Objetivo: Evaluar la asociación entre los niveles elevados de transaminasemia y resistencia a la insulina en una población de individuos sin alteraciones laboratoriales previas de glicemia, insulinemia, ni tiroideos. Métodos: Realizamos un modelo lineal generalizado crudo y ajustado de la familia Poisson con una varianza robusta, para evaluar la asociación entre los niveles elevados de transaminasemia y resistencia a la insulina. Las asociaciones se presentaron como razón de prevalencia (RP) con sus respectivos intervalos de confianza al 95%. Resultados: Se incluyeron 261 participantes. La mediana de edad fue de 39 años (31-45) y el 23,7% de los participantes eran hombres. La prevalencia de transaminasas séricas elevadas para TGO y TGP fue de 13.8% y 26.1%, respectivamente. La prevalencia de resistencia a la insulina fue del 34,1%. En el análisis en bruto encontramos significancia estadística entre TGP y TGO elevados y resistencia a la insulina (RP = 3,18; IC del 95%: 2,33-4,34 y RP = 2,44; IC del 95%: 1,88 a 3,30; respectivamente). Sin embargo, en el análisis multivariado ajustado, la asociación entre el nivel elevado de transaminasas séricas y la resistencia a la insulina permaneció estadísticamente significativa con TGP, pero se perdió con TGO; un PR = 1.90; CI95%: 1.31-2.77 y un PR = 1.23; CI95%: 0,93-1,61; respectivamente. Conclusión: niveles séricos elevados de TGP se asociaron con resistencia a la insulina. TGP podría usarse en la práctica clínica como una herramienta adicional para evaluar la resistencia a la insulina en personas sin alteraciones laboratoriales previas de glicemia, insulinemia, ni tiroideos. / Aim: To evaluate the association between elevated serum transaminase levels and insulin resistance in a population of individuals without alterations in their laboratorial values of glycemia, insulinemia and thyroid panel. Methods: We performed a crude and adjusted generalized linear model of the Poisson family with robust variance, in order to evaluate the association between elevated serum transaminase levels and insulin resistance. The associations were presented as prevalence ratio (PR) with their respective 95% confidence intervals (95% CI). Results: We included 261 participants in the study. The median age was 39 years (31-45) and 23,7% of the participants were men. The prevalence of elevated serum transaminase for TGO and TGP were, 13.8% and 26.1%, respectively. The prevalence of insulin resistance was 34,1%. In the crude analysis we found statistical significance between elevated TGP and TGO and insulin resistance (PR=3,18; 95% CI: 2,33-4,34 and PR=2.44; 95% CI: 1.88-3.30; respectively). However, in the multivariate analysis adjusted for age, sex, body mass index and thyroid hormones, the association between the elevated serum transaminase level and insulin resistance remained statistically significance with TGP, but lost its significance with TGO; a PR = 1.90; CI95%: 1.31-2.77 and a PR = 1.23; CI95%: 0.93-1.61; respectively. Conclusion: Elevated serum levels of TGP were associated with insulin resistance. TGP could be used in clinical practice as an additional tool to assess insulin resistance in people without laboratorial alterations in glycemia, insulinemia and thyroid panel. / Tesis

Els peixos carnívors presenten baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats i per mantenir la glucèmia. En aquests organismes, la baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats condueix a estats d’hiperglicèmia més marcats i sostinguts que els descrits per a mamífers, després de l’administració de glucosa o la ingesta de dietes amb elevat contingut de carbohidrats. L’alanina aminotransferasa (ALT) catalitza la transaminació reversible entre L-alanina i α-cetoglutarat per formar L-glutamat i piruvat. Mitjançant la interconversió d’aquests quatre metabòlits, l’ALT esdevé un nexe d’unió entre el metabolisme d’aminoàcids i el de carbohidrats. En estudis previs del nostre grup es va descriure la presència de tres isoformes ALT en S. aurata, els isoenzims citosòlics, cALT1 i cALT2, i la isoforma mitocondrial mALT. L’expressió hepàtica de cALT2 incrementa en situacions gluconeogèniques, mentre que la de cALT1 és predominant durant el període postprandial per a l’utilització dels nutrients de la dieta. L’objectiu d’aquest treball és incrementar el coneixement del metabolisme intermediari en peixos i així permetre realitzar futures intervencions biotecnològiques amb la intenció de millorar la utilització metabòlica dels nutrients de la dieta. Per comprendre millor la funció d’mALT vam estudiar la distribució tissular, la caracterització cinètica i la regulació nutricional i hormonal de l’expressió d’mALT en S. aurata. Addicionalment, vam analitzar l’expressió tissular i la regulació hormonal dels enzims aspartat aminotransferasa mitocondrial (AST2), glutamat deshidrogenasa (GDH) i glutamina sintetasa (GlnS), relacionats tots ells amb el metabolisme d’aminoàcids. En orades alimentades, mALT, GDH i GlnS s’expressen majoritàriment a fetge, intestí i ronyó. Els nostres estudis indiquen que l’expressió de mALT, GDH, AST2 i GlnS és elevada en animals alimentats, mentre que disminueix en condicions associades amb la gluconegènesi, com ara el dejú i el tractament amb estreptozotocina (STZ). Estudis cinètics de l’activitat enzimàtica mALT indiquen que l’enzim catalitza de manera més eficient la conversió d’L-alanina a piruvat, que no pas la reacció inversa. Per conèixer el mecanisme molecular implicat en la regulació transcripcional de l’expressió d’mALT, vam aïllar el promotor mALT d’orada, i vam mostrar que HNF4α incrementa la transcipció d’mALT per unió a una caixa HRE. El dejú i l’administració d’STZ disminuïren els nivells d’HNF4α en ronyó d’S. aurata, portant a un descens en la transcripció d’mALT. Els nostres resultats suggereixen que HNF4α té un paper important en la regulació transcripcional del gen mALT en ronyó d’S. aurata. En conclusió, els nostres resultats suggereixen que mALT i cALT1, que presenten una distribució tissular i un patró d’expressió en dejú i tractament amb STZ similars, podrien cooperar per direccionar els aminoàcids de la dieta al mitocondri per destinar-los a l’obtenció d’energia. Per tant, ALT es podria utilitzar com a diana per realitzar una intervenció biotecnològica a fi de reduir la utilització de proteïnes amb finalitats energètiques i optimitzar així l’ús dels nutrients de la dieta en el cultiu de peixos. / Carnivorous fish have poor ability to use dietary carbohydrates and to control the blood glucose levels. Compared with mammals, these animals show prolonged hyperglycemia after a glucose load or when feeding on high carbohydrate diets. Alanine aminotransferase (ALT) links carbohydrate and amino acid metabolism through catalyzing the reversible transamination between L-alanine and 2-oxoglutarate to form pyruvate and L-glutamate. Our group, in previous studies showed the presence of three ALT isoforms in Sparus aurata: the cytosolic isoenzymes cALT1 and cALT2 and a mitochondrial isoform, mALT. In fish liver, increased expression of cALT2 is associated to enhanced gluconeogenesis while cALT1 is predominant during the postprandial utilization of dietary nutrients. The aim of the present study was to increase the current knowledge of fish intermediary metabolism to allow future biotechnological actions in order to improve metabolic utilization of dietary nutrients. To better understand the functional role of mALT we analysed the tissue distribution, kinetic characterization and nutritional and hormonal regulation of mALT expression in S. aurata. Furthermore, cloning and characterization of the mALT promoter was also addressed. Additionally, tissue expression and nutritional regulation of glutamate dehydrogenase (GDH), mitochondrial aspartate aminotransferase (AST2) and glutamine synthetase (GlnS), also involved in amino acid metabolism, was followed. In S. aurata under feeding conditions, mALT, GDH and GlnS are mainly expressed in liver, intestine and kidney. Our studies indicate that the expression of mALT, GDH, AST2 and GlnS is increased in fed animals, while decreased in conditions associated with gluconeogenesis, such as fasting or treatment with streptozotocin (STZ). Kinetic analysis of mALT enzyme activity indicated that this enzyme catalyses more efficiently the conversion of L-alanine to pyruvate than the reverse reaction. To understand the molecular mechanism underlying the transcriptional regulation of mALT expression, we isolated the S. aurata mALT promoter, and showed that HNF4α enhances mALT transcription through binding to an HRE box. Starvation and administration of STZ decreased HNF4α levels in the kidney of S. aurata, leading to downregulation of mALT transcription. Our results suggest that HNF4α may play an important role in the transcriptional regulation of mALT gene in kidney of S. aurata. In conclusion, our findings suggest that mALT and cALT1, which present a similar tissue distribution and pattern expression under starvation and STZ-treatment, can cooperate to redirect dietary amino acids to the mitochondria for energetic pourposes. This points to ALT as a target for a biotechnological action to spare protein and optimize the use of dietary nutrients for fish culture.

Los peces carnívoros presentan baja capacidad para utilizar carbohidratos provenientes de la dieta y controlar los niveles de glucosa en sangre. En comparación con los mamíferos, estos animales tras la ingesta de glucosa o de dietas con alto contenido en carbohidratos, muestran una hiperglucemia mas prolongada. La alanina aminotransferasa (ALT) constituye un nexo de interacción entre el metabolismo de aminoácidos y el de carbohidratos al catalizar la reacción de la transaminación reversible entre L-alanina y 2-oxoglutarato para formar piruvato y L-glutamato. Estudios previos de nuestro grupo indicaron la presencia de tres isoformas ALT en dorada (Sparus aurata): las isoenzimas citosólicas cALT1 y cALT2 y una isoforma mitocondrial, mALT. En hígado de dorada, la expresión de cALT2 incrementa en situación de gluconeogénesis mientras que cALT1 predomina durante el período postprandial para la utilización de los nutrientes de la dieta. El objetivo general del presente estudio es comprender a nivel molecular los efectos metabólicos derivados de la inhibición de ALT en peces para ayudar a establecer nuevas aplicaciones biotecnológicas orientadas a mejorar la utilización de los nutrientes de la dieta. Así, en acuicultura, identificar los efectos metabólicos asociados a la modulación de la actividad ALT constituye un punto de interés para conocer si es posible efectuar una sustitución parcial de las proteínas de la dieta por carbohidratos u otros nutrientes, a fin de reducir el coste de la producción en acuicultura y disminuir la eutrofización de las aguas del entorno. Nuestros estudios muestran que la inyección intraperitoneal de doradas con nanopartículas del complejo pCpG-siRNA-quitosán resultó adecuada para promover la expresión de un siRNA para bloquear la expresión de cALT1 en hígado de Sparus aurata. La inyección intraperitoneal de nanopartículas de pCpGsi1sh1-quitosán promovió la silenciación de cALT1 a nivel de mRNA y actividad enzimática en hígado de dorada. Por otra parte, hemos analizado la inhibición postranscripcional de la actividad ALT in vivo e in vitro con el compuesto aminooxiacetato (AOA) y analizado los cambios promovidos en metabolitos y enzimas clave en el metabolismo intermediario de carbohidratos y proteínas en hígado de Sparus aurata, tras la ingesta del AOA con dietas de diferente composición. In vitro, el AOA ejerce una inhibición dependiente de dosis sobre la actividad ALT hepática citosólica y mitocondrial. In vivo, el AOA se comportó como inhibidor de la actividad ALT citosólica hepática, pero no de la mitocondrial. Una exposición a largo plazo a AOA promovió un aumento de la actividad piruvato quinasa en el hígado de dorada, independientemente de la composición de la dieta suministrada a los peces. Los estudios de 1H-RMN mostraron que la inclusión de AOA en la dieta promueve una disminución en los niveles hepáticos de alanina, glutamato y glucógeno. Adicionalmente, los análisis de 2H-RMN indicaron una tasa de renovación más alta de alanina en el hígado de los peces alimentados con una dieta con un contenido alto en carbohidratos y bajo en proteínas y que el AOA disminuye el enriquecimiento de alanina en 2H independientemente de la composición de la dieta. Los estudios derivados de esta tesis indican que la inhibición dependiente de AOA de la actividad de la ALT citosólica podría contribuir a aumentar el uso de nutrientes por carbohidratos de la dieta de Sparus aurata. / Carnivorous fish have low ability to utilize dietary carbohydrates and controlling blood glucose levels. Compared with mammals, these animals after ingestion of glucose or diets high in carbohydrates show a more prolonged hyperglycemia. Alanine aminotransferase (ALT) links carbohydrate and amino acid metabolism through catalysing the reversible transamination between L-alanine and 2-oxoglutarate to form pyruvate and L-glutamate. Previous studies from our group indicated the presence of three isoforms ALT bream (Sparus aurata): cALT1 cytosolic isoenzymes and cALT2 and a mitochondrial isoform, mALT. In the liver os Sparus aurata cALT2 expression increases gluconeogenesis situation prevails while cALT1 during the postprandial period for the utilization of dietary nutrients. The overall objective of this study is to understand at a molecular level the resulting metabolic effects from the inhibition of ALT in fish to help establish new biotechnological applications aimed to improve the use of dietary nutrients. Thus in aquaculture, identifying metabolic effects associated with ALT activity modulation is a point of interest to know if it is possible to perform a partial replacement of dietary proteins by carbohydrate or other nutrients, to reduce the cost of Aquaculture production and reduce eutrophication of the environment. Our studies show that intraperitoneal injection of a chitosan-pCpG-siRNA nanoparticles complex to Gilthead seabream proved to be suitable for the expression of a siRNA to silence the expression of liver cALT1 in Sparus aurata. Intraperitoneal injection of pCpGsi1sh1-chitosan nanoparticles complex promoted cALT1 silencing at the mRNA level and a decrease of liver enzyme activity of Gilthead seabream. In the present study amino-oxyacetate (AOA) was used to evaluate its effect on liver ALT activity of the carnivorous fish Sparus aurata. Moreover, the derived metabolic effects on metabolites and other key enzymes of glycolysis, gluconeogenesis and the pentose phosphate pathway were also studied. A dose-effect-dependent inhibition of AOA on hepatic cytosolic and mitochondrial ALT activity was observed in vitro. In vivo, AOA behaved as an inhibitor of hepatic cytosolic ALT activity. A long-term exposure to AOA increased pyruvate kinase activity in the liver irrespective of the composition of the diet supplied to fish. 1H NMR studies showed that inclusion of AOA to the diet decreased the hepatic levels of alanine, glutamate and glycogen. Moreover, 2H NMR analysis indicated a higher renewal rate for alanine in the liver of fish fed with a high-carbohydrate/low-protein diet, while AOA decreased alanine 2H-enrichment irrespective of the diet. The present study indicates that AOA-dependent inhibition of the cytosolic ALT activity could help to increase the use of dietary carbohydrate nutrients by the Sparus aurata fish.