A membrana amniótica é uma membrana translucida sendo a membrana mais interna da cavidade amniótica, formada por uma monocamada de células epiteliais disposta sobre uma membrana basal. Com o crescente interesse na utilização de células-tronco provenientes de anexos fetais, esta se torna uma promissora fonte de células-tronco. Sendo assim em trabalho anterior realizado pelo nosso grupo tivemos como objetivo, o estabelecimento da cultura celular e caracterização das células-tronco fetais de membrana amniótica de cão para verificar se a mesma pudesse ser uma nova fonte celular a ser usada nos protocolos de terapia celular, uma vez que os cães têm sido considerados modelos animais atraentes para avaliar novas drogas ou realizar ensaios pré-clínicos. As células de membrana amniótica obtidas a partir do trabalho anterior foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu o seu potencial carcinogênico observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante deste comportamento acreditamos ser de extrema importância analisar células provenientes de novas coletas verificando se a mesmas podem se comportar como as anteriormente estudadas. Com isso, temos como objetivo deste trabalho estabelecer e caracterizar as células provenientes de duas novas coletas em diferentes períodos gestacionais visando verificar se estas células se comportam da mesma que as anteriores isso é se quando inoculadas nos animais formam tumor e assim poder ter certeza de que essas células são ou não, boas alternativas para terapia celular. As células obtidas nestas novas coletas têm características de células-tronco mesenquimais expressando alguns marcadores, tem curva de crescimento semelhante às células-tronco mesenquimais, se aderem ao plástico e se diferenciaram em adipócitos. Diferentemente das células obtidas no estudo anterior estas células não geraram tumor quando injetadas em camundongos imunossuprimidos, nude em até 60 dias após inoculação. / Amniotic membrane is a membrane translucent with the inner membrane of the amniotic cavity, formed by a monolayer of epithelial cells disposed on a basal membrane. With the growing interest in the use of stem cells from fetal membranes, this becomes a promising source of stem cells. So in a previous study conducted by our group we aim, the establishment of cell culture and characterization of fetal stem cells from amniotic membrane from dog to see if it could be a new source cell to be used in cell therapy protocols, Once the dogs have been considered attractive animal models to evaluate new drugs or performing pre-clinical tests. The cells from amniotic membrane obtained from previous work were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. But when it was analyzed its its carcinogenic potential observed the formation of a fast-growing tumor, approximately one month after inoculation of these cells into immunocompromised nude mice 10, and the tumor identified histologically as embryonal carcinoma. Given this behavior we believe is extremely important to analyze cells from new collections by checking if the same can behave like those previously studied. With this, we aim of this work to establish and characterize the cells from two new collections at different gestational periods to verify whether these cells behave the same as the previous ones is that when inoculated into animals form tumor and thus be able to make sure that these cells are either not good alternatives for cell therapy. The cells obtained in these new collections has characteristics of mesenchymal stem cells expressing some markers, growth curve is similar to mesenchymal stem cells, adhere to plastic and differentiated into adipocytes. Unlike the cells obtained in the previous study these cells did not generate tumors when injected into immunocompromised mice, nude within 60 days after inoculation.

A membrana amniótica humana vem assumindo um papel de extrema importância na medicina regenerativa nos últimos anos, principalmente na área de dermatologia e oftalmologia, sendo seu uso promissor no tratamento de doenças cuja terapêutica atual é pouco eficaz. Além disso, na membrana amniótica humana encontram-se células-tronco mesenquimais, que apresentam plasticidade e vem sendo aplicadas para a regeneração de tecidos. Entretanto, muito pouco se sabe sobre a capacidade plástica e o uso de células-tronco de membrana amniótica de animais, já que a literatura a este respeito, não é tão ampla quanto à de humanos. Neste projeto estabelecemos a cultura de células-tronco de membrana amniótica (MA) de fetos caninos, caracterizando as células in vitro e in vivo. As células de MA foram obtidas a partir de um procedimento cirúrgico de histerectomia em cadelas prenhas, durante campanhas de castração da prefeitura da cidade de São Paulo. As células de MA foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu comportamento in vivo, observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante do comportamento biológico formando um tumor in vivo, inferimos que células-tronco provenientes de membrana amniótica de cães não devem ser usadas para aplicação com objetivos terapêuticos em animais, pelo menos até que novas coletas sejam realizadas para que se possa confirmar ou não este comportamento. / The human amniotic membrane has taken an extremely important role in regenerative medicine in recent years, especially in dermatology and ophthalmology, and its promising use in treating diseases for which current therapy is ineffective. In addition, the amniotic membrane has human mesenchymal stem cells, which exhibit plasticity and have been applied to tissue regeneration. However, very little is known about the plastic capacity and the use of stem cells from amniotic membrane of animals, since the literature in this regard, it is not as broad as those of humans. In this project we established a culture of amniotic stem cells of dog, characterizing these cells in vitro and in vivo. The cells were obtained from a surgical procedure for hysterectomy in pregnant bitches, during castration\'s campaigns of the São Paulo\'s municipality. The cells were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. In spite of their behavior, in vivo we observed the formation of a fast-growing tumor about a month after the inoculation of these cells in 10 immunosuppressed mice, being the tumor identified histologically as an embryonic carcinoma. Considering the biological behavior of forming a tumor in vivo, we infer that stem cells from amniotic membrane of dogs should not be used for application for therapeutic purposes in animals, at least until other collections are carried out so that it can be confirmed or not.

BACKGROUND: Cells, growth factors (GFs), and scaffold are three essential factors for tissue engineering. Our previous studies suggested that multiple applications of human amnion growth factors (AGF) into osseous defects could “mimic in-utero” growth. However, micro-gaps still exist between the scaffold and recipient tissue. We hypothesized that hyaluronic acid (HA) could act an accessory scaffold and gradually release active components of AGF and improve bone healing. MATERIALS AND METHODS: Calvaria from 50 7–9-day old CD1 neonatal mice were harvested, and a 2 mm defect punch made in each one. A type I collagen membrane with AGF alone or with HA at different concentrations applied over the defect. The culture medium was changed every 2-3 days and collected for alkaline phosphatase (ALP) and protein analysis. RESULTS: A single dose of AGF combined with 0.125% HA increased cellular infiltration into the defect area more than AGF with no HA or a lower concentration of HA (0.0625%). A single dose of AGF with HA can improve bone healing. CONCLUSION: A single dose of AGF with HA as an extra scaffold and a carrier can achieve bone formation like multiple dosages of AGF and reduce the number of clinical applications needed.

Yes / The gold standard substrate for the ex vivo expansion of human limbal stem cells (LSCs) remains the human amniotic membrane (HAM) but this is not a defined substrate and is subject to biological variabil-ity and the potential to transmit disease. To better define HAM and mitigate the risk of disease transmis-sion, we sought to determine if decellularisation and/or c-irradiation have an adverse effect on culture growth and LSC phenotype. Ex vivo limbal explant cultures were set up on fresh HAM, HAM decellularised with 0.5 M NaOH, and 0.5% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) with or without c-irradiation. Explant growth rate was measured and LSC phenotype was characterised by histology, immunostaining and qRT-PCR (ABCG2, DNp63, Ki67, CK12, and CK13). Ƴ-irradiation marginally stiffened HAM, as measured by Brillouin spectromicroscopy. HAM stiffness and c-irradiation did not significantly affect the LSC phe-notype, however LSCs expanded significantly faster on Ƴ-irradiated SDS decellularised HAM (p < 0.05) which was also corroborated by the highest expression of Ki67 and putative LSC marker, ABCG2. Colony forming efficiency assays showed a greater yield and proportion of holoclones in cells cultured on Ƴ-irradiated SDS decellularised HAM. Together our data indicate that SDS decellularised HAM may be a more efficacious substrate for the expansion of LSCs and the use of a c-irradiated HAM allows the user to start the manufacturing process with a sterile substrate, potentially making it safer.

Linfedema é uma condição crônica que predispõe a uma substancial morbidade e perda da função do órgão ou tecido afetado. Ele não tem cura e em longo prazo leva a dificuldades físicas e psicológicas ao paciente, tornando-se um grande desafio para os médicos. Infelizmente, é triste constatar que aproximadamente 400 anos após a descoberta dos vasos linfáticos, não há cura para o linfedema, sendo o tratamento baseado em drenagem linfática manual através de massagem e limitadas intervenções de fisioterapia, ambas visando redução do volume de edema, o que fornece alívio parcial para os indivíduos afetados que não garantem o desaparecimento da fibrose, aparentemente irreversível. Por isso, estudos que proporcionem novas intervenções, como a terapia celular com células-tronco, são de grande interesse. Neste trabalho tivemos como objetivo realizar terapia celular de linfedema murino utilizando células-tronco da membrana amniótica. Em um primeiro momento, a obtenção do modelo de insuficiência linfática foi feita com base em Tabibiazar et al., 2006 onde uma microablação de 2 mm em toda a circunferência foi feita na cauda do animal. Entretanto, após 30 dias de indução uma regressão espontânea foi observada inviabilizando a utilização deste modelo. Após vasta pesquisa na literatura outro modelo de indução de linfedema (Shimizu et al., 2012) foi encontrado, onde os autores fazem uma microablação cirúrgica, mantendo um flap de 4 mm na região ventral. Neste trabalho os autores obtiveram um linfedema estável por no mínimo 30 dias. Com base nestes achados, o modelo de linfedema murino induzido baseado em Shimizu foi realizado e após a comprovação desta estabilidade por 60 dias, esse modelo foi utilizado para indução do linfedema. Após esta caracterização, os animais que tiveram o linfedema induzido foram submetidos a terapia celular utilizando 0,5X106 células-tronco da membrana amniótica humana (MAh) ou saco vitelino canino (SVc) no momento da indução. Animais sem lesão, com lesão (SHAM) e tratados apenas com solução fisiológica (placebo) também foram analisados. O monitoramento do linfedema na cauda foi feito através de acompanhamento clínico, registro fotográfico e mensura do diâmetro caudal a cada 2-3 dias. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados, tiveram suas caudas removidas e foram submetidos a avaliação dos efeitos terapêuticos da terapia celular através de análise do exsudato, análises histológicas (HE, picrossírius) e imuno-histoquímicas. A histológica obtida por coloração de HE além de apresentar o melhor resultado quando comparado com as demais técnicas, possibilitou avaliar as alterações patológicas pertinentes de cada amostra, revelando efeitos benéficos da terapia quando comparados com SHAM e placebo. Já, a coloração Picrossírius permitiu visualizar além das alterações estruturais, a inversão da predominância da expressão de colágeno do tipo I, por colágeno do tipo III nos tecidos estruturalmente comprometidos. O resultado do conjunto de análises das amostras apresentou o padrão linfedematoso esperado para os grupos SHAM e placebo, porém também mostrou um processo inflamatório muito menor e mais curto nos grupos MAh, e SVc, permitindo sugerir que a terapia celular causou um impacto favorável e os animais apresentaram resultados muito próximos aos padrões exibidos pelo grupo controle. / Lymphedema is a chronic condition, which predisposes to substantial morbidity and loss of function of the affected organ or tissue. It has no cure and, in the long term, leads patients to physical and psychological problems, which is a major challenge for doctors. Unfortunately, it is sad to realize that, approximately 400 years after the discovery of the lymphatic vessels, there is no cure for lymphedema. The treatment is based on manual lymphatic drainage through massage and limited physiotherapy interventions. Both techniques aim at reducing the volume of the edema, which provides partial relief for affected individuals, but do not guarantee the disappearance of the fibrosis, which is, apparently, irreversible. Therefore, studies that provide new interventions, such as stem cell therapy, are of great interest. In this study, we carried out induced murine lymphedema using human amniotic membrane stem cells. At first, we obtained the model of lymphatic insufficiency based on Tabibiazar et al., 2006, in which a 2 mm microablation throughout the circumference was made in the tail of the animal. However, after 30 days of induction, a spontaneous regression was observed, making this model unusable. After extensive literature research, another model of lymphedema induction (Shimizu et al., 2012) was found. In this model, the authors perform a surgical microablation, maintaining a 4 mm flap in the ventral region. The authors obtained stable lymphedema for at least 30 days. Based on these findings, the model of induced murine lymphedema, based on Shimizu et al., 2012, was performed and, after proving this stability for 60 days, this model was used for the induction of murine lymphedema. After this characterization, the animals that have had induced lymphedema were subjected to cell therapy using 0.5X106 human amniotic membrane stem cells (MAh) or canine yolk sac (SVc) at the time of induction. Animals without lesion, with lesion (SHAM) and treated only with solution were also analyzed. The monitoring of lymphedema in the tail was done through clinical follow-up, photographic record and caudal diameter measurement every 2-3 days. At the end of the study, the animals were euthanized, had their tails removed, and were subjected to evaluation of the therapeutic effects of the cell therapy through exudate analysis, histological analysis (HE, picrosirius) and immunohistochemistry analysis. The histological obtained by HE staining, besides presenting the best result when compared to the other techniques, allowed to evaluate the pertinent pathological alterations of each sample, revealing beneficial effects of the therapy when compared to SHAM and placebo. Picrosirius staining allowed to visualize, in addition to the structural alterations, the reversal of the predominance of type I collagen expression by type III collagen in structurally compromised tissues. The result of the sample analysis showed the expected lymphomatoid pattern for the SHAM and placebo groups, but also showed a much shorter and shorter inflammatory process in the MAh and SVc groups, suggesting that the cell therapy had an impact and the animals presented results very close to the standards presented by the control group.

A cirrose hepática é uma doença crônica e irreversível com modificações histológicas caracterizadas por nódulos de regeneração e desarranjo de hepatócitos, com aumento difuso de tecido conjuntivo e perda de função. As células-tronco têm sido amplamente estudadas para o tratamento de injúrias hepáticas. Fibrose e cirrose foram induzidas em ratos Wistar, através da aplicação de tioacetamida (TAA) intraperitoneal a 200 mg/kg por 8 ou 14 semanas, seguido de terapia celular com aplicação intravenosa única de 1x106 células-tronco de membrana amniótica de ratas. Amostras de sangue foram coletadas para análises bioquímicas, e tecido hepático para histologia e imunohistoquímica. A histopatologia para colorações de hematoxilina-eosina para graduação e estadiamento da lesão hepática foi realizada, com observação de alterações celulares; picrosírius para quantificação do colágeno parenquimal; ácido periódico-Schiff para mucopolissacarídeos neutros e glicogênio; e alcian blue para mucopolissacarídeos ácidos. Imunohistoquímica foi realizada para marcação de PCNA, colágenos tipo 1 e 3, e &alpha;-SMA. O cultivo celular apresentou ótimo crescimento, sendo transduzido com GFP e negativo para micoplasma. Os animais induzidos experimentalmente mostraram baixo ganho de peso durante o experimento, com notável recuperação nas duas primeiras semanas após término da indução. A mortalidade experimental foi de 10 %. A indução da fibrose e cirrose hepática obtiveram sucesso no período de 8 e 14 semanas, respectivamente Análises macroscópicas mostraram melhor aspecto de fígados cirróticos após terapia celular. Não houve diferenças estatísticas após a terapia celular para as análises bioquímicas, graduação, estadiamento, alterações celulares, proliferação de ductos, mucopolissacarídeos ácidos e neutros e imunohistoquímicas para colágeno 1 e 3, PCNA e &alpha;- SMA. Houve, porém, uma tendência a melhora na graduação e estadiamento da fibrose e cirrose com redução da atividade necroinflamatória; redução na proliferação de ductos; menor deposição de mucopolissacarídeos ácidos e neutros; diminuição das alterações celulares com indicativos de menor grau de lesão tecidual e maior grau de regeneração; diminuição da expressão de &alpha;-SMA e colágenos 1 e 3; e aumento do PCNA. O colágeno intralobular teve diminuição após terapia celular em fígados fibróticos. Em animais induzidos a cirrose, houve diminuição de ambos colágenos interlobular e intralobular. Conclui-se que houve uma tendência de melhora dos animais após tratamento com células-tronco da membrana amniótica de ratas, o que nos encoraja a aplicação de protocolos de terapia celular. Apesar dos resultados promissores, um maior número de animais precisa ser testado para que se tenham mais dados, que possam dar subsídios para o uso destas células na prática clínica para o tratamento da cirrose hepática / Liver cirrhosis is a chronic and irreversible disease with histological changes characterized by regenerative nodules and disarray of hepatocytes with diffuse increase in connective tissue and loss of function. Stem cells have been extensively studied for the treatment of liver injury. Fibrosis and cirrhosis was induced in Wistar rats by application of thioacetamide (TAA) intraperitoneally at 200 mg/kg for 8 or 14 weeks, followed by cell therapy with a single intravenous administration of 1x106 stem cells from amniotic membrane of rats. Blood samples were collected for biochemical analyzes, and liver tissue for histology and immunohistochemistry. Histopathology by hematoxylin-eosin for grading and staging of hepatic injury with observation of cellular changes was performed; picrosirius for quantification of parenchymal collagen; periodic acid-Schiff for neutral mucopolysaccharides and glycogen; and alcian blue for acid mucopolysaccharides. Immunohistochemistry was performed for PCNA, type 1 and 3 collagens, and &alpha;-SMA. Cell culture showed optimal growth, being transduced with GFP and negative for mycoplasma. Animals induced to liver disease showed low weight gain during the experiment, with remarkable recovery in the first two weeks after completion of induction. Experimental mortality was 10%. Induction of fibrosis and cirrhosis was successful after the period of 8 and 14 weeks, respectively. Macroscopic analysis showed improvement in the aspect of cirrhotic livers after cell therapy. There were no statistical differences after cell therapy for biochemical analyzes, grading, staging, cellular changes, proliferation of ducts, acidic and neutral mucopolysaccharides and immunohistochemistry for collagen 1 and 3, PCNA and &alpha;-SMA. There was, however, a tendency on improvement in grading and staging of fibrosis and cirrhosis with reduced necroinflammatory activity; reduction in the proliferation of ducts; lower deposition of acidic and neutral mucopolysaccharides; decrease in cellular changes indicating a lower degree of tissue damage and a greater degree of regeneration; decreasing on the expression of &alpha;-SMA and type 1 and 3 collagens; and increased PCNA. Intralobular collagen decreased after cell therapy in fibrotic livers. In cirrhotic animals, there was a decrease of both interlobular and intralobular collagen. We conclude that was a trend to improvement of animals after treatment with stem cells derived from amniotic membrane of rats, which encourages the application of cell therapy protocols. Despite the promising results, a larger number of animals must be tested, so we can have more data to make allowances for the use of these cells in clinical practice for the treatment of liver cirrhosis

The amniotic membrane and the amniotic fluid are one of life's most complex and delicate tissues and fluids, respectively. What was known about this tissue and fluid prior to the 20th century was extremely limited scientifically, but was significantly defined by beliefs entrenched in mysticism, folklore, and superstitions. A comprehensive literature review of the amniotic membrane tissue and amniotic fluid reveals the many unique and complex characteristics and biological properties that been heavily investigated since the turn of the 20th century and continues to surge into the 21st century. The historical perspectives, evolution, derivation, histology, structure, and composition of the amniotic membrane; and historical perspectives, volume and regulation, and cellular and non-cellular composition of the amniotic fluid are discussed here and are coalesced for an easy and comprehensible resource. Lastly, future perspectives regarding research and application of the amniotic membrane and amniotic fluid, including stem cells are discussed.

Introduction: Recent advances in posterior lamellar keratoplasty necessitated the preparation of posterior corneal lamellae even in the Czech Republic. The aim of this work was to introduce and standardize a novel method of manual preparation of corneal lamellae for Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty with a Stromal rim (DMEK-S) in an ocular tissue bank. After setting the criteria for endothelial quality, we obtained a licence to provide the tissues for transplantation purposes. The obtained results were analysed after two years. Furthermore, a novel lamellar insertion technique using a cartridge was assessed. The potentials for the long-term storage of posterior corneal lamellae by the vitrification in liquid ethane was studied using human amniotic membrane as a model tissue. Material and Methods: Corneoscleral buttons stored in tissue cultures were used to prepare lamellae consisting of a central zone of endothelium and Descemet membrane supported by a stromal rim at the periphery. The manual preparation was performed on an artificial anterior chamber using the big bubble technique. Endothelial quality was assessed before storage, before and immediately after preparation as well as after 2 days of storage at 31řC. A group of 12 corneas with a live endothelial cell density ≥ 2500 cells/mm2...

A cirrose hepática é uma doença crônica e irreversível com modificações histológicas caracterizadas por nódulos de regeneração e desarranjo de hepatócitos, com aumento difuso de tecido conjuntivo e perda de função. As células-tronco têm sido amplamente estudadas para o tratamento de injúrias hepáticas. Fibrose e cirrose foram induzidas em ratos Wistar, através da aplicação de tioacetamida (TAA) intraperitoneal a 200 mg/kg por 8 ou 14 semanas, seguido de terapia celular com aplicação intravenosa única de 1x106 células-tronco de membrana amniótica de ratas. Amostras de sangue foram coletadas para análises bioquímicas, e tecido hepático para histologia e imunohistoquímica. A histopatologia para colorações de hematoxilina-eosina para graduação e estadiamento da lesão hepática foi realizada, com observação de alterações celulares; picrosírius para quantificação do colágeno parenquimal; ácido periódico-Schiff para mucopolissacarídeos neutros e glicogênio; e alcian blue para mucopolissacarídeos ácidos. Imunohistoquímica foi realizada para marcação de PCNA, colágenos tipo 1 e 3, e &alpha;-SMA. O cultivo celular apresentou ótimo crescimento, sendo transduzido com GFP e negativo para micoplasma. Os animais induzidos experimentalmente mostraram baixo ganho de peso durante o experimento, com notável recuperação nas duas primeiras semanas após término da indução. A mortalidade experimental foi de 10 %. A indução da fibrose e cirrose hepática obtiveram sucesso no período de 8 e 14 semanas, respectivamente Análises macroscópicas mostraram melhor aspecto de fígados cirróticos após terapia celular. Não houve diferenças estatísticas após a terapia celular para as análises bioquímicas, graduação, estadiamento, alterações celulares, proliferação de ductos, mucopolissacarídeos ácidos e neutros e imunohistoquímicas para colágeno 1 e 3, PCNA e &alpha;- SMA. Houve, porém, uma tendência a melhora na graduação e estadiamento da fibrose e cirrose com redução da atividade necroinflamatória; redução na proliferação de ductos; menor deposição de mucopolissacarídeos ácidos e neutros; diminuição das alterações celulares com indicativos de menor grau de lesão tecidual e maior grau de regeneração; diminuição da expressão de &alpha;-SMA e colágenos 1 e 3; e aumento do PCNA. O colágeno intralobular teve diminuição após terapia celular em fígados fibróticos. Em animais induzidos a cirrose, houve diminuição de ambos colágenos interlobular e intralobular. Conclui-se que houve uma tendência de melhora dos animais após tratamento com células-tronco da membrana amniótica de ratas, o que nos encoraja a aplicação de protocolos de terapia celular. Apesar dos resultados promissores, um maior número de animais precisa ser testado para que se tenham mais dados, que possam dar subsídios para o uso destas células na prática clínica para o tratamento da cirrose hepática / Liver cirrhosis is a chronic and irreversible disease with histological changes characterized by regenerative nodules and disarray of hepatocytes with diffuse increase in connective tissue and loss of function. Stem cells have been extensively studied for the treatment of liver injury. Fibrosis and cirrhosis was induced in Wistar rats by application of thioacetamide (TAA) intraperitoneally at 200 mg/kg for 8 or 14 weeks, followed by cell therapy with a single intravenous administration of 1x106 stem cells from amniotic membrane of rats. Blood samples were collected for biochemical analyzes, and liver tissue for histology and immunohistochemistry. Histopathology by hematoxylin-eosin for grading and staging of hepatic injury with observation of cellular changes was performed; picrosirius for quantification of parenchymal collagen; periodic acid-Schiff for neutral mucopolysaccharides and glycogen; and alcian blue for acid mucopolysaccharides. Immunohistochemistry was performed for PCNA, type 1 and 3 collagens, and &alpha;-SMA. Cell culture showed optimal growth, being transduced with GFP and negative for mycoplasma. Animals induced to liver disease showed low weight gain during the experiment, with remarkable recovery in the first two weeks after completion of induction. Experimental mortality was 10%. Induction of fibrosis and cirrhosis was successful after the period of 8 and 14 weeks, respectively. Macroscopic analysis showed improvement in the aspect of cirrhotic livers after cell therapy. There were no statistical differences after cell therapy for biochemical analyzes, grading, staging, cellular changes, proliferation of ducts, acidic and neutral mucopolysaccharides and immunohistochemistry for collagen 1 and 3, PCNA and &alpha;-SMA. There was, however, a tendency on improvement in grading and staging of fibrosis and cirrhosis with reduced necroinflammatory activity; reduction in the proliferation of ducts; lower deposition of acidic and neutral mucopolysaccharides; decrease in cellular changes indicating a lower degree of tissue damage and a greater degree of regeneration; decreasing on the expression of &alpha;-SMA and type 1 and 3 collagens; and increased PCNA. Intralobular collagen decreased after cell therapy in fibrotic livers. In cirrhotic animals, there was a decrease of both interlobular and intralobular collagen. We conclude that was a trend to improvement of animals after treatment with stem cells derived from amniotic membrane of rats, which encourages the application of cell therapy protocols. Despite the promising results, a larger number of animals must be tested, so we can have more data to make allowances for the use of these cells in clinical practice for the treatment of liver cirrhosis

Linfedema é uma condição crônica que predispõe a uma substancial morbidade e perda da função do órgão ou tecido afetado. Ele não tem cura e em longo prazo leva a dificuldades físicas e psicológicas ao paciente, tornando-se um grande desafio para os médicos. Infelizmente, é triste constatar que aproximadamente 400 anos após a descoberta dos vasos linfáticos, não há cura para o linfedema, sendo o tratamento baseado em drenagem linfática manual através de massagem e limitadas intervenções de fisioterapia, ambas visando redução do volume de edema, o que fornece alívio parcial para os indivíduos afetados que não garantem o desaparecimento da fibrose, aparentemente irreversível. Por isso, estudos que proporcionem novas intervenções, como a terapia celular com células-tronco, são de grande interesse. Neste trabalho tivemos como objetivo realizar terapia celular de linfedema murino utilizando células-tronco da membrana amniótica. Em um primeiro momento, a obtenção do modelo de insuficiência linfática foi feita com base em Tabibiazar et al., 2006 onde uma microablação de 2 mm em toda a circunferência foi feita na cauda do animal. Entretanto, após 30 dias de indução uma regressão espontânea foi observada inviabilizando a utilização deste modelo. Após vasta pesquisa na literatura outro modelo de indução de linfedema (Shimizu et al., 2012) foi encontrado, onde os autores fazem uma microablação cirúrgica, mantendo um flap de 4 mm na região ventral. Neste trabalho os autores obtiveram um linfedema estável por no mínimo 30 dias. Com base nestes achados, o modelo de linfedema murino induzido baseado em Shimizu foi realizado e após a comprovação desta estabilidade por 60 dias, esse modelo foi utilizado para indução do linfedema. Após esta caracterização, os animais que tiveram o linfedema induzido foram submetidos a terapia celular utilizando 0,5X106 células-tronco da membrana amniótica humana (MAh) ou saco vitelino canino (SVc) no momento da indução. Animais sem lesão, com lesão (SHAM) e tratados apenas com solução fisiológica (placebo) também foram analisados. O monitoramento do linfedema na cauda foi feito através de acompanhamento clínico, registro fotográfico e mensura do diâmetro caudal a cada 2-3 dias. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados, tiveram suas caudas removidas e foram submetidos a avaliação dos efeitos terapêuticos da terapia celular através de análise do exsudato, análises histológicas (HE, picrossírius) e imuno-histoquímicas. A histológica obtida por coloração de HE além de apresentar o melhor resultado quando comparado com as demais técnicas, possibilitou avaliar as alterações patológicas pertinentes de cada amostra, revelando efeitos benéficos da terapia quando comparados com SHAM e placebo. Já, a coloração Picrossírius permitiu visualizar além das alterações estruturais, a inversão da predominância da expressão de colágeno do tipo I, por colágeno do tipo III nos tecidos estruturalmente comprometidos. O resultado do conjunto de análises das amostras apresentou o padrão linfedematoso esperado para os grupos SHAM e placebo, porém também mostrou um processo inflamatório muito menor e mais curto nos grupos MAh, e SVc, permitindo sugerir que a terapia celular causou um impacto favorável e os animais apresentaram resultados muito próximos aos padrões exibidos pelo grupo controle. / Lymphedema is a chronic condition, which predisposes to substantial morbidity and loss of function of the affected organ or tissue. It has no cure and, in the long term, leads patients to physical and psychological problems, which is a major challenge for doctors. Unfortunately, it is sad to realize that, approximately 400 years after the discovery of the lymphatic vessels, there is no cure for lymphedema. The treatment is based on manual lymphatic drainage through massage and limited physiotherapy interventions. Both techniques aim at reducing the volume of the edema, which provides partial relief for affected individuals, but do not guarantee the disappearance of the fibrosis, which is, apparently, irreversible. Therefore, studies that provide new interventions, such as stem cell therapy, are of great interest. In this study, we carried out induced murine lymphedema using human amniotic membrane stem cells. At first, we obtained the model of lymphatic insufficiency based on Tabibiazar et al., 2006, in which a 2 mm microablation throughout the circumference was made in the tail of the animal. However, after 30 days of induction, a spontaneous regression was observed, making this model unusable. After extensive literature research, another model of lymphedema induction (Shimizu et al., 2012) was found. In this model, the authors perform a surgical microablation, maintaining a 4 mm flap in the ventral region. The authors obtained stable lymphedema for at least 30 days. Based on these findings, the model of induced murine lymphedema, based on Shimizu et al., 2012, was performed and, after proving this stability for 60 days, this model was used for the induction of murine lymphedema. After this characterization, the animals that have had induced lymphedema were subjected to cell therapy using 0.5X106 human amniotic membrane stem cells (MAh) or canine yolk sac (SVc) at the time of induction. Animals without lesion, with lesion (SHAM) and treated only with solution were also analyzed. The monitoring of lymphedema in the tail was done through clinical follow-up, photographic record and caudal diameter measurement every 2-3 days. At the end of the study, the animals were euthanized, had their tails removed, and were subjected to evaluation of the therapeutic effects of the cell therapy through exudate analysis, histological analysis (HE, picrosirius) and immunohistochemistry analysis. The histological obtained by HE staining, besides presenting the best result when compared to the other techniques, allowed to evaluate the pertinent pathological alterations of each sample, revealing beneficial effects of the therapy when compared to SHAM and placebo. Picrosirius staining allowed to visualize, in addition to the structural alterations, the reversal of the predominance of type I collagen expression by type III collagen in structurally compromised tissues. The result of the sample analysis showed the expected lymphomatoid pattern for the SHAM and placebo groups, but also showed a much shorter and shorter inflammatory process in the MAh and SVc groups, suggesting that the cell therapy had an impact and the animals presented results very close to the standards presented by the control group.