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Protein Dynamics by Solid-State NMR with Ultra-Fast Magic-Angle Spinning : from Microcrystals to Amyloid Fibrils and Membrane Proteins / Dynamique des Protéines par RMN à l’Etat Solide avec Rotation Ultra Rapide à l’Angle Magique : des Microcristaux aux Fibrilles Amyloïdes et Protéines MembranairesLe Marchand, Tanguy 10 July 2018 (has links)
La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) à l’état solide avec rotation à l’angle magique (MAS) est une technique de choix pour l’étude de la structure et de la dynamique de molécules biologiques peu ou non solubles. Un grand nombre d’approches ont été développées pour la reconstitution de structures tridimensionelles à partir de mesures précises de proximités internucléaires, ainsi que pour la détection de mouvements moléculaires avec une résolution atomique sur des échelles de temps couvrant plusieurs ordres de grandeur. Malgré d’impressionnants progrès, les études par RMN MAS sont cependant loin d’être réalisées en routine. Les déterminations structurelles et de dynamique sont souvent démontrées sur des préparations microcristallines modèles, mais sont encore rares pour des systèmes plus complexes tels que les fibrilles amyloïdes non cristallines ou les protéines trans-membranaires insérées dans des bi- couches lipidiques. Mon travail a pour objectif d’étendre les possibilités de la RMN MAS pour l’étude de systèmes biomoléculaires complexes dans différents états d’agrégation. Pour cela, j’ai exploité les possibilités uniques offertes par les hauts champs magnétiques (fréquence de Larmor du 1H 700, 800 et 1000 MHz) combinés avec les sondes MAS de dernières générations capables d’atteindre des vitesses de rotations supérieures à 60 kHz. Ces conditions expérimentales per- mettent d’augmenter la sensibilité de la RMN MAS à l’aide de la détection 1H à haute résolution et d’enrichir la palette de paramètres RMN rapporteurs de la dynamique des protéines. La première partie de cette thèse décrit le développement de nouvelles stratégies pour l’attribution des résonances du squelette de protéines, pour l’élucidation de structures, et pour l’étude de la dynamique du squelette peptidique et des chaînes latérales. Les méthodes présentées réduisent significative- ment les besoins en termes de temps expérimental, de quantités d’échantillon et de marquage isotopique, et permettent d’analyser par RMN des systèmes de plus hauts poids moléculaire. La seconde partie décrit l’application de la RMN MAS avec détection en 1H pour l’évaluation du rôle de la dynamique des protéines dans des processus tels que la formation de fibrilles amyloïdes et le fonctionnement de protéines membranaires. Une première application est l’étude de la tendance de la β-2 microglobuline humaine à former des fibrilles amyloïdes. Une comparaison de la dynamique du squelette peptidique de la protéine sauvage et du mutant D76N dans leur forme cristalline, ainsi que la détermination de propriétés structurales de la forme fibrillaire m’ont permis d’identifier la présence de repliements pathologiques et de formuler des hypothèses sur le mécanisme de formation des fibrilles. Finalement, la dynamique locale et globale de protéines membranaires dans des bicouches lipidiques a été étudiée. En particulier, le mécanisme d’action d’un transporteur d’alkanes, AlkL, de P. putida a été examiné dans un environnement lipidique. La détermination de paramètres pour la dynamique rapide (ps-ns) et lente (μs-ms) du squelette peptidique de la protéine en présence ou en absence de substrat met en évidence des acheminements possibles pour le transfert de molécules vers la membrane et jette les bases pour une meilleure compréhension du processus. / Solid-state NMR with magic angle spinning (MAS) has emerged as a powerful technique for investigating structure and dynamics of insoluble or poorly soluble biomolecules. A number of approaches has been designed for reconstructing molecular structures from the accurate measurement of internuclear proximities, and for probing motions at atomic resolution over timescales spanning several orders of magnitude. Despite this impressive progress, however, MAS NMR studies are still far from routine. Complete determinations, which are often demonstrated on model microcrystalline preparations, are still rare when it comes to more complex systems such as non-crystalline amyloid fibrils or transmembrane proteins in lipid bilayers. My work aimed at extending the possibilities of MAS NMR for applications on complex biomolecular systems in different aggregation states. For this, I exploited the unique possibilities provided by high magnetic fields (700, 800 and 1000 MHz 1H Larmor frequency) in combination with the newest MAS probes capable of spinning rates exceeding 60 kHz. These experimental conditions al- low to boost the sensitivity of MAS NMR through 1H detection at high resolution and to enrich the palette of probes for protein dynamics. The first part of the thesis reports on my contribution to the development of new strategies for backbone resonance assignment, for structure elucidation, and for investigation of backbone and side-chain dynamics. These methodologies significantly reduce the requirements in terms of experimental time, sample quantities and isotopic labeling, and enlarge the molecular size of systems amenable to NMR analysis. The second part describes the application of 1H detected MAS NMR to evaluate the role of protein dynamics in problems such as amyloid fibril formation and membrane protein function. I first addressed the amyloid fibril formation propensity of human beta-2 microglobulin, the light chain of the major histocompatibility complex I. I performed comparative studies of backbone dynamics of the wild type protein as well as a D76N mutant in crystals, and determined some of the structural features of the fibrillar form. This allowed to identify the presence of pathological folding intermediates and to formulate hypotheses on the mechanism of fibrils formation. Finally, I studied the local and global dynamics of membrane proteins in lipid bilayers. In particular, I investigated the mechanism of action of the alkane trans- porter AlkL from P. putida in lipid bilayers. The measurement of parameters for fast (ps-ns) and slow (μs-ms) backbone dynamics of the protein in presence or in absence of a substrate highlights possible routes for molecular uptake and lays the basis for a more detailed mechanistic understanding of the process.
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Development of new high-throughput technology and combinatorial therapeutic strategy applicable to Huntington's disease and other amyloidoses / Développement de nouvelles technologie à haut débit et stratégie thérapeutique combinatoire applicables à la maladie de Huntington et d'autres amyloïdosesAviolat, Hubert 16 September 2015 (has links)
Moduler l’agrégation de protéines amyloïdes est thérapeutiquement pertinent (p. ex. la polyneuropathie amyloïde familiale traitée avec le Tafamidis). Cependant, pour de nombreuses amyloïdoses, il n’existe pas encore de modulateur d'agrégation efficace pour thérapie. Il a été récemment montré que combiner des composés qui modulent l’agrégation d’amyloïdes peut résulter en des effets synergiques. Une stratégie de criblage combinatoire, pour identifier des cocktails synergiques de composés, pourrait donc conduire à une percée thérapeutique pour de nombreuses amyloïdoses. Cependant, les technologies à haut débit existantes ne sont pas adaptées pour le criblage combinatoire.J’ai développé SynAggreg – une technologie in vitro à haut débit très sensible, précise, reproductible, peu coûteuse et flexible - qui permet d'identifier à la fois des inhibiteurs et des accélérateurs d'agrégation, de caractériser leur mécanisme d'action sur la cinétique d'agrégation et de les classer par leur efficacité. SynAggreg est également la première technologie adaptée au criblage combinatoire et pour l’étude d’effets synergiques de manière fiable. Enfin, cette nouvelle technologie peut être facilement adaptée à plusieurs amyloïdoses en remplaçant la partie amyloïde de la protéine de fusion par des techniques de biologie moléculaire. Ainsi, SynAggreg apparaît comme une boîte à outils pour la recherche fondamentale et appliquée et possède un fort potentiel de valorisation. / Modulating amyloid proteins aggregation is therapeutically relevant (e.g. the familial amyloid polyneuropathy treated with Tafamidis). However, for many amyloidoses, there is yet no efficient aggregation modulator for therapy. It was recently shown that combining compounds that modulate the aggregation of amyloids can result in synergistic effects. A combinatorial screening strategy to identify synergistic cocktails of compounds could thus lead to a therapeutic break through for many amyloidoses. However, existing high-throughput technologies are not adapted for combinatorial screening.I developed SynAggreg - a very sensitive, accurate, reproducible, cost effective, flexible and high-throughput in vitro technology - which allows identifying both aggregation inhibitors and accelerators, characterizing their mechanism of action on aggregation kinetics and ranking them by their efficiency. SynAggreg is also the first technology suitable for combinatorial screening and for studying reliably synergistic effects of combinations of compounds. Finally, this new technology can be easily adapted to several amyloidoses by replacing the amyloid part of the fusion protein with molecular biology techniques. Thus, SynAggreg appears as a toolbox for fundamental and applied research, and has a high potential for valorization.
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