Los fotorreceptores (FRs) son las neuronas que capturan la luz en el ojo, por lo que juegan un rol central en la visión. La pérdida progresiva de estas células durante ciertas enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la retinitis pigmentosa o la degeneración macular, conduce a déficits de la visión y eventualmente a la ceguera. Estas patologías, así como otras que afectan al sistema nervioso central, están caracterizadas por la degeneración gradual, selectiva e irreversible de una población neuronal específica. La deficiencia de factores tróficos ha sido involucrada en muchos de estos procesos neurodegenerativos y es característica de la denominada muerte celular programada, tal como la que ocurre al momento de la sinaptogénesis en el desarrollo del sistema nervioso. En efecto, en la retina, así como también en otras partes del sistema nervioso, las neuronas requieren para su supervivencia, de factores tróficos, los cuales provienen de su entorno. El requerimiento de factores tróficos varía según el tipo celular y la etapa del desarrollo. En particular, para los FRs ya se han identificado varios de ellos, incluyendo el Factor Neurotrófico Derivado de la Glía (GDNF), el Factor Neutrófico Ciliar (CNTF), el Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), el ácido docosahexaenoico (DHA), la esfingosina 1-fosfato (S1P) y, más recientemente, uno de los principales, el Factor Derivado del Epitelio Pigmentario (PEDF), una proteína con funciones neurotróficas y antiangiogénicas, asociadas a dominios separados de la proteína. La identificación de las secuencias de estos dominios ha permitido diseñar y sintetizar químicamente péptidos estables, como los fragmentos neurotróficos 44-mer y 17-mer, que conservan las propiedades de la proteína nativa y, por ende, de potencial valor médico. Sin embargo, estas características ventajosas requieren ser evaluadas en un modelo experimental adecuado. La mayoría del conocimiento actual sobre el PEDF se ha obtenido gracias a modelos in vivo, donde, debido su inherente complejidad, sumado a la cantidad de interacciones que ocurren entre las células y moléculas de tejidos circundantes, resulta difícil analizar los procesos involucrados. Una alternativa a este obstáculo son los cultivos primarios elegidos para realizar esta tesis, compuestos solo de neuronas amacrinas y FRs, las que, creciendo en medios químicamente definidos, permiten estudiarlas en un entorno mucho más controlado que en el organismo entero. En estos cultivos, los FRs se desarrollan independientemente, sin requerir la suplementación de factores tróficos, pero, una vez establecidas sus conexiones sinápticas, se tornan dependientes de los mismos para continuar con su desarrollo y prolongar supervivencia. La dependencia por estos factores hace de este sistema in vitro un modelo adecuado para evaluar el efecto de distintas moléculas sobre la supervivencia o diferenciación celular. Por ello, los resultados reseñados en el primer capítulo de esta tesis tuvieron como objetivo principal evaluar el efecto de PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico y angiogénico en este modelo de cultivo primario de neuronas de retina. En estos cultivos, tanto los FRs como las neuronas amacrinas exhibieron el receptor de PEDF (PEDF-R), el cual es una fosfolipasa del tipo A2, localizado principalmente en la membrana celular. Por otro lado, la expresión del transcripto para PEDF-R mostró un patrón decreciente durante los primeros 5 días de cultivo, así como también en la retina in vivo, en el mismo periodo de desarrollo. Este patrón se observó también a nivel de la proteína, aunque su descenso en el tiempo fue más atenuado. Tanto el PEDF como los dos péptidos derivados de su dominio neurotrófico, protegieron a los FRs en cultivo de la muerte celular, caracterizada por ensayos de TUNEL y Anexina V. Además, previnieron la pérdida de la función mitocondrial evaluada mediante Mitotracker, y preservaron la integridad estructural de la membrana plasmática, analizada indirectamente por medio de ioduro de propidio y DAPI; dado que estos marcadores se visualizan una vez que se altera la permeabilidad de la membrana plasmática. Esta protección se debió principalmente a la interacción de PEDF con PEDF-R, y, en parte, al aumento constatado en la transcripción de factores antiapoptóticos como Bcl2 y Bcl2a1. El efecto del PEDF fue específico para la supervivencia de los FRs dado que el mismo no alteró la viabilidad de las neuronas amacrinas, la cual se mantuvo constante durante los días de cultivo analizados. Por el contrario, el PEDF y los péptidos 44-mer y 17-mer promovieron el desarrollo de neuritas en las neuronas amacrinas, e indujeron la diferenciación de los FRs, al promover la polarización de la rodopsina hacia el extremo apical de estas neuronas, tal como ocurre en los FRs maduros de la retina in vivo. Estos efectos fueron anulados eficientemente mediante el secuestro de PEDF o de sus péptidos por medio del péptido bloqueante P1, o por la inhibición de la actividad enzimática del PEDF-R mediante el inhibidor enzimático selectivo atglistatin. Todos los efectos del PEDF y sus péptidos neurotróficos fueron asociados a la interacción de los mismos con el PEDF-R. Por su parte, el fragmento derivado del dominio antiangiogénico del PEDF no tuvo ningún efecto. Por otro lado, también se indagó sobre el potencial del epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivado de células madre pluripotentes (CMP) en la producción y liberación del PEDF. Dado que la deficiencia del PEDF ha sido correlacionada con una mayor incidencia de ciertas retinopatías y el hecho que el EPR puede estar comprometido en algunas de estas patologías, ha impulsado el desarrollo de estrategias orientadas a reemplazar el EPR dañado. Entre ellas se destaca la estrategia de generar EPR por medio de CMP obtenidas a partir de la inducción de células somáticas mediante la transducción de factores de pluripotencia por medio de un sistema episomal. Este tipo de estrategia requiere sortear múltiples obstáculos antes de ser viable, particularmente el de garantizar la identidad del nuevo EPR. El objetivo de esta línea de investigación, descripta en el segundo capítulo de esta tesis, fue evaluar los aspectos funcionales del EPR derivado de células madre, comparándolos con los del EPR nativo. El EPR derivado de CMP humanas recapituló las características distintivas del EPR nativo, como la polarización baso-apical, la capacidad de fagocitar y metabolizar segmentos externos de FRs y la producción de PEDF. Todas estas características se mantuvieron aun hasta 50 días después de su inducción, con la producción de PEDF incrementándose significativamente en función del tiempo. En conclusión, el PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico ejercieron efectos citoprotectores y de diferenciación sobre los fotorreceptores y promovieron el crecimiento de neuritas en las neuronas amacrinas. Todos estos efectos fueron dependientes de la interacción entre PEDF y PEDF- R. Por otro lado, el EPR derivado de CMP examinado en este trabajo de tesis mostró un comportamiento similar al del EPR en la retina intacta, lo que permite considerar sus posibles capacidades terapéuticas para estas enfermedades / Photoreceptors (PHRs) are the retinal neurons, which react to light, making them a central component in the visual process. Their loss during certain retinal neurodegenerative diseases, such as retinitis pigmentosa or age-related macular degeneration, leads to a gradual decline of vision and ultimately to blindness. These pathologies, as well as others that target the central nervous system, are characterized by the gradual, selective and irreversible degeneration of specific neuronal cell types. The lack of trophic factors has been involved in many of these neurodegenerative processes and it is characteristic of the so- called programmed cell death, such as the one that occurs during the period of synaptogenesis within the developing nervous system. In the retina, just as any other portions of the nervous system, neurons are dependent on trophic factors, which are produced by their environment. Trophic factor requirements vary according to each cell type and its developmental stage. For the PHRs, many trophic factors have been already identified, including the Glial cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), Fibroblastic Growth Factor (FGF), docosahexaenoic acid (DHA), sphingosine-1-phosphate (S1P) and, perhaps one of the most important among them, the Pigment Epitheliumderived Factor (PEDF). PEDF is a protein exhibiting both neurotrophic and antiangiogenic properties, which are conferred by two spatially-separated domains of the PEDF polypeptide. The identification of the sequences of these domains has allowed for the design and chemical synthesis of stable peptides, such as the neurotrophic fragments 44-mer and 17-mer, which could potentially retain the neurotrophic properties of the native protein, and therefore having a potential therapeutic value. However, these advantages should be first evaluated on an adequate experimental model. Up to now, most of our knowledge regarding PEDF has been obtained through in vivo models, which, due to their inherent complexity and the multiplicity of interactions between cells and their surrounding tissues, makes it difficult to analyze the specific processes occurring at a smaller scale. An alternative to overcome these limitations is the use of primary cultures chosen for the present thesis, composed solely of PHRs and amacrine neurons cultured in a chemically defined medium. These cultures allow the study of these neurons in a much more controlled environment when compared to a whole organism. PHRs in these cultures, initially develop and replicate without requiring trophic factor supplementation, but once they establish their synaptic connections, become reliant on them for their survival. This reliance makes this in vitro system an adequate testbed to evaluate the effects of different trophic factors on cell survival and differentiation. Therefore, the results of the first part of the thesis, which are shown in the first chapter, have the main objective of evaluating the effects of PEDF and peptides derived from its neurotrophic and antiangiogenic domains in a primary retinal cell culture-based model. In these cultures, both neuronal types exhibited the PEDF receptor (PEDF-R), which was primarily localized in the cell membrane. Additionally, the expression patterns for the PEDF-R transcript showed a decreasing trend on the first 5 days in culture, which was also observed in the in vivo environment. This pattern was also observed at the protein level, albeit in a less dramatic fashion. PEDF as well as its neurotrophic domain-derived peptides protected cultured PHRs from cell death, which was measured by TUNEL and Annexin V assays. Furthermore, they also prevented the loss of mitochondrial function, as evaluated by Mitotracker, and preserved the structural integrity of the plasma membrane analyzed by propidium iodide and DAPI staining, given that these markers are visualized once the plasma membrane permeability is altered. This protection was exerted through PEDF/PEDF-R interaction, along with the upregulation of antiapoptotic factors such as Bcl2 and Bcl2a1. This protective effect was PHR-specific, given that there was no significant difference in the survival rate of amacrine neurons, which was constant throughout the observed timeframe. Furthermore, PEDF and the 44-mer and 17-mer peptides promoted neurite outgrowth in amacrine neurons and induced PHR differentiation by promoting apical rhodopsin polarization, mimicking the same process in the retina in vivo. These effects were readily annulled either by sequestering PEDF or its derived neurotrophic peptides with the blocking P1 peptide, or by inhibiting the enzymatic activity of PEDF-R with the selective enzymatic inhibitor atglistatin. Every previously observed effect, exerted by PEDF or its neurotrophic peptides, was linked to their interaction with PEDF-R. The antiangiogenic domain-derived peptide showed no effects whatsoever. In a second line of research carried out in this thesis and described in the second chapter of this thesis, I delved on the potential PEDF production and secretion of induced pluripotent cell-derived retinal pigmented epithelium (RPE). Due to the fact that PEDF deficit has been correlated with an increased incidence of retinopathies, coupled with the observation that the pigmented epithelium itself is compromised in several of them; has led to the emergence of novel therapeutic strategies based on replacing the damaged retinal pigmented epithelium. One of the main approaches relies on generating RPE by the differentiation of induced pluripotent stem cells, obtained by the transduction of pluripotency factors in somatic cells by means of an episomal system. This approach must clear several hurdles before becoming viable, starting with confirming the identity and properties of this new RPE and how it compares to native RPE. The stem cell-derived human RPE was able to replicate the main hallmarks of native RPE, such as basalapical polarization, the capacity to phagocyte and metabolize PHR outer segments and to secrete PEDF. All these features were consistent even at 50 days post-induction, with PEDF secretion showing a significant increase over time. In conclusion, PEDF and its neurotrophic peptides exerted cytoprotective effects and stimulated neuronal development on photoreceptors and promoted neurite outgrowth amacrine neurons. All of these effects were driven by PEDF/PEDF-R interaction. Furthermore, stem cell-derived RPE showed a similar behavior to native RPE, allowing this approach of RPE replacement to be further considered as another potential therapeutic approach for the treatment of these diseases.

La cianotoxina β-N-metil-amino-L-alanina (BMAA) es un aminoácido no proteico producido por cianobacterias, capaz de biomagnificarse en las cadenas tróficas de ecosistemas marinos y terrestres. Dada su capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica, su ingesta progresiva se asocia con el desarrollo de ciertas retinopatías, así como también de enfermedades neurodegenerativas, tales como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), la Enfermedad de Parkinson (EP) y la Enfermedad de Alzheimer (EA). Los daños causados por la BMAA son múltiples y originados en mecanismos diversos. Así, la BMAA, en presencia de iones bicarbonato (HCO3 - ), puede formar un compuesto denominado carbamato, cuya estructura química es similar al glutamato (Glut), uno de los neurotransmisores más importantes del sistema nervioso. A su vez, el carbamato se une y activa receptores de Glut, ya sean ionotrópicos (como el receptor de N-metil-D- aspartato) o metabotrópicos. La sobreexcitación de estos receptores ocasionada por la BMAA, promueve mecanismos de excitotoxicidad que conducen a alteraciones neuronales. Por otro lado, la BMAA puede ingresar a las células a través del sistema xc, un sistema de transporte sodio-independiente común para cistina y Glut. Una vez en el interior celular, la toxina puede incorporarse erróneamente en las cadenas polipeptídicas en reemplazo de Serina (Ser). Así, unida a componentes proteicos, puede generar un reservorio endógeno de lenta liberación que expone a las neuronas a una baja pero continua dosis de esta toxina. Entre sus varios efectos subcelulares, la BMAA puede afectar la permeabilidad de las membranas mitocondriales comprometiendo su actividad. Además, puede inducir modificaciones en los niveles de Ca 2+, generar estrés oxidativo, promover fallas en la producción de ATP e inducir estrés en el retículo endoplasmático, lo cual conduce a alteraciones en la síntesis y/o distribución de proteínas. Asociado a esto, se originan alteraciones en el transporte axonal y la fragmentación de estas estructuras. Pese a su trascendencia para la salud, aún son desconocidos los efectos directos que genera la exposición a la BMAA de las neuronas y células gliales de la retina (como las células gliales de Müller –CGM-), o del epitelio pigmentario de la retina (EPR). Además, todavía son mayormente desconocidos aquellos factores o moléculas capaces de modular las vías de señalización involucradas en los efectos deletéreos inducidos por la BMAA. Al respecto, recientemente se ha propuesto que la activación de los receptores X retinoides (RXR) protegerían a las neuronas y modularían la respuesta inflamatoria durante las enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central, y también en retinopatías. Aún se desconoce si estos receptores ejercen un rol protector contra los daños inducidos por la BMAA. En esta Tesis se estudiaron los mecanismos involucrados en los cambios degenerativos inducidos por la BMAA en células de la retina, así como también en células PC12 diferenciadas a neuronas. Asimismo, se evaluó el valor protector de agonistas de los RXRs frente a los efectos deletéreos inducidos por la BMAA en células de la retina. Para estos estudios, se obtuvieron cultivos puros de neuronas amacrinas y fotorreceptores (FRs), de CGM puros, y cultivos neuro-gliales a partir de retinas de ratas neonatas. Además, se utilizaron cultivos de líneas celulares PC12 y epiteliales ARPE- 19. Todos los cuales fueron tratados con la BMAA para evaluar sus efectos sobre estas células y el posible rol protector de los RXRs. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que aún bajas concentraciones de la BMAA (de 0,4 μM) alteraron la viabilidad no sólo de las neuronas amacrinas y FRs, sino también de las células PC12 diferenciadas a neuronas, de las CGM e incluso de las células del EPR. La BMAA también, indujo alteraciones en la permeabilidad mitocondrial y en la producción de ROS en las células neuronales, gliales y epiteliales, mientras que en las CGM indujo cambios en la morfología nuclear. Por su parte, en neuronas amacrinas, promovió el crecimiento axonal, aunque generando el colapso de sus conos de crecimiento. Estas alteraciones fueron mediadas por la activación de los receptores NMDA en presencia de iones HCO3 - . Además, en estas células, la BMAA se incorporaría erróneamente en las cadenas polipeptídicas en reemplazo de la Ser, dado que la suplementación del medio de cultivo con este aminoácido previno la toxicidad inducida por la BMAA. En cuanto a la acción protectora de los RXRs, nuestros resultados demostraron que su activación bloqueó los efectos tóxicos que produjo la BMAA sobre las neuronas amacrinas y los FRs, así como también sobre las células del EPR. En resumen, en esta Tesis presentamos evidencias de que la BMAA afecta múltiples estructuras subcelulares en las células que conforman la retina, así como también a células PC12 diferenciadas. Estos resultados sugieren que los daños inducidos por la BMAA representan un potencial riesgo para la salud, y podrían contribuir al desarrollo de retinopatías, así como de varias enfermedades neurodegenerativas. Además, este trabajo indicaría que la activación de los RXRs puede presentar un papel protector al ejercer un rol relevante en la supervivencia de las neuronas amacrinas y FRs, así como también de las células del EPR. En su conjunto, estos hallazgos aportan nuevos conocimientos en relación a los mecanismos deletéreos inducidos por la BMAA y podrían ser de utilidad para el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. / The cyanotoxin β–N-methylamino-L-alanine (BMAA) is a non-proteinogenic amino acid produced by cyanobacteria. It is biomagnified along the food chains in both, marine and terrestrial ecosystems. Due to its ability to cross the brain blood barrier, its ingestion may contribute to the onset of retinopathies, as well as neurodegenerative diseases, like Amyotrophic Lateral Sclerosis, Parkinson (PD) and Alzheimer disease (AD). Damages induced by BMAA are multiple and originated by different mechanisms. In the presence of bicarbonate ions (HCO3 - ), BMAA can produce carbamate, whose chemical structure is similar to that of glutamate (Glut), one of the most important neurotransmitters in the nervous system. In turn, carbamate can bind and activate both ionotropic (like N-Methyl-D-aspartate -NMDA-) and metabotropic Glut receptors. Overactivation of these receptors by BMAA promotes excitotoxicity, which leads to nuclear alterations. On the other hand, BMAA crosses the cell membranes by using the cystine/glutamate antiporter (xc- system), a sodium-independent amino acid transporter. Once inside the cells, the toxin can mistakenly replace the amino acid Serine (Ser) in polypeptide chains, thus generating an endogenous reservoir of BMAA, whose slow- release exposes neurons to a low, but continuous amount of this toxin. Among its various subcellular effects, BMAA can alter mitochondrial membrane permeability compromising mitochondrial activity. Besides, it can alter Ca2+ levels, generate oxidative stress, promote failures in the ATP production and induce endoplasmic reticulum (RE) stress, leading to alterations in the protein synthesis and/or distribution. In this context, BMAA promotes alterations in axonal transport along with fragmentation of these structures. Despite its importance to health, the direct effects of BMAA exposure on retinal neurons and glial cells (such as Müller glial cells –CGM-), or retinal pigment epithelium (RPE) cells, are virtually unknown and the factors or molecules, which could modulate the signaling pathways involved in the deleterious effects induced by BMAA have not been established. In this regard, it has recently been proposed that the activation of Retinoid X Receptors (RXR) can protect neurons and modulate the inflammatory responses during neurodegenerative diseases of the central nervous system, including retinopathies. However, the possible protective roles of RXRs in BMAA-induced damages are still unknown. In this Thesis, we have studied the mechanisms involved in the degenerative changes induced by BMAA into retinal cells, and in neuron-like, differentiated rat pheochromocytoma cells (PC12 cells), as well. We also evaluated the protection of RXR agonists against the deleterious effects of BMAA in retinal cells. For these purposes, we obtained pure neuronal cultures of amacrine neurons and photoreceptors (PHRs); pure MGC cultures, and mixed neuro-glial cultures from newborn rats. In addition, we used PC12 cells and ARPE-19 epithelial cell lines. We treated them with BMAA to evaluate its effects on these cells and the possible protective roles of RXRs. Our results showed that low concentrations of BMAA (0.4 μM) altered, not only the viability of amacrine neurons and PHRs, but also that of neuronally differentiated PC12 cells, MGC and even that of the RPE cells. Also, the cyanotoxin induced alterations in mitochondrial membrane permeability and in ROS production, while in MGC, BMAA induced changes in the nuclear morphology. On the other hand, in amacrine neurons, this toxin promoted axonal growth, although simultaneously generating the collapse of their growth cones. We established that all these alterations were induced by activation of NMDA receptors in the presence of HCO3 - ions. Besides, in all these cell types, BMAA appeared to incorporate into polypeptide chains replacing Ser, since supplementation of the culture media with this amino acid prevented toxicity damages. Regarding the protective roles of RXRs, our results showed that their activation blocked the toxic effects induced by BMAA in amacrine neurons, PHRs, and RPE cells. In summary, in this Thesis we present evidences that BMAA affected multiple subcellular structures in retina cells and in PC12 cells differentiated into neurons. These results suggest that the damaging effects induced by BMAA represent a potential health risk, which could contribute to the development of retinopathies, along with other neurodegenerative diseases. In addition, this work would indicate that RXR activation can promote survival of amacrine PHRs and RPE cells. Taken together, these findings provide new knowledge regarding the deleterious mechanisms induced by BMAA, which could be useful for the development of future effective therapies.