La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative, elle représente 70% des formes de démences et affecte près de 860 000 personnes en France. Cette maladie est caractérisée par deux lésions neuropathologiques : les Dégénérescences neurofibrillaires et les Plaques séniles. Ces dernières sont principalement constituées de peptides amyloïdes (A&#946;) résultant du clivage d’une protéine membranaire appelée Précurseur du peptide amyloïde (APP). L’étude des formes familiales monogéniques a montré que des mutations des gènes de l’APP et des Présénilines 1 et 2 conduisaient systématiquement à une augmentation de la production d’A&#946;. Cette observation a permis l’élaboration de la cascade amyloïde plaçant le métabolisme de l’APP au centre du processus physiopathologique. Même si aujourd’hui ce métabolisme commence à être relativement bien connu, plusieurs zones d’ombres subsistent encore. Dans l’optique de caractériser de nouveaux acteurs intervenant dans ce métabolisme, nous avons émis une hypothèse qui repose sur deux constatations : (i) les protéines impliquées dans l’étiologie de la maladie sont différentiellement exprimées entre les cerveaux des patients et ceux des témoins (ii) dans le cerveau, de nombreuses métalloprotéases participent aux même mécanismes que l’APP (adhésion cellulaire, neuroinflammation, plasticité neuronale...), certaines sont aussi directement actrices du métabolisme de l’APP en tant qu’&#945;-sécrétase (ADAM9, ADAM10 et ADAM17) ou en dégradant l’A&#946; (NEP, IDE, MMP2, MMP3 et MMP9). Nous avons donc supposé que les métalloprotéases présentant une différence d’expression entre le tissu cérébral des malades et celui des témoins soient des candidates intéressantes pour moduler le métabolisme et le trafic de l’APP. Une première analyse transcriptomique par biopuce, à partir d’ARN totaux issus des cerveaux de 12 malades et de 12 témoins, nous a permis d’identifier quatre métalloprotéases présentant une différence d’expression significative (p<10-5) : ADAMTS16, ADAM17, ADAM30 et ADAM33. Nous avons cherché à confirmer ce résultat par une autre technologie sur un plus grand nombre d’échantillons (malades n=52 et témoins n=42). Seules ADAM30 et ADAM33 ont pu être validées. Nous avons également pu observer que l’expression d’ADAM30 dans le tissu cérébral des malades est inversement proportionnelle à la quantité d’A&#946;42 déposée dans la parenchyme (A&#946;42 la forme d’A&#946; la plus neurotoxique). De plus, au niveau cérébral, l’expression d’ADAM30 est restreinte aux neurones, cellules sièges du métabolisme de l’APP. Nous avons donc sélectionné ADAM30 comme intervenante potentielle dans le métabolisme de l’APP. Pour tester notre hypothèse, nous avons sous- et sur-exprimé ADAM30 dans deux modèles cellulaires différents. Nous avons mis en évidence que la sur-expression d’ADAM30 entraîne une diminution de l’ensemble des produits du métabolisme de l’APP. En mutant le site catalytique de cette protéase, nous avons remarqué que cette action sur le métabolisme de l’APP est dépendante de cette activité catalytique. De manière cohérente, une sous-expression d’ADAM30 entraîne une augmentation de l’ensemble des produits du métabolisme de l’APP. En utilisant les inhibiteurs alcalisant, nous avons démontré que l’effet d’ADAM30 sur le métabolisme de l’APP met en jeu la dégradation par le lysosome. Des expériences d’immunofluorescence ont attesté qu’ADAM30 est localisée dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi et qu’elle co-localise fortement avec l’APP dans ces organites. Au vu des résultats obtenus durant ces quatre années, nous pensons qu’ADAM30 pourrait être une protéine clé de la régulation de l’APP en inhibant son acheminement jusqu’à la membrane plasmique et en favorisant sa dégradation par le lysosome. [...] / Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder of the old age, characterized by the presence of two major neuropathological features : neurofibrillary tangles and senile plaques. These plaques are composed of the A&#946; peptides cleavage product of the amyloid precursor protein (APP). Proteolytic processing of APP is modulated by the action of enzymes &#945;-, &#946;- and &#947;-secretases with the latter two mediating the amyloidogenic pathway. Suggesting that processing of APP is a key step in the pathology of AD. However, even if extensively studied, this APP metabolism is still not fully characterized. With this background, we postulate that the characterization of new actors of the APP metabolism might help for a more subtle understanding of this APP metabolism and trafficking. We focused on the ADAMs and related proteins with the hypothesis that ADAMs and related proteins, under- or over-expressed in the brain of AD cases compared with the one of controls, may be of particular interest. Beyond the obvious implication of several ADAMs as &#945;-secretases, this hypothesis was also driven by several observations : (i) ADAMs have been involved in numerous biological processes including brain development, plasticity and repair as APP; (ii) several metalloproteases (MMP-2, -3 and -9) have been described to degrade A&#946; peptides. Using microarray to screen the expression of 117 ADAMs and MMPs was analyzed using total RNA extracted from cerebral tissue of 12 AD cases and 12 controls. We observed that 4 ADAMs were differentially expressed. We first confirmed that the ADAM30 expression was decreased in AD brains and we observed that ADAM30 under-expression was correlated with an increase in A&#946;42 deposition in AD brains. Consistently, over-expression of ADAM30 led to decrease APP metabolism and as a consequence, A&#946; secretion in two different cell lines (Moreover, under-expressed ADAM30 increases APP processing and A&#946; generation). This modification of the APP metabolism was directly linked to the ADAM30 catalytic properties. Our data suggest that catalytic activity of ADAM30 takes an important place in APP processing in a lysosome dependent manner and AD pathophysiological process.

No description available.

Systematic variation of membrane anchor, spacer and pharmacophore building blocks leads to an optimisation of the inhibitory effect of tripartite structures towards BACE1-induced cleavage of the amyloid precursor protein (APP). / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die Bildung von Amyloidablagerungen ist ein Kennzeichen der Alzheimerschen Erkrankung. Hauptbestandteil dieser senilen Plaques sind sogenannte A beta Peptide, die durch proteolytische Prozessierung aus einem Vorläufermolekül (APP) gebildet werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Klonierung des Meerschweinchen - APP. Diese cDNA-Sequenz zeigt auf DNA-Ebene eine Homologie zum Human-APP von ca. 90%, auf Proteinebene beträgt die Identität ca. 97 %. Damit wird ein weiterer experimenteller Beweis für die evolutionäre Konservierung des Amyloidvorläuferproteins in Säugetieren erbracht. APP mRNA wird in Meerschweinchen-Geweben ubiquitär exprimiert. Durch alternatives Spleißen wird ein zum Human-APP im wesentlichen ähnliches Isoformenmuster gebildet: Isoformen, welche eine Proteaseinhibitordomäne enthalten, werden dominierend in peripheren Organen exprimiert, dagegen ist im Zentralnervensystem das APP 695 mit über 60 % der Gesamttranskripte die bevorzugt exprimierte Isoform. Die klonierte cDNA des Meerschweinchen-APP wurde in prokaryontischen wie auch eukaryontischen Zellsystemen exprimiert. Dabei wurde die Eignung einer Anzahl von gegen Human-APP gewonnenen Antikörpern zur Detektion des Meerschweinchen-APP und seiner Prozessierungsprodukte gezeigt. Die Expression der neuronal dominierend exprimierten Isoform APP 695 des Meerschweinchen-APP in humanen Neuroblastom-Zellen zeigte keine Unterschiede hinsichtlich der APP-Prozessierung und A beta-Bildung im direkten Vergleich zu Human-APP 695. Die proteolytische Prozessierung des Proteins wurde durch Detektion der typischen Spaltprodukte in vivo (im Liquor) als auch in einem neu etablierten in vitro-Modell primär kultivierter neuronaler Zellen untersucht. Diese Zellkulturen wurden zunächst immunhistochemisch und biochemisch charakterisiert und als "mixed brain"-Typ mit einem hohen neuronalen Anteil beschrieben. Die Prozessierung des endogenen Meerschweinchen-APP in kultivierten Zellen führt dabei zur Bildung und Akkumulation aggregationsfähiger A beta - Peptide. Zur Detektion dieser Peptide wurde ein sensitiver Nachweis durch Western-Blot etabliert. Es wird damit ein Modellsystem für in vitro-Untersuchungen vorgeschlagen, welches ein Studium der Expression und Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins unter angenähert physiologischen Bedingungen ermöglicht. / A beta peptides, the major component of neuritic plaques found in the brains of patients with Alzheimer’s disease, are derived by proteolytic processing from a larger precursor molecule (amyloid precursor protein - APP). A combination of PCR methods was used to clone and sequence APP cDNA from guinea pig (Cavia porcellus). Guinea pig APP exhibits extensive similarities to human APP in terms of primary structure, mRNA expression of differentially spliced isoforms as shown by Northern blot and RT-PCR analysis as well as proteolytic processing to amyloidogenic A beta peptides. In contrast to rat and mouse APP, guinea pig APP - recombinantly expressed in human neuroblastoma-cells - was processed indistinguishable from human APP thus excluding intrinsic sequence-specific factors influencing processing. Further studies were performed using newly established primary cell cultures of guinea pig neurons. Refined methods have been used to detect and characterize major proteolytic processing products of APP in vitro and in vivo. In conclusion, guinea pigs provide a model to study expression and processing of APP that closely resembles the physiological situation in humans and should, therefore, be important in elucidating potential strategies to prevent amyloid formation in Alzheimers Disease.

Une des caractéristiques histopathologiques de la maladie d'Alzheimer (AD) est la présence de plaques amyloïdes formées par les peptides amyloïdes β (Aβ) de 40 et 42 résidus, qui sont les produits de clivage par des protéases de l'APP. Afin de comprendre le rôle des variations structurelles du TM dans le traitement de l'APP, les peptides APP_TM4K ont été étudiés dans la bicouche lipidique en utilisant l’ATR-FTIR et ssNMR. Tandis que la structure secondaire globale du peptide APP_TM4K est hélicoidale, hétérogénéité de conformation et d'orientation a été observée pour le site de clivage γ et , que peuvent avoir des implications dans le mécanisme de clivage et donc dans la production d’Aβ. Les peptides Aβ s'agrègent pour produire des fibrilles et aussi de manière transitoire d'oligomères neurotoxiques. Nous avons constaté qu'en présence de Ca2+, l’Aβ (1-40) forme de préférence des oligomères, tandis qu'en absence de Ca2+ l'Aβ (1-40) s’agrège sous forme de fibrilles. Dans les échantillons sans Ca2+, l’ATR-FTIR révèle la conversion des oligomères en feuillets β antiparallèles en la conformation caractéristique des fibrilles en feuillets β parallèles. Ces résultats nous ont amené à conclure que les Ca2+ stimulent la formation d'oligomères d'Aβ (1-40), qui sont impliqués dans l’AD. Les positions et une orientation précise de deux nouveaux médicaments puissants modulateurs de la γ-sécrétase - le benzyl-carprofen et le sulfonyl-carprofen  dans la bicouche lipidique, ont été obtenus à partir des expériences des ssNMR. Ces résultats indiquent que le mécanisme probable de modulation du clivage par la y-sécrétase est une interaction directe avec le domaine TM de l’APP. / A histopathological characteristic of Alzheimer’s disease (AD) is the presence of amyloid plaques formed by amyloid β(A) peptides of 40 and 42 residues-long, which are the cleavage products of APP by proteases. To understand the role of structural changes in the TM domain of APP, APP_TM4K peptides were studied in the lipid bilayer using ATR-FTIR and ssNMR. While the overall secondary structure of the APP_TM4K peptide is helical, conformational and orientational heterogeneity was observed for the y- and for the -cleavage sites, which may have implications for the cleavage mechanism and therefore the production of Aβ. Starting from its monomeric form, Aβ peptides aggregate into fibrils and / or oligomers, the latter being the most neurotoxic. We found that in the presence of Ca2 +, Aβ (1-40) preferably forms oligomers, whereas in the absence of a2 + Aβ (1-40) aggregates into fibrils. In samples without Ca2 +, ATR-FTIR shows conversion from antiparallel β sheet conformation of oligomers into parallel β sheets, characteristic of fibrils. These results led us to conclude that Ca2 +stimulates the formation of oligomers of Aβ (1-40), that have been implicated in the pathogenesis of AD. Position and precise orientation of two new drugs  powerful modulators of γ-secretase  benzyl-carprofen and carprofen sulfonyl  in the lipid bilayer were obtained from neutron scattering and ssNMR experiments. These results indicate that carprofen-derivatives can directly interact with APP. Such interaction would interfere with proper APP-dimer formation, which is necessary for the sequential cleavage by β -secretase, diminishing or greatly reducing Aβ42 production.

Les mécanismes de type prion sont désormais reconnus comme sous-tendant la plupart des maladies neurodégénératives humaines, avec en premier lieu la maladie d’Alzheimer (MA) au niveau de ses 2 marqueurs spécifiques, l’amyloïde β (Aβ à l’origine de l’hypothèse étiopathogénique de la cascade amyloïde) et la protéine Tau phosphorylée. Par ailleurs la protéine du prion (PrPC) est décrite comme interagissant à de multiples niveaux avec le métabolisme de l’Aβ sans que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents n’aient pu être expliqués. Pour sortir de l’impasse actuelle concernant le développement d’approches thérapeutiques efficaces pour la MA, l’industrie pharmaceutique a besoin de modèles expérimentaux innovants. En effet, à ce jour aucun modèle in vivo, en dépit des progrès réalisés avec les souris transgéniques, n’arrive à refléter la complexité cérébrale humaine ni à mimer une MA clinique. Les cultures in vitro en 2D sont quant à elles très éloignées des situations conduisant à l’accumulation d’agrégats protéiques pathologiques. Le but de notre thèse a été d’utiliser dans le domaine des neurosciences les nouvelles perspectives de recherche ouvertes par les technologies des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en développant un modèle de différentiation en 3D pour obtenir des organoïdes cérébraux humains (OC) (mini cerveaux). Leur capacité d’auto-organisation en 3D de tissu neuroectodermique nous a permis de recréer un système complexe mimant différentes structures cérébrales humaines dans lesquelles nous avons pu caractériser les marqueurs attendus. L’étude de l’expression des protéines d’intérêt APP et PrPC pendant la différentiation neurale a permis de caractériser la modulation des niveaux des deux protéines en fonction du temps de culture. Afin d’orienter le modèle vers des mécanismes d’accumulation protéique de type MA, nous avons testé différents inducteurs chimiques dont l’Aftin-5 qui est capable de moduler les voies post-traductionnelles de l’APP. Plusieurs stratégies de traitement ont été adoptées pour induire le clivage de l’APP et la génération d’Aβ. La production des fragments solubles Aβ38, Aβ40, Aβ42 a été mise en évidence par ELISA. Les niveaux générés sont reproductibles et l’augmentation du ratio Aβ42/Aβ40 est cohérente avec les données extrapolées des modèles murins et humains, ce qui a permis de valider notre modèle. Les niveaux d’expression génique et protéique de PrPC et de APP suite au traitement ont été analysés afin de mieux déterminer le rôle de l’interaction entre ces deux facteurs. L’objectif à long terme consiste à améliorer ce modèle, dont les limites actuelles sont notamment l’absence de vascularisation et le niveau de maturation du tissu neural. Le défi majeur dans le cadre de la culture des OC consiste donc à favoriser l’intégration du système vasculaire, et par ailleurs à accélérer le vieillissement in vitro pour l’étude de maladies neurodégénératives. La perspective de pouvoir automatiser le système de culture des OC permet d’envisager l’utilisation de ce modèle à plus grande échelle dans le cadre de test de cytotoxicité et/ou de criblage pharmacologique à haut débit pour identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour la MA. / Prion-like mechanisms are known to underlie most of human neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by two important pathological markers, β amyloid (or Aβ at the origin of the etiopathogenic amyloid cascade hypothesis) and phosphorylated tau protein. Furthermore, the prion protein (PrPC) interacts at multiple levels with the metabolism of Aβ, by mechanisms which are not well understood. To overcome the current limits in the development of efficient strategies to treat AD, the pharmaceutical industry requires innovative experimental models. However, even if a lot of progress has been achieved by using transgenic mouse models, to date no in vivo model can reflect the complexity of human brain or reproduce a clinical context. 2D in vitro cell culture models are unable to allow the aggregation and accumulation of pathological proteins as observed in vivo. The aim of this study consists in taking advantage of the research prospects offered by induced pluripotent stem cell (iPSCs) in the field of neurosciences. iPSCs can be used to generate 3D models of differentiation also called human cerebral organoids or mini-brains (MBs). Their ability to self-organise in 3D neuroectodermic tissue leds to a complex system that mimics different human cerebral structures in which we were able to characterize the expected markers. The study of the two proteins of interest (APP and PrPC) during neural differentiation has allowed us to follow the modulation of protein expression level occurring during the in vitro development of the human MBs. In order to use this model to reproduce the protein accumulation mechanisms seen in AD, we have tested chemical inductors such as Aftin-5 in order to modulate the APP post-transcriptional pathway towards a pathological outcome. Many strategies of treatment are adopted to lead APP cleavage and Aβ generation. The production of soluble fragments Aβ38, Aβ40, Aβ42 in the supernatant of organoids has been showed using ELISA technique. The levels generated are reproducible and the increase of Aβ42/Aβ40 ratio is consistent with extrapolated data from mouse and human models thus validating our model. Analysis at the gene and protein level has been assessed in order to understand the interaction between PrPC and APP after treatment. The long-term goal consists in improving this model which is notably hampered by the absence of vascularization and the low level of maturation of the neural tissue. The main challenge in MB culture thus consists in the integration of the vascular system, and also in increasing the speed of ageing process in vitro for the study of neurodegenerative diseases. In the long term, the prospect of automating the culture of MBs would allow the use of the system for cytotoxicity testing and/or high throughput screening for the discovery of new drugs for AD.