Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T11:57:30Z No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:35:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:35:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) Previous issue date: 2009-03-12 / A busca por novos antibióticos de amplo espectro de ação tem aumentado nas últimas décadas devido ao número crescente de bactérias resistentes aos antibióticos convencionais. O peptídeo recombinante Pg-AMP1, expresso em um sistema heterólogo em Escherichia coli, apresentou atividade antibacteriana contra linhagens Gram-positivas e Gram-negativas. A partir da seqüência de aminoácidos do peptídeo isolado de sementes de goiaba (Psidium guajava L.) o gene correspondente ao peptídeo foi modificado utilizando-se o códon preferencial para expressão em E. coli e construído um vetor de expressão. Uma região codificadora para cauda de histidina foi fusionada ao gene pg-amp1 permitindo a purificação por cromatografia de afinidade com íons de níquel imobilizados em coluna de sefarose. Utilizando SDS-PAGE e análise in sílico identificamos a massa molecular do PgAMP1 recombinante de 7,368 kDa e pI 8.93. O peptídeo recombinante foi expresso principalmente na forma insolúvel, agregando-se em corpos de inclusão que foram tratados com agentes desnaturantes obtendo o peptídeo solúvel. Após a purificação pela coluna de níquel obtivemos um rendimento de 13 mg por litro de meio de cultura. O peptídeo Pg-AMP1 recombinante apresentou atividade contra as bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa e contra as Grampositivas Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermides. O peptídeo recombinante Pg-AMP1 não mostrou atividade contra os fungos fitopatogênicos testados. Devido a sua ação contra estas cepas de bactérias patogênicas humanas, o Pg-AMP1 recombinante torna-se um promissor antimicrobiano a ser utilizado no desenvolvimento de novos antibióticos contra cepas resistentes aos fármacos comumente usados. / The search for new antibiotics of broad spectrum of activity has increased in recent decades due to the increasing number of bacteria resistant to conventional antibiotics. The Pg-AMP1 recombinant peptide expressed in a heterologous system in Escherichia coli, strains showed antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative. From the sequence of amino acid peptide isolated from the seeds of guava (Psidium guajava L.) peptide corresponding to the gene was modified using the preferred codon for expression in E. coli and constructed a vector for expression. A region coding for the histidine tail was merged the gene-pg amp1 allowing purification by affinity chromatography with nickel ions immobilized on the column sepharose. Using SDS-PAGE and in silico analysis identified the molecular weight of Pg-AMP1 recombinant with 7.368 kDa and pI 8.93. The recombinant peptide was expressed mostly as insoluble form, adding up in inclusion bodies, which were treated with denaturants agents to solubilize the peptide. The purification of peptide by nickel sepharose column yielded 13 mg per liter of culture medium. The Pg-AMP1 recombinant peptide showed activity against Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa and against gram-positive Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. The recombinant peptide Pg-AMP1 showed no activity against the phytopathogenic fungi tested. Due to its action against these strains of human pathogenic bacteria, the recombinant Pg-AMP1 is a promising antimicrobial for use in developing new antibiotics against strains resistant to commonly used drugs.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-06T13:12:00Z No. of bitstreams: 1 melviscelestevilanculoscossa.pdf: 1078778 bytes, checksum: 97bdef4f96b42adf5a7860d727162f8f (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-04-24T03:59:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 melviscelestevilanculoscossa.pdf: 1078778 bytes, checksum: 97bdef4f96b42adf5a7860d727162f8f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-24T03:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 melviscelestevilanculoscossa.pdf: 1078778 bytes, checksum: 97bdef4f96b42adf5a7860d727162f8f (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A batata uma essencial “comida para todos”, é hoje uma das mais importantes culturas alimentares e constitui a quarta cultura mais importante do mundo, sendo também fonte de segurança alimentar. Todavia, muitas doenças causadas por vírus, bactérias e fungos afetam a cultura desta planta, resultando em perdas e diminuição da qualidade e segurança dos produtos agrícolas. O controle de doenças nas plantas baseia-se principalmente de pesticidas químicos que estão atualmente sujeitos a fortes restrições e requisitos regulamentares. Nesse sentido, vários peptídeos antimicrobianos têm sido a base para a concepção de novos análogos sintéticos e têm sido expressos em plantas transgênicas para conferir proteção a doenças. O desenvolvimento de plantas transgênicas, contendo um gene que sintetiza um peptídeo antibacteriano, tem sido uma das formas estudadas para se controlar doenças bacterianas. No presente estudo, plantas de batata (Solanum tuberosum), cultivar Asterix, foram transformadas com genes codificadores do peptídeo Pg-AMP1 de Psidium guajava, com objetivo de promover resistência a bactérias que afetam a cultura da batata, nomeadamente Pectobacterium atrosepticum e Pectobacterium carotovorum. Experimentos de transformação genética mediada por Agrobacterium permitiram a obtenção de 13 linhagens transgênicas de Solanum tuberosum Pg-AMP1, representando eventos independentes de transformação. Paralelamente aos experimentos de transformação genética, foram realizados bioensaios in vitro com o peptídeo recombinante purificado Pg-AMP1 contra as cepas bacterianas P. atrosepticum e P. carotovorum e bioensaio in vivo em folhas de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) transformada com o peptídeo com as mesmas cepas bacterianas. No que se refere à resistência das folhas contra o ataque das bactérias P. atrosepticum e P. carotovorum, as linhagens transformadas de tabaco Pg-AMP1 apresentaram sintomas de necrose menos severos comparativamente as não transgênicas. Do mesmo modo o peptídeo Pg-AMP1 apresentou atividade bactericida contra as cepas bacterianas P. atrosepticum e P. carotovorum. Assim sendo, estes resultados sugerem a viabilidade do peptídeo Pg-AMP1 na utilização de transformações genéticas de Solanum tuberosum visando resistência a bactérias patogênicas que afetam a cultura. / Potato, known as essential "food for all", is one of the most important food crops in nowadays. It is the fourth most important crop in the world and is also a source for food security. However, many diseases caused by viruses, bacteria and fungi affect plant cultivation, resulting in losses and decrease the quality and safety of agricultural products. The control of plant diseases is mainly based on chemical pesticides that are currently subject to severe restrictions and regulatory requirements. Accordingly, various antimicrobial peptides have being the basis for new synthetic analogs designing and have been expressed in transgenic plants to confer disease protection. The development of transgenic plants containing a gene that synthesizes an antibacterial peptide, has been has been used to bacterial diseases control. In this study, potato plants (Solanum tuberosum) Asterix, were transformed with genes encoding the peptide Pg-AMP1 from Psidium guajava aiming to produce resistant plants to Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum. Experiments of genetic transformation by Agrobacterium - mediated allowed 13 different events of transgenic Solanum tuberosum Pg-AMP1, representing different transformation events. In parallel to genetic transformation experiments in vitro bioassay with recombinant peptide purified Pg-AMP1 was performed. Bacterial strains P. atrosepticum and P. carotovorum were evaluated and in vivo in Tobacco (Nicotiana tabacum) leaves from transformed plants containing the peptide. In resistance assay against P. atrosepticum and P. carotovorum in tobacco plants showed less severe symptoms compared to non-transgenic. Likewise the Pg- AMP1 peptide showed bactericidal activity against bacterial strains P. atrosepticum and P. carotovorum. Thus, these results suggest the feasibility of the peptide Pg- AMP1 the use of genetic transformation of Solanum tuberosum for resistance to pathogenic bacteria that affect the crop.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-06-29T11:33:08Z No. of bitstreams: 1 nataliadosanjospinto.pdf: 1701558 bytes, checksum: a1c89a03566132430636ade1b70b0e04 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-07-05T14:36:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nataliadosanjospinto.pdf: 1701558 bytes, checksum: a1c89a03566132430636ade1b70b0e04 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T14:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nataliadosanjospinto.pdf: 1701558 bytes, checksum: a1c89a03566132430636ade1b70b0e04 (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / O morango é produzido e consumido nas mais variadas regiões do mundo, sendo a espécie do grupo de pequenos frutos de maior apreciação e grande retorno econômico. Um dos principais problemas na cultura do morangueiro é a incidência de doenças, que podem aparecer em várias fases do ciclo da cultura, atacando desde as mudas recém plantadas até os frutos na fase final de produção. Devido a susceptibilidade às doenças e pragas, o uso de pesticidas é usual no cultivo de morangos. Nesse sentido, o uso de variedades resistentes a fungos e bactérias pode ser uma importante alternativa visando a melhoria da qualidade dos frutos e um menor custo de produção dos mesmos, uma vez que os consumidores exigem cada vez mais, frutos com menor nível residual de agrotóxicos. No presente estudo, plantas de Nicotiana tabacum foram transformadas com os genes OxDc de Flammulina velutipes e Pg-AMP1 de Psidium guajava com o objetivo de avaliar os efeitos da enzima Oxalato Descarboxilase, produzida pelo gene OxDc, na resistência das plantas a fatores que induzem a morte celular de tecidos infectados pelo fungo Fusarium oxysporum, assim como os efeitos in vitro do extrato bruto contendo o peptídeo Pg-AMP1 extraído das folhas de tabaco contra a bactéria Gram-negativa Xanthomonas fragarie. Experimentos de transformação genética mediada por Agrobacterium permitiram a obtenção de 8 linhagens transgênicas de N. tabacum OxDc e 7 linhagens transgênicas de N. tabacum Pg-AMP1, representando eventos de transformação distintos. As plantas foram caracterizadas molecular e bioquimicamente a fim de se confirmar a inserção, expressão e funcionalidade dos genes inseridos nas linhagens obtidas tanto para o gene OxDc quanto para o Pg-AMP1. Os testes de resistência ao ácido oxálico mostraram danos menos severos nas linhagens transformadas de X tabaco OxDc do que nas plantas não transformadas. No que se refere à resistência das folhas ao ataque pelo fungo Fusarium Oxysporum, o gene OxDc também se mostrou capaz de conferir resistência às linhagens transgênicas. Através da técnica de Western blot, foi possível detectar a presença do peptídeo Pg-AMP1 no extrato bruto extraído das folhas transformadas de tabaco Pg-AMP1. O bioensaio realizado in vitro utilizando-se o extrato bruto contendo o peptídeo Pg-AMP1 demonstrou a ação bactericida desse peptídeo contra a bactéria fitopatogênica Xanthomonas Fragarie. Em conjunto os resultados indicam a viabilidade da utilização dos genes OxDc e Pg-AMP1 transformação genética de morangueiro visando à redução nos danos causados por fitopatógenos que acometem suas lavouras, assim como a redução no uso de pesticidas. / The strawberry is produced and consumed in a variety of regions in the world, being the group of small fruits’ species of greater appreciation and high economic returns. A major problem in strawberry culture is the disease incidence that can appear in several stages of the cycle, attacking from the newly planted seeding to the fruit in the final stage of production. Due to this susceptibility to diseases and pests, the pesticide use is common in strawberries cultivation. Regarding this, the use of varieties resistant to fungi and bacteria may be a good alternative in order to improve fruit quality and to lower production cost, since consumers are increasingly demanding fruits with a lower level of pesticides. In the present study, Nicotiana tabacum plants were transformed with Flammulina velutipes OxDc gene and Psidium guajava Pg-AMP1 aiming to evaluate the effect of the enzyme Oxalate Decarboxylase produced by the gene OxDc in plant resistance to factors that induce cell death in tissues infected by the fungus Fusarium oxysporum, and the effect of raw extract containing the Pg-AMP1 peptide extracted from tobacco leaves against gram-negative bacterium Xanthomonas fragarie in vitro. Genetic transformation Agrobacterium-mediated experiments allowed the production of 8 transgenic lines N. tabacum OxDc and 7 transgenic lines of N. tabacum Pg-AMP1, representing different transformation events. The plants were biochemically and molecular characterized to confirm the integration, expression and function of the genes inserted in the lines obtained both for the gene OxDc and Pg-AMP1. Tests for resistance to 20 mM oxalic acid had less severe symptoms in OxDc transformed tobacco lines than the non-transformed plants. Concerning the strength of the leaves against Fusarium oxysporum attack, OxDc gene has also shown to confer resistance to the transgenic lines. It was possible to detect the presence of Pg-AMP1 peptide in the raw extract from Pg-AMP1 tobacco leaves through Western blot. Thus, the in vitro bioassay carried out using the raw extract containing the Pg-AMP1 peptide showed bactericidal activity against the phyto-pathogenic bacteria Xanthomonas Fragarie. Together these results XII determine the viability of OxDc and Pg-AMP1 genes in the use of strawberry genetic transformation aiming the reduction in the damage caused by pathogens that attack the crop.