Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Introduction : La majorité des enfants ayant l’anémie falciforme (AF) sont déficients en vitamine D. Cette déficience causerait ou exacerberait possiblement les complications de l’AF telles que les crises de douleur et les complications osseuses. Nous avons récemment publié que près de 70% des enfants suivis à notre clinique d’AF étaient déficients en vitamine D (<50 nmol/L), que ceux-ci avaient de faibles apports alimentaires en vitamine D et prenaient peu de suppléments. Cliniquement, les enfants déficients en vitamine D avaient un moins bon profil hématologique que les enfants suffisants en vitamine D. Ces résultats nous ont amené à proposer une intervention pour résoudre ces problèmes. Objectifs : Primaires : Évaluer la faisabilité, l’acceptabilité et la sécurité d’un bolus oral de 300 000 UI de vitamine D3, chez les enfants ayant l’AF, combiné à une supplémentation quotidienne de 1 000 UI de vitamine D3 pour 3 mois. Secondaires : Évaluer le changement des taux sériques de 25(OH)D après 3 mois ainsi que les impacts cliniques d’une telle supplémentation. Méthode : Des enfants avec AF (5 à 17 ans, tous les génotypes) ont été randomisés à un bolus oral de vitamine D3 (300 000 UI) ou à un placebo. Tous les enfants ont également reçu une prescription pour des comprimés de 1 000 UI vitamine D3 à prendre quotidiennement. La 25(OH)D sérique a été mesurée au début de l’étude et 3 mois post-bolus (efficacité de l’intervention). Les autres paramètres mesurés lors de l’étude étaient le ratio calcium/créatinine urinaire et le calcium sérique (sécurité), la douleur musculosquelettique, la qualité de vie, l’hématologie et les marqueurs osseux (paramètres cliniques exploratoires). Résultats : Trente-huit enfants ont participé à l’étude (âge moyen de 10,1 +/- 3,6 ans; 63% HbSS, 29% HbSC et 8% S/β thal+) : 18 ont reçu le bolus de vitamine D et 20 le placebo. Au début de l’étude, les niveaux moyens de 25(OH)D étaient de 75 +/- 27 nmol/L et 50% des enfants étaient insuffisants en vitamine D (<75 nmol/L). Chez les enfants ayant pris le bolus, les taux de 25(OH)D se sont élevés à 94 nmol/L après 3 mois et le taux d’insuffisance en vitamine D est descendu à 17%, alors que pour le placebo, les taux de 25(OH)D post 3 mois étaient de 74 +/- 19 nmol/L et le taux d’insuffisance en vitamine D était de 45% (p=0,001). Aucun épisode d’hypercalcémie, d’hypercalciurie ou d’hypervitaminose D (>250 nmol/L) n’a eu lieu durant l’étude, mais les enfants du groupe bolus ont expérimenté plus de symptômes gastro-intestinaux dans le premier mois suivant l’ingestion du bolus, comparativement au groupe placebo. Le décompte de réticulocytes était plus faible à la fin de l’étude pour les enfants du groupe bolus. Aucun autre effet clinique de l’intervention n’a été observé. Conclusion : L’utilisation d’un bolus de vitamine D à haute dose combiné à une supplémentation quotidienne en vitamine D chez des enfants ayant l’AF était plus efficace à élever les taux de 25(OH)D à des taux supérieurs à 75 nmol/L que la supplémentation quotidienne seule. Des études multicentriques à plus grande échelle et de plus longue durée sont nécessaires afin d’évaluer les effets cliniques d’une telle supplémentation. / Background: Most children with sickle cell disease (SCD) are vitamin D deficient. This deficiency could possibly cause or exacerbate SCD complications such as pain crisis and bone complications. We previously showed that nearly 70% of children followed in our SCD Clinic were vitamin D deficient (<50 nmol/L) with low vitamin intake and poor use of supplements. Clinically, worse hematological profile was seen in vitamin D-deficient children compared to vitamin D-sufficient children. This study was designed to overcome these issues. Objectives: Primary objectives were to assess feasibility, acceptability, and safety of a single oral bolus of 300,000 IU of vitamin D3 combined to daily 1,000 IU vitamin D3 for 3 months in children with SCD. Secondary objectives were to asses the mean change in serum 25(OH)D from baseline to 3 months post-bolus and its clinical impact. Procedure: A randomized controlled trial was carried out in children with SCD (5-17 years, all genotypes). Children were randomized to a single bolus of vitamin D3 (300,000 IU) or placebo and also received prescription for daily 1,000 IU vitamin D3. Serum 25OHD (efficacity outcome) was measured at baseline and 3 months post-bolus. Other outcomes measured were urinary calcium/creatinine ratio and serum calcium (safety), musculoskeletal pain, quality of life as well as hematology and bone markers (exploratory outcomes). Results: Thirty-eight children were randomized to received the vitamin D bolus (n=18) or the placebo (n=20) (mean age 10.1 +/- 3.6 years; 63% HbSS, 29% HbSC and 8% S/β thal+). At baseline, 50% of the children were vitamin D insufficient (<75 nmol/L) and mean serum 25(OH)D levels were 75 +/- 27 nmol/L. In the vitamin D bolus group, insufficiency dropped to 17% post 3 months and mean 25(OH)D levels raised to 94 nmol/L. In children who took the placebo, rates of vitamin D insufficiency were 45% and mean 25(OH)D levels were 74 +/-19 nmol/L post 3 months (p=0.001). The vitamin D bolus caused no hypercalcemia, hypercalciuria nor hypervitaminosis D (>250 nmol/L). However compared to the placebo group, more children in the bolus group experienced gastro-intestinal symptoms within the first month following the vitamin D bolus. As for the hematology parameters, only a slight difference in reticulocytes counts was observed with lower reticulocytes count the end of the study in children from the bolus group. No other clinical effects of the intervention were observed. Conclusions: High-dose vitamin D bolus combined to daily supplementation in children with SCD is more efficient than daily supplementation alone to raise 25(OH)D levels ≥75 nmol/L. Large-scale multicenter studies of longer duration are needed to assess whether this intervention can improve clinical outcomes of children with SCD.

L’anémie falciforme est une maladie monogénique causée par une mutation dans le locus de la β-globine. Malgré le fait que l’anémie falciforme soit une maladie monogénique, cette maladie présente une grande hétérogénéité clinique. On présume que des facteurs environnementaux et génétiques contribuent à cette hétérogénéité. Il a été observé qu’un haut taux d’hémoglobine fœtale (HbF) diminuait la sévérité et la mortalité des patients atteints de l’anémie falciforme. Le but de mon projet était d’identifier des variations génétiques modifiant la sévérité clinique de l’anémie falciforme. Dans un premier temps, nous avons effectué la cartographie-fine de trois régions précédemment associées avec le taux d’hémoglobine fœtale. Nous avons ensuite effectué des études d’association pan-génomiques avec deux complications cliniques de l’anémie falciforme ainsi qu’avec le taux d’hémoglobine fœtale. Hormis les régions déjà identifiées comme étant associées au taux d’hémoglobine fœtale, aucun locus n’a atteint le niveau significatif de la puce de génotypage. Pour identifier des groupes de gènes modérément associés au taux d’hémoglobine fœtale qui seraient impliqués dans de mêmes voies biologiques, nous avons effectué une étude des processus biologiques. Finalement, nous avons effectué l’analyse de 19 exomes de patients Jamaïcains ayant des complications cliniques mineures de l’anémie falciforme. Compte tenu de la taille des cohortes de réplication disponibles, nous n’avons pas les moyens de valider statistiquement les variations identifiées par notre étude. Cependant, nos résultats fournissent de bons gènes candidats pour des études fonctionnelles et pour les réplications futures. Nos résultats suggèrent aussi que le β-hydroxybutyrate en concentration endogène pourraient influencer le taux d’hémoglobine fœtale. De plus, nous montrons que la cartographie-fine des régions associées par des études pan-génomiques peut identifier des signaux d’association additionnels et augmenter la variation héritable expliquée par cette région. / Sickle cell disease is a monogenic disease caused by a mutation in the β-globin locus. Although it is a monogenic disease, it shows a high clinical heterogeneity. Environmental and genetic factors are thought to play a role in this heterogeneity. It has been observed that a high fetal hemoglobin (HbF) levels correlates with a diminution of the severity and mortality of patients with sickle cell disease. The goal of my project was to identify genetic modifiers of the clinical severity of sickle cell disease. First, I performed the fine-mapping of three regions previously associated with HbF levels. Second, I performed genome-wide association studies with two clinical complications of sickle cell disease as well as with HbF levels. Since no new loci reached array-wide significance for HbF levels, I performed a pathway analysis to identify additional HbF loci of smaller effect size that might implicate shared biological processes. Finally, I performed the analysis of 19 whole exomes from Jamaican sickle cell disease patients with very mild complications. In conclusion, given the sample size of the replication cohorts available, we do not currently have the means to statistically validate the association signals. However, these results provide good candidate genes for functional studies and for future replication. Our results also suggest that β-hydroxybutyrate in endogenous levels could influence HbF levels. Furthermore, we show that fine-mapping the loci associated in genome-wide association studies can identify additional signals and increase the explained heritable variation.

Contexte : L’anémie falciforme ou drépanocytose est un problème de santé important, particulièrement pour les patients d’origine africaine. La variation phénotypique de l’anémie falciforme est problématique pour le suivi et le traitement des patients. L’architecture génomique responsable de cette variabilité est peu connue. Principe : Mieux saisir la contribution génétique de la variation clinique de cette maladie facilitera l’identification des patients à risque de développer des phénotypes sévères, ainsi que l’adaptation des soins. Objectifs : L’objectif général de cette thèse est de combler les lacunes relatives aux connaissances sur l’épidémiologie génomique de l’anémie falciforme à l’aide d’une cohorte issue au Bénin. Les objectifs spécifiques sont les suivants : 1) caractériser les profils d’expressions génomiques associés à la sévérité de l’anémie falciforme ; 2) identifier des biomarqueurs de la sévérité de l’anémie falciforme ; 3) identifier la régulation génétique des variations transcriptionelles ; 4) identifier des interactions statistiques entre le génotype et le niveau de sévérité associé à l’expression ; 5) identifier des cibles de médicaments pour améliorer l’état des patients atteints d’anémie falciforme. Méthode : Une étude cas-témoins de 250 patients et 61 frères et soeurs non-atteints a été menée au Centre de Prise en charge Médical Intégré du Nourrisson et de la Femme Enceinte atteints de Drépanocytose, au Bénin entre février et décembre 2010. Résultats : Notre analyse a montré que des profils d’expressions sont associés avec la sévérité de l’anémie falciforme. Ces profils sont enrichis de génes des voies biologiques qui contribuent à la progression de la maladie : l’activation plaquettaire, les lymphocytes B, le stress, l’inflammation et la prolifération cellulaire. Des biomarqueurs transcriptionnels ont permis de distinguer les patients ayant des niveaux de sévérité clinique différents. La régulation génétique de la variation de l’expression des gènes a été démontrée et des interactions ont été identifiées. Sur la base de ces résultats génétiques, des cibles de médicaments sont proposées. Conclusion: Ce travail de thèse permet de mieux comprendre l’impact de la génomique sur la sévérité de l’anémie falciforme et ouvre des perspectives de développement de traitements ciblés pour améliorer les soins offerts aux patients. / Background: Sickle Cell Disease (SCD) is an important public health issue, particularly in Africa. Phenotypic heterogeneity of SCD is problematic for follow-up and treatment of patients. Little is known about the underlying genomic architecture responsible for this variation. Rationale: Understanding the genetic contribution to the inter-patient variability will help in identifying patients at risk of developing more severe clinical outcomes, as well as help guide future developments for treatment options. Objectives: To characterize genome-wide gene expression patterns associated with SCD clinical severities and to identify genetic regulators of this variation. More specifically, our objectives were to associate gene expression profiles with SCD severity, identify transciptional biomarkers, characterise the genetic control of gene expression variation, and propose drug targets. Methods: A case-control population of 250 SCD patients and 61 unaffected siblings from the National SCD Center in Benin were recruited. Genome-wide gene expression profiles and genotypic data were generated. Results: Genome-wide gene expression patterns associated with SCD clinical variation were enriched in B-lymphocyte development, platelet activation, stress, inflammation and cell proliferation pathways. Transcriptional biomarkers that can discriminate SCD patients with respect to clinical severities were identified. Hundreds of genetic regulators were significantly associated with gene expression variation and potential drug targets are suggested. Conclusion: This work improves our understanding of the biological basis of SCD clinical variation and has the potential to guide development of targeted treatments for SCD patients.

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Les études d’association pan-génomiques ont révélé plusieurs variants génétiques associés à des traits complexes. Les mesures érythrocytaires ont souvent fait l’objet de ce genre d’études, étant mesurées de façon routinière et précise. Comprendre comment les variations génétiques influencent ces phénotypes est primordial étant donné leur importance comme marqueurs cliniques et leur influence sur la sévérité de plusieurs maladies. En particulier, des niveaux élevés d’hémoglobine fœtal chez les patients atteints d’anémie falciforme est associé à une réduction des complications et une augmentation de l’espérance de vie. Néanmoins, la majorité des variants génétiques identifiés par ces études tombent à l’intérieur de régions génétiques non-codantes, augmentant la difficulté d’identifier des gènes causaux. L’objectif premier de ce projet est l’identification et la caractérisation de gènes influençant les traits complexes, et tout particulièrement les traits sanguins. Pour y arriver, j’ai tout d’abord développé une méthode permettant d’identifier et de tester l’effet de gènes knockouts sur les traits anthropométriques. Malgré un échantillon de grande taille, cette approche n’a révélé aucune association. Ensuite, j’ai caractérisé le méthylome et le transcriptome d’érythroblastes différentiés à partir de cellules souches hématopoïétiques et identifié plusieurs gènes potentiellement impliqués dans les programmes érythroïdes fœtaux et adultes. Par ailleurs, j’ai identifié plusieurs micro-ARNs montrant des motifs d’expression spécifiques entre les stages fœtaux et adultes et qui sont enrichis pour des cibles exprimées de façon opposée. Finalement, j’ai identifié plusieurs variants génétiques associés à l’expression de gènes dans les érythroblastes (eQTL). Cette étude a permis d’identifier des variants associés à l’expression du gène ATP2B4, qui encode le principal transporteur de calcium des érythrocytes. Ces variants, qui sont également associés à des traits sanguins et à la susceptibilité à la malaria, tombent dans un élément d’ADN spécifique aux cellules érythroïdes. La délétion de cet élément par le système CRISPR/Cas9 induit une forte diminution de l’expression du gène et une augmentation des niveaux de calcium intracellulaires. En conclusion, des échantillons de génotypages exhaustifs seront nécessaires pour étudier l’effet de gènes knockouts sur les traits complexes. Les érythroblastes montrent de grandes différences au niveau de leur méthylome et transcriptome entre les différents stages développementaux. Ces différences influencent potentiellement la régulation de l’hémoglobine fœtale et impliquent de nombreux micro-ARNs et régions régulatrices non-codantes. Finalement, l’exemple d’ATP2B4 montre qu’intégrer des études épigénomiques, transcriptomiques et des expériences d’édition de génome est une approche puissante pour caractériser des variants génétiques non-codants. Par ailleurs, ces résultats impliquent ATP2B4 dans l’hydratation des érythroblastes, qui est associé à la susceptibilité à la malaria et la sévérité de l’anémie falciforme. Cibler ATP2B4 de façon thérapeutique pourrait avoir un impact majeur sur ces maladies qui affectent des millions d’individus à travers le monde. / Genome-wide association studies (GWAS) have revealed several genetic variants associated with complex phenotypes. This is the case for red blood cell (RBC) traits, which are particularly amenable to GWAS as they are routinely and accurately measured. Understanding RBC trait variation is important given their significance as clinical markers and modifiers of disease severity. Notably, increased fetal hemoglobin (HbF) production in sickle cell disease (SCD) patients is associated with a higher life expectancy and decreased morbidity. Nonetheless, most variants identified through GWAS fall in non-coding regions of the human genome, increasing the difficulty of identifying causal links. The main goal of this project was to identify and characterize genes influencing complex traits, and in particular RBC phenotypes. First, I developed an approach to identify and test potential gene knockouts affecting anthropometric traits in a large sample from the general population, which did not yield significant associations. Then, I characterized the DNA methylome and transcriptome of erythroblasts differentiated ex vivo from hematopoietic progenitor stem cells (HPSC), and identified several genes potentially implicated in fetal and adult-stage erythroid programs. I also identified microRNAs (miRNA) that show specific developmental expression patterns and that are enriched in inversely expressed targets. Finally, I mapped expression quantitative trait loci (eQTL) in erythroblasts, and identify erythroid-specific eQTLs for ATP2B4, the main calcium ATPase of RBCs. These genetic variants are associated with RBC traits and malaria susceptibly, and overlap an erythroid-specific enhancer of ATP2B4. Deletion of this regulatory element using CRISPR/Cas9 experiments in human erythroid cells minimized ATP2B4 expression and increased intracellular calcium levels. In conclusion, large and comprehensive genotyping datasets will be necessary to test the role of rare gene knockouts on complex phenotypes. The transcriptomes and DNA methylomes of erythroblasts show substantial differences correlating with their developmental stages and that may be implicated in HbF production. These results also suggest a strong implication of erythroid enhancers and miRNAs in developmental stage specificity. Finally, characterizing the erythroid-specific enhancer of ATP2B4 suggest that integrating epigenomic, transcriptomic and gene editing experiments can be a powerful approach to characterize non-coding genetic variants. These results implicate ATP2B4 in erythroid cell hydration, which is associated with malaria susceptibility and SCD severity, suggesting that therapies targeting this gene could impact diseases affecting millions of individuals worldwide.