O excesso de adenina na dieta (ADE) promove precipitação intrabular de cristais, levando a uma nefrite intersticial progressiva com perda de função renal. Estudo recente demonstrou que esse processo requer ativação do sistema NF-kB. No presente estudo investigamos o possível envolvimento de outros componentes da imunidade inata, além do NF-kB. Verificamos também a hipótese de que a nefropatia associada aos cristais continua a progredir mesmo depois de cessada a sobrecarga de adenina. Foram estudados ratos Munich-Wistar machos e adultos sem tratamento (C) ou recebendo 0.5% de ADE na dieta. Após 1 semana, a ADE foi removida da dieta e os animais foram seguidos por 4 ou 24 semanas. A administração de ADE por 1 semana promoveu uma inflamação intersticial aguda, com perda de função renal, alteração da pressão caudal, sem alterações glomerulares. Os mediadores da imunidade inata, como TLR2, TLR4, inflamassoma NLRP3, IL1beta e IL-6, apresentaram-se ativados sem, no entanto, ativar o sistema NF-kB. Após cessada a sobrecarga de ADE, a inflamação persistiu, com infiltração por macrófagos, expressão elevada de AngII, deposição progressiva de colágeno e, na fase mais tardia, glomeruloesclerose, caracterizando um processo inflamatório crônico, autônomo, que não contou com a participação do eixo NLR/IL1beta. Em contraste, o sistema NF-kB foi ativado, sendo um dos possíveis estímulos a produção intra-renal de AngII. Dois mecanismos patogênicos podem ser identificados neste estudo: 1) agudo, associado à ativação do eixo NLR-IL1beta; 2) crônico, associado à produção de AngII renal e à ativação do sistema NF-kB / Excess adenine in the diet (ADE) promotes intratubular crystal precipitation, leading to progressive interstitial nephritis and loss of renal function. A recent study has shown that this process requires activation of the NF-kB system. In the present study we investigated the possible involvement of other components of innate immunity, in addition to NF-kB, as well as whether nephropathy associated with excess adenine continues to progress even after dietary cessation. Male Munich-Wistar rats without treatment (C) or receiving 0.5% of ADE in the diet were studied. After 1 week, ADE was removed from the diet and the animals were followed for 4 or 24 weeks. Administration of ADE for 1 week promote acute interstitial inflammation, with loss of renal function, alteration of caudal pressure, without glomerular changes. Mediators of innate immunity, such as TLR2, TLR4, NLRP3 inflamassome, IL1beta and IL-6 , were shown to be activated, with no apparent activation of the NF-kB system. In the late phases of the model, the inflammation persisted, with significant infiltration by macrophages, high expression of AngII, progressive collagen deposition and glomerulosclerosis, characterizing a chronic, autonomic inflammatory process that did not involve the participation of the NLR/IL1beta axis. By contrast, the NF-kB system was activated, with intra-renal AngII production as a possible stimulus. Two mechanisms operated this study: 1) an acute one, associated with activation of the NLR-IL1beta axis; 2) a chronic one, associated with intrarenal AngII production and NF-kB activation

Peptídeos bioativos são de grande interesse tanto para a indústria farmacêutica como para a de alimentos e são obtidos a partir da hidrólise enzimática de várias fontes protéicas, como as do leite, glúten de milho, soja, e músculos de suínos, aves e peixes. Estes peptídeos podem desempenhar atividades benéficas para a saúde, entre elas, a regulação ou inibição de enzimas, com destaque à inibição da enzima conversora da angiotensina I (ECA). Esta enzima é responsável pela clivagem de dois importantes substratos envolvidos na regulação da pressão arterial, a angiotensina I e a bradicinina. Neste trabalho foi estudada a atividade inibitória da ECA em hidrolisados dos peixes tilápia tailandesa (Oreochromis niloticus - linhagem tailandesa) e corvina (Micropogonias furnien) . Os \"minced\" destes peixes foram hidrolisados com pepsina e proteases de Streptomyces griséus por 5 horas em condições ideais de pH e temperatura. A atividade inibitória foi avaliada pela medida da atividade residual da enzima sobre substrato sintético fluorescente. Os hidrolisados com um grau de hidrólise de cerca de 34% apresentaram atividade inibitória semelhante, com valor de IC50 = 0,040 e 0,036 mg proteína/mL, respectivamente para a tilápia e a corvina. Observou-se aumento da atividade inibitória com o progresso da hidrólise, sendo que este aumento também está relacionado com a especificidade das enzimas proteolíticas. Em outro experimento observou-se que os peptídeos presentes no hidrolisado de tilápia inibiram indistintamente os domínios C e N terminais da ECA, não demonstrando especificidade. A atividade inibitória dos hidrolisados foi mantida após submetê-los à ação de enzimas proteolíticas gastrointestinais, indicando a sua provável estabilidade \"in vivo\". Da mesma forma, o minced de tilápia quando incubado sucessivamente com pepsina/tripsina/quimotripsina produziu peptídeos ativos (IC50 = O,025mg proteína/mL). Apesar do reduzido grau de hidrólise obtido neste ensaio (17%), os peptídeos liberados apresentaram atividade inibitória elevada, confirmando que a atividade não está relacionada apenas com o grau de hidrólise, mas também com a sequência de aminoácidos, liberados em função da especificidade das enzimas. Concluiu-se que o consumo destes peixes, ou seus respectivos hidrolisados poderá eventualmente, auxiliar na prevenção e no tratamento não medicamentoso da hipertensão, embora estudos \"in vivo\" sejam necessários para comprovar as suas funções biológicas. / Bioactive peptides have been highly valued by pharmaceutical industries and by food industries as well. These peptides can be released by the enzymatic hydrolysis of various protein sources such as milk, com gluten, soybean, muscles of pigs, chicken and fish and have been recognized to exhibit important health benefits. Among these, the regulation or inhibition of enzymes, like the inhibition of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) have been focused. This enzyme is responsible for the cleavage of two important substrates, angiotensin I and bradykinin, both of them involved with the regulation of blood pressure. In this study the inhibitory activity of hydrolysates from tilapia tailandesa (Oreochromis niloficus - linhagem tailandesa) and corvina (Micropogonias furnien) was evaluated. The hydrolysates of the minced fishes were produced in a 5-hour lasting controlled process under optimal conditions of pH and temperature by the sequential action of pepsin and enzymes from Streptomyces griseus. Inhibitory activity was evaluated by measuring the residual activity of the enzyme on a synthetic fluorescent peptidic substrate. The extent of hydrolysis was about 34% and the hydrolysates of tilapia and corvine showed similar inhibitory activity (IC50 of 0.040 and 0.036 mg protein/mL), respectively. An íncrease of activity proportional to the degree of hydrolysis was observed, as well as a relationship with the specificity of the enzymes used. In another experiment it was observed that the bioactive peptides present in the hydrolysate of tilapia did not show specificity for the C- and N-terminal catalytic domains of the angiotensin I-converting enzyme. The inhibitory activity of the hydrolysates was still active afier a further hydrolysis by gastrointestinal enzymes, which seems to indicate an eventual activity in vivo. In a similar way, when the minced tilapia was consecutively incubated with pepsine, trypsin, chymotrypsin active peptides were produced with an activity of IC50 = 0.025 mg protein/mL. Despite the low extend of hydrolysis of about 17%, a high inhibitory activity was observed confirming that activity is not only related to the degree of hydrolysis but also to the sequence of aminoacids and therefore, to the specificity of the enzymes as well. It was concluded that the intake of fish or fish hydrolysates has the potential to help control or to prevent hypertension by a non-drug food-based treatment.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A angiotensina II (Ang II), um dos mais relevantes peptídeos angiotensinérgicos, tem um importante papel na fisiologia e na fisiopatologia dos tecidos renal e cardíaco. Existem diversas enzimas capazes de gerar Ang II. Uma delas é a tonina, capaz de formar a Ang II a partir da angiotensina I (Ang I) ou diretamente do AGT. Nosso objetivo foi caracterizar o RAS no rim e no coração do camundongo transgênico que expressa tonina de rato (TGM(rTon)). Foram utilizados camundongos machos C57bl/6 (grupo controle, CT) e camundongos transgênicos [TGM(rTon)]. Vinte e quatro horas após o implante de cânulas, animais acordados, com 12 semanas de idade, foram submetidos a procedimentos de avaliação hemodinâmica. Os dados mostraram que não existem diferenças estatísticas entre os grupos quanto aos parâmetros hemodinâmicos. Após determinação da pressão arterial, os camundongos foram sacrificados por decapitação e os órgãos (rim e coração) foram retirados. O coração foi dividido em átrios (AT) [direito + esquerdo], ventrículo direito (VD) e ventrículo esquerdo (VE). Usando o tetradecapeptídeo sintético como substrato, a atividade tonina foi avaliada nos rins e nas estruturas cardíacas. A atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) foi determinada usando os substratos ZPhe-His-Leu (específico para o domínio N da ECA) e Hip-His-Leu (específico para o domínio C). Tanto a atividade da tonina, quanto da ECA nos rins e no AT foram significantemente maiores no grupo TGM(rTon) quando comparado ao dos camundongos CT. Já entre as estruturas cardíacas o AT mostrou atividade significantemente maior em ambos os grupos, quando comparados aos ventrículos. A expressão da isoforma de 65 kDa da ECA foi significantemente maior no grupo TGM(rTon) nos rins e no AT. Apenas no rim foi analisada a expressão de ECA e não foi observada diferença estatística entre os grupos. As concentrações da angiotensina 1-7 [Ang-(1-7)] e da Ang I foram significantemente diminuídas no grupo TGM(rTon) quando comparadas ao CT. Entretanto, não foi observada diferença estatística nos níveis da Ang II entre os grupos. Sugerimos que o ambiente com abundância em tonina pode aumentar a atividade N-domínio da ECA por meio de uma secretase, explicando os baixos níveis da Ang-(1-7) encontrados no grupo transgênicoPela primeira vez foi mostrado um importante papel fisiológico da tonina comomodulador do SRA renal e cardíaco. / Angiotensin II (Ang II), one of the most relevant angiotensinergic peptides, has an important role in the renal and cardiac physiology. There are many enzymes that generate Ang II. One of them is tonin, that is able to liberate AII from angiotensin I (Ang I) or directly from angiotensinogen (AGT). Our goal was to characterize the RAS in the kidney and heart of transgenic mouse that express rat tonin [TGM(rTon)]. Twenty-four hours after implantation of cannulas, 12 weeks old awake animals were subjected to hemodynamic evaluation. Data showed no statistical differences for the hemodynamic parameters analyzed between transgenic and the wild-type (control, CT). After that mice were sacrificed by decapitation and their organs (kidney and heart) removed. Heart was separated into atria [right plus left (AT)], right ventricle (RV), and left ventricle (LV)]. Using the synthetic tetradecapeptide renin substrate, tonin activity was evaluated in the kidney and cardiac structures. The angiotensin converting enzyme (ACE) activity was determined using the substrates Z-Phe- His-Leu (specific for N-domain ACE active site) and Hip-His-Leu (specific for Cdomain active site). Both the activity of tonin and the ACE, in the kidneys and AT were significantly higher in TGM(rTon) when compared with CT mice. Among the cardiac structures AT showed significantly greater activity in both groups when compared to the ventricles.The expression of the 65 kDa ACE isoform was significantly higher in TGM(rTon) in the kidney and AT when compared with CT. ACE2 expression was determined only in the kidney and there was not statistic differences between groups. The levels of angiotensin 1- 7 [Ang-(1-7)] and Ang I was significantly decreased in TGM(rTon) when compared with CT. However, the levels of Ang II were not statistically different between groups. We suggest that the environment of tonin abundance may increase N-domain ACE activity by a secretase activity, which could explain the low levels of Ang-(1-7) in the transgenic animal. Our data show, for the first time, the physiologic role of tonin as an important modulator of renal and cardiac RAS. / FAPESP: 2009/03261-04 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O excesso de adenina na dieta (ADE) promove precipitação intrabular de cristais, levando a uma nefrite intersticial progressiva com perda de função renal. Estudo recente demonstrou que esse processo requer ativação do sistema NF-kB. No presente estudo investigamos o possível envolvimento de outros componentes da imunidade inata, além do NF-kB. Verificamos também a hipótese de que a nefropatia associada aos cristais continua a progredir mesmo depois de cessada a sobrecarga de adenina. Foram estudados ratos Munich-Wistar machos e adultos sem tratamento (C) ou recebendo 0.5% de ADE na dieta. Após 1 semana, a ADE foi removida da dieta e os animais foram seguidos por 4 ou 24 semanas. A administração de ADE por 1 semana promoveu uma inflamação intersticial aguda, com perda de função renal, alteração da pressão caudal, sem alterações glomerulares. Os mediadores da imunidade inata, como TLR2, TLR4, inflamassoma NLRP3, IL1beta e IL-6, apresentaram-se ativados sem, no entanto, ativar o sistema NF-kB. Após cessada a sobrecarga de ADE, a inflamação persistiu, com infiltração por macrófagos, expressão elevada de AngII, deposição progressiva de colágeno e, na fase mais tardia, glomeruloesclerose, caracterizando um processo inflamatório crônico, autônomo, que não contou com a participação do eixo NLR/IL1beta. Em contraste, o sistema NF-kB foi ativado, sendo um dos possíveis estímulos a produção intra-renal de AngII. Dois mecanismos patogênicos podem ser identificados neste estudo: 1) agudo, associado à ativação do eixo NLR-IL1beta; 2) crônico, associado à produção de AngII renal e à ativação do sistema NF-kB / Excess adenine in the diet (ADE) promotes intratubular crystal precipitation, leading to progressive interstitial nephritis and loss of renal function. A recent study has shown that this process requires activation of the NF-kB system. In the present study we investigated the possible involvement of other components of innate immunity, in addition to NF-kB, as well as whether nephropathy associated with excess adenine continues to progress even after dietary cessation. Male Munich-Wistar rats without treatment (C) or receiving 0.5% of ADE in the diet were studied. After 1 week, ADE was removed from the diet and the animals were followed for 4 or 24 weeks. Administration of ADE for 1 week promote acute interstitial inflammation, with loss of renal function, alteration of caudal pressure, without glomerular changes. Mediators of innate immunity, such as TLR2, TLR4, NLRP3 inflamassome, IL1beta and IL-6 , were shown to be activated, with no apparent activation of the NF-kB system. In the late phases of the model, the inflammation persisted, with significant infiltration by macrophages, high expression of AngII, progressive collagen deposition and glomerulosclerosis, characterizing a chronic, autonomic inflammatory process that did not involve the participation of the NLR/IL1beta axis. By contrast, the NF-kB system was activated, with intra-renal AngII production as a possible stimulus. Two mechanisms operated this study: 1) an acute one, associated with activation of the NLR-IL1beta axis; 2) a chronic one, associated with intrarenal AngII production and NF-kB activation

Peptídeos bioativos são de grande interesse tanto para a indústria farmacêutica como para a de alimentos e são obtidos a partir da hidrólise enzimática de várias fontes protéicas, como as do leite, glúten de milho, soja, e músculos de suínos, aves e peixes. Estes peptídeos podem desempenhar atividades benéficas para a saúde, entre elas, a regulação ou inibição de enzimas, com destaque à inibição da enzima conversora da angiotensina I (ECA). Esta enzima é responsável pela clivagem de dois importantes substratos envolvidos na regulação da pressão arterial, a angiotensina I e a bradicinina. Neste trabalho foi estudada a atividade inibitória da ECA em hidrolisados dos peixes tilápia tailandesa (Oreochromis niloticus - linhagem tailandesa) e corvina (Micropogonias furnien) . Os \"minced\" destes peixes foram hidrolisados com pepsina e proteases de Streptomyces griséus por 5 horas em condições ideais de pH e temperatura. A atividade inibitória foi avaliada pela medida da atividade residual da enzima sobre substrato sintético fluorescente. Os hidrolisados com um grau de hidrólise de cerca de 34% apresentaram atividade inibitória semelhante, com valor de IC50 = 0,040 e 0,036 mg proteína/mL, respectivamente para a tilápia e a corvina. Observou-se aumento da atividade inibitória com o progresso da hidrólise, sendo que este aumento também está relacionado com a especificidade das enzimas proteolíticas. Em outro experimento observou-se que os peptídeos presentes no hidrolisado de tilápia inibiram indistintamente os domínios C e N terminais da ECA, não demonstrando especificidade. A atividade inibitória dos hidrolisados foi mantida após submetê-los à ação de enzimas proteolíticas gastrointestinais, indicando a sua provável estabilidade \"in vivo\". Da mesma forma, o minced de tilápia quando incubado sucessivamente com pepsina/tripsina/quimotripsina produziu peptídeos ativos (IC50 = O,025mg proteína/mL). Apesar do reduzido grau de hidrólise obtido neste ensaio (17%), os peptídeos liberados apresentaram atividade inibitória elevada, confirmando que a atividade não está relacionada apenas com o grau de hidrólise, mas também com a sequência de aminoácidos, liberados em função da especificidade das enzimas. Concluiu-se que o consumo destes peixes, ou seus respectivos hidrolisados poderá eventualmente, auxiliar na prevenção e no tratamento não medicamentoso da hipertensão, embora estudos \"in vivo\" sejam necessários para comprovar as suas funções biológicas. / Bioactive peptides have been highly valued by pharmaceutical industries and by food industries as well. These peptides can be released by the enzymatic hydrolysis of various protein sources such as milk, com gluten, soybean, muscles of pigs, chicken and fish and have been recognized to exhibit important health benefits. Among these, the regulation or inhibition of enzymes, like the inhibition of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) have been focused. This enzyme is responsible for the cleavage of two important substrates, angiotensin I and bradykinin, both of them involved with the regulation of blood pressure. In this study the inhibitory activity of hydrolysates from tilapia tailandesa (Oreochromis niloficus - linhagem tailandesa) and corvina (Micropogonias furnien) was evaluated. The hydrolysates of the minced fishes were produced in a 5-hour lasting controlled process under optimal conditions of pH and temperature by the sequential action of pepsin and enzymes from Streptomyces griseus. Inhibitory activity was evaluated by measuring the residual activity of the enzyme on a synthetic fluorescent peptidic substrate. The extent of hydrolysis was about 34% and the hydrolysates of tilapia and corvine showed similar inhibitory activity (IC50 of 0.040 and 0.036 mg protein/mL), respectively. An íncrease of activity proportional to the degree of hydrolysis was observed, as well as a relationship with the specificity of the enzymes used. In another experiment it was observed that the bioactive peptides present in the hydrolysate of tilapia did not show specificity for the C- and N-terminal catalytic domains of the angiotensin I-converting enzyme. The inhibitory activity of the hydrolysates was still active afier a further hydrolysis by gastrointestinal enzymes, which seems to indicate an eventual activity in vivo. In a similar way, when the minced tilapia was consecutively incubated with pepsine, trypsin, chymotrypsin active peptides were produced with an activity of IC50 = 0.025 mg protein/mL. Despite the low extend of hydrolysis of about 17%, a high inhibitory activity was observed confirming that activity is not only related to the degree of hydrolysis but also to the sequence of aminoacids and therefore, to the specificity of the enzymes as well. It was concluded that the intake of fish or fish hydrolysates has the potential to help control or to prevent hypertension by a non-drug food-based treatment.