Lors de l'analyse physico-chmique d'un échantillon d'une substance multi-composantes par des techniques spectroscopiques, les signaux mesurés sont des mélanges linéaires des spectres purs des différentes composantes de cette substance. L'objectif de l'analyse est d'identifier la composition de la substance via l'estimation des spectres purs et la détermination de leurs concentrations. C'est un problème de séparation de sources dans lequel les spectres purs sont les signaux sources et les coefficients de mélange permettent de déduire les proportions des différentes composantes. La contrainte principale est la non-négativité des signaux sources et des coefficients de mélange. Il s'agit donc d'un problème de séparation de sources non-négatives.<br /><br />La séparation de sources est un problème fondamental en traitement du signal dont une hypothèse forte est celle de l'indépendance statistique des signaux sources. Compte tenu du recouvrement entre les spectres purs, leur corrélation mutuelle devient parfois importante. Dans une telle situation, l'application d'une méthode fondée sur l'hypothèse d'orthogonalité s'avère infructueuse. Par ailleurs, une analyse des solutions admissibles sous la contrainte de non-négativité montre que cette contrainte toute seule ne permet d'obtenir une solution unique que dans certains cas particuliers. Ces deux constats motivent le développement de deux méthodes qui considèrent conjointement l'hypothèse d'indépendance et l'information de non-négativité. La première méthode est issue de l'approche de séparation par maximum de vraisemblance et la deuxième se fonde sur une inférence bayésienne. Une évaluation numérique des performances des méthodes développées à l'aide de données synthétiques et le traitement de signaux expérimentaux permettent, d'une part, de mettre en évidence les avantages de ces méthodes par rapport aux approches usuelles et, d'autre part, de déceler leurs limitations. Des applications au traitement de signaux réels issus de trois types de spectroscopies (Infrarouge, Raman et Ultraviolet-Visible) illustrent l'apport de la séparation de sources non-négatives à l'analyse physico-chimique.