have an inhibitory effect on UGT1A activity likely through the formation of hetero-oligomers with i1. We believe that i1-i2 interaction involves binding of more than one domain. Our results showed that i1, in the presence or absence of the transmembrane domain, without the signal peptide did not self-interact but instead interacted with i2. In addition, high molecular weight complexes were observed by immunoblotting under non-reducing conditions. It demonstrates the involvement of disulfide bonds in the formation of i1-i2 complexes. In summary, these results support that i1-i2 interactions involve multiple protein domains and they differ from those involved in homo-oligomerization of i1.

TAF6 est un co-facteur de transcription qui fait partie du complexe multiprotéique, TFIID. TAF6 possède 4 isoformes et deux d'entre eux ont des fonctions opposées. TAF6[alpha] est l'isoforme anti-apoptotique et peut dimériser avec TAF9, tandis que TAF6[delta] est l'isoforme pro-apoptotique et ne peut pas dimériser avec TAF9. TAF6[delta] induit l'apoptose indépendamment de p53. Cette nouvelle voie apoptotique présente un intérêt certain et l'étude de la régulation de l'épissage alternatif de TAF6[delta] est essentielle pour comprendre le mécanisme par lequel TAF6[delta] induit l'apoptose. Nous avons donc développé un minigène de TAF6 qui récapitule le patron d'épissage endogène. Nous avons muté le minigène TAF6 afin d'identifier des éléments sur l'ARN controllants son épissage. Ces éléments ont été retrouvés surtout au niveau de l'exon 2 et de l'intron entre l'exon 2 et l'exon 3. Trois sites activateurs d'épissage ont été déterminés dans l'exon 2. De plus, nous avons démontré la présence d'une structure secondaire importante dans le choix du site 5' d'épissage. Nous avons aussi établi que la distance de 30 nucléotides entre les deux sites 5' d'épissage avait un rôle à jouer dans le choix de ce site d'épissage. Un dernier site activateur a été positionné dans l'intron. D'après ces résultats de mutations et un criblage PCR d'ADNc de cellules transfectées par des siRNAs contre des protéines de liaison à l'ARN, nous avons identifié hnRNP K comme facteur trans potentiel régulant l'épissage de TAF6. Les facteurs trans liants les éléments cis permettent de réguler en partie l'épissage alternatif d'un ARN pré-messager. Des expériences d'immunoprécipitation in vivo nous ont permis d'établir qu'il existe une interaction entre l'ARN de TAF6 et hnRNP K. Le signal extracellulaire qui agit sur les éléments cis et permet de changer l'épissage alternatif de TAF6 est encore inconnu. Nous avons tenté de le déterminer, mais, pour l'instant, nos hypothèses n'ont pas été confirmées par les expériences menées. L'apoptose, si elle est dérégulée, peut mener à des pathologies. L'expression de TAF6 et l'inclusion d'éléments répétitifs Alus dans son ARN messager ont été démontrés comme étant augmentées dans les cellules tumorales du sein. Nous avons aussi commencé l'étude de l'importance de ces éléments répétitifs dans l'augmentation de l'expression de TAF6 dans les cancers. Nous avons identifié une mutation ponctuelle au niveau de la deuxième séquence répétitive Alu qui peut être retrouvée dans TAF6, mais nous ne connaissons pas encore sa fonction dans la surexpression de TAF6 dans les cancers du sein. Bref, ce mémoire présente les différents résultats obtenus dans le cadre d'expériences dont le but était d'identifier les éléments cis, les facteurs trans, le signal déclenchant l'épissage et le rôle des éléments répétitifs Alus présents dans l'ARN de TAF6.