Estrogen Receptor ? (ER?)/Sp1 activation of GC-rich gene promoters in breast cancer cells is dependent, in part, on the activation function 1 (AF1) of ER?. This study investigates contributions of the DNA binding domain (C) and AF2 (DEF) regions of ER? on activation of ER?/Sp1. 17Beta-estradiol (E2) and the antiestrogens 4-hydroxytamoxifen and ICI 182,780 induced reporter gene activity in MCF-7 and MDA-MB-231 cells cotransfected with human or mouse ER? (hER? or MOR), but not ER? and GC-rich constructs containing three tandem Sp1 binding sites (pSp13) or other E2-responsive GC-rich promoters. Estrogen and antiestrogen activation of hER?/Sp1 was dependent on overlapping and different regions of the C, D, E, and F domains of ER?. Antiestrogen-induced activation of hER?/Sp1 was lost using hER? mutants deleted in zinc finger 1 (amino acids (aa) 185-205), zinc finger 2 (aa 218-245), and the hinge/helix 1 (aa 265-330) domains. In contrast with antiestrogens, E2-dependent activation of hER?/Sp1 required the C-terminal F domain (aa 579-595), which contains a ?-strand structural motif. Moreover, in peptide competition experiments overexpression of NR-box peptides inhibits E2-induced luciferase activity of pERE3, which contains three tandem repeats of consensus ERE sites, whereas E2-induced hER?/Sp1 action was not inhibited by NR-box peptide expression. In contrast, overexpression of a C-terminal (aa 575-595) F domain peptide specifically blocked E2-dependent activation of hER?/Sp1, but not on activation of pERE3, suggesting that F domain interactions with nuclear cofactors are specifically required for ER?/Sp1 action. Furthermore, direct physical interactions between hER? and Sp1 protein in vivo have been investigated by using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy and image analysis. Consistent with results from transient transfection assay, E2, 4OHT, and ICI enhanced hER?/Sp1 interactions in living cells and these interactions were also confirmed by coimmunoprecipitation. In addition, endogenous hER?/Sp1 action was evaluated by using si RNA for Sp1 and a significant decrease in ligand-induced hER?/Sp1 action was observed after decreased Sp1 expression.

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Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant. / Approximately 70% of breast tumors express or overexpress estrogen receptor alpha (ERα) and are treated with antiestrogens (AEs), which act as competitive inhibitors of this receptor. Tamoxifen has been widely used for the treatment of ERα-positive tumors, but intrinsic or acquired resistance can lead to tumor recurrence. Full AEs such as Fulvestrant (ICI182, 780) are currently used to treat postmenopausal women with ERα-positive breast cancers with disease progression following Tamoxifen therapy. Unlike Tamoxifen and other Selective estrogen receptor modulators (SERMs), full AEs (SERDs) are devoid of any agonistic activity. It is currently thought that the capacity of full AEs to induce rapid polyubiquitination and degradation of ERα underlies their complete suppression of ERα signalling. On the one hand, we show a correlation between ICI 182, 780 induced ERα inhibition and its association with the insoluble fraction. This insolubility corresponds to an immobilization within the nuclear matrix and takes place in the absence of an accelerated turn over. The helix 12 in the ligand binding domain is important in the induction of insolubility and inactivation. On the other hand, we identify ERα as a target for Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) posttranslational modification by SUMO1 and SUMO2/3 specifically when liganded with full AEs. Induction of SUMOylation is rapid and precedes receptor degradation in ERα-positive breast cancer cells. On the other hand, the SERMs do not induce SUMOylation. The helix 12 in the ligand binding domain and the DNA binding domain play a role in the induction of SUMOylation in the presence of full AEs. Structure activity relationship experiments with full AE derivatives showed that the induction of SUMOylation is correlated with the degree of inhibition of ERα-mediated transcription. In addition, preventing SUMOylation by overexpression of a SENP1 deSUMOylase abolished the inverse agonist properties of full AEs without increasing activity in the presence of agonists or of Tamoxifen. In our attempt to screen for factors with a possible role in SUMOylation and inactivation, we show that the treatment with SERDs but not SERMs, induces a rapid interaction between ERα and the human ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor (ACF) in ERα-negative and ERα-positive cell lines. The helix 12 is important since introducing single point mutations in this helix lead to an increased solubility and abrogate ACF recruitment. Using ChIP, we find an increase of ACF1 subunit association with proximal promoter of estrogen target gene pS2 suggesting a possible role of ACF in remodeling in this promoter. ACF recruitment is SUMOylation dependant since the overexpression of DeSUMOylase SENP1 abolishes the interaction between ERα and ACF. Together, induction of insolubility, SUMOylation and ACF recruitment are characteristic properties of full antiestrogens that contribute to their specific activity profile. They can be used to screen for new compounds with an improved therapeutic potential.

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant. / Approximately 70% of breast tumors express or overexpress estrogen receptor alpha (ERα) and are treated with antiestrogens (AEs), which act as competitive inhibitors of this receptor. Tamoxifen has been widely used for the treatment of ERα-positive tumors, but intrinsic or acquired resistance can lead to tumor recurrence. Full AEs such as Fulvestrant (ICI182, 780) are currently used to treat postmenopausal women with ERα-positive breast cancers with disease progression following Tamoxifen therapy. Unlike Tamoxifen and other Selective estrogen receptor modulators (SERMs), full AEs (SERDs) are devoid of any agonistic activity. It is currently thought that the capacity of full AEs to induce rapid polyubiquitination and degradation of ERα underlies their complete suppression of ERα signalling. On the one hand, we show a correlation between ICI 182, 780 induced ERα inhibition and its association with the insoluble fraction. This insolubility corresponds to an immobilization within the nuclear matrix and takes place in the absence of an accelerated turn over. The helix 12 in the ligand binding domain is important in the induction of insolubility and inactivation. On the other hand, we identify ERα as a target for Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) posttranslational modification by SUMO1 and SUMO2/3 specifically when liganded with full AEs. Induction of SUMOylation is rapid and precedes receptor degradation in ERα-positive breast cancer cells. On the other hand, the SERMs do not induce SUMOylation. The helix 12 in the ligand binding domain and the DNA binding domain play a role in the induction of SUMOylation in the presence of full AEs. Structure activity relationship experiments with full AE derivatives showed that the induction of SUMOylation is correlated with the degree of inhibition of ERα-mediated transcription. In addition, preventing SUMOylation by overexpression of a SENP1 deSUMOylase abolished the inverse agonist properties of full AEs without increasing activity in the presence of agonists or of Tamoxifen. In our attempt to screen for factors with a possible role in SUMOylation and inactivation, we show that the treatment with SERDs but not SERMs, induces a rapid interaction between ERα and the human ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor (ACF) in ERα-negative and ERα-positive cell lines. The helix 12 is important since introducing single point mutations in this helix lead to an increased solubility and abrogate ACF recruitment. Using ChIP, we find an increase of ACF1 subunit association with proximal promoter of estrogen target gene pS2 suggesting a possible role of ACF in remodeling in this promoter. ACF recruitment is SUMOylation dependant since the overexpression of DeSUMOylase SENP1 abolishes the interaction between ERα and ACF. Together, induction of insolubility, SUMOylation and ACF recruitment are characteristic properties of full antiestrogens that contribute to their specific activity profile. They can be used to screen for new compounds with an improved therapeutic potential.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Hormonell wirksame Chemikalien, wie Pflanzenschutzmittel oder Pharmaka gelangen durch Abwässer in die Umwelt und akkumulieren vor allem in Oberflächengewässern. Ein erhöhtes Augenmerk liegt auf Substanzen, die durch (anti)androgene und (anti)östrogene Wirkungsweise die Reproduktion von Tieren und Menschen beeinträchtigen. Bei den bisherigen Nachweismethoden für diese Stoffe handelt es sich um invasive Methoden, die das Töten der Tiere beinhalten. Diesen Methoden mangelt es jedoch an der nötigen Sensitivität, um umweltrelevante Konzentrationen der endokrinen Disruptoren (EDs) nach Kurzzeitexposition nachweisen zu können, sowie am Vermögen, alle vier Wirkmechanismen (androgen, antiandrogen, östrogen und antiöstrogen) mit einer einzelnen Testmethode feststellen und unterscheiden zu können. In dieser Studie wurde deshalb mit Hilfe männlicher Afrikanischer Krallenfrösche (Xenopus laevis) eine Testmethode entwickelt, bei der die Frösche verschiedenen (anti)androgenen und (anti)östrogenen EDs ausgesetzt wurden und ihr Rufverhalten untersucht wurde. Diese nicht-invasive Methode erwies sich als schnell und höchst sensitiv. Zudem war es erstmals möglich, die vier verschiedenen Wirkmechanismen allein anhand veränderter Ruftypen und Rufparameter zu bestimmen und zu unterscheiden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass bei Anwendung dieser Methode die Möglichkeit besteht, die Versuchstiere in weiteren Tests wiederzuverwenden, da die Rufparameter nach einer expositionsfreien Zeit von sechs Wochen wieder Kontrollwerte erreichten. Zusammengefasst kann die hier vorgestellte verhaltensphysiologische und damit nicht-invasive Methode als Biomarker für den Nachweis von (anti)androgenen und (anti)östrogenen EDs verwendet werden. Ferner zeigt die hohe Sensitivität des Tests, sowie die Möglichkeit der vollautomatischen Analyse enormer Datenmengen, dass dieser schnelle Verhaltenstest ein großes Potential hat, ein sensitiver, standardisierter und nicht-invasiver Biomarker zu werden. / Endocrine disrupting compounds (EDCs), such as herbicides, pesticides or pharmaceuticals enter the environment via sewage effluents and especially accumulate in surface waters. Research efforts so far mainly focused on EDCs with (anti)androgenic and (anti)estrogenic modes of action (MOAs), which can interfere with reproductive biology of vertebrates. To date, biomarkers for the assessment of such compounds are invasive techniques, which are not sensitive enough to detect EDCs after short-term exposures and which cannot distinguish between the four MOAs. Hence, in this study a non-invasive method for the assessment of EDCs was developed using male African clawed frogs (Xenopus laevis) as model species. Frogs were exposed to individual (anti)androgenic and (anti)estrogenic EDCs in the surrounding water and their calling behavior was analyzed. This non-invasive method turned out to be a fast and highly sensitive biomarker for the detection of (anti)androgenic and (anti)estrogenic EDCs. Moreover, this method was able to differentiate between the four different MOAs solely by determining affected parameters of the calling behavior. It was also shown that by using this method, it might be possible to reuse already tested experimental animals, because the measured affected parameters were reversed after a period of six weeks under control conditions. Taken together the here established non-invasive behavioral method can be used as biomarker for the detection of (anti)androgenic and (anti)estrogenic EDCs. Furthermore, the high sensitivity of this testing method, as well as the possibility of analyzing vast datasets rapidly in a completely automated fashion indicate the huge potential for this rapid behavior test to become a sensitive, standardized, non-invasive biomarker.

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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Deux tiers des cancers du sein expriment le récepteur des œstrogènes alpha (ERα), un facteur de transcription ligand dépendant responsable de la prolifération oncogénique de ces cellules. Ces tumeurs, dites ER positives (ER+), bénéficient de thérapies endocrines comme les antiœstrogènes (AE). Les AE sont des ligands compétitifs de ERα qui inhibent son activité transcriptionnelle. Le tamoxifène est l’antiœstrogène le plus utilisé en première ligne de traitement chez les patientes ayant un cancer du sein ER+. Malgré un bon pronostique initial, plus du tiers d’entre elles finiront par développer une résistance, parfois après de nombreuses années. L’absence de résistance croisée avec le tamoxifène place le fulvestrant comme seul dé-régulateur sélectif de ER (SERD) autorisé en clinique contre les tumeurs mammaires avancées résistantes. Malgré son profil antagoniste pur, le fulvestrant ne s’est pas révélé supérieur au tamoxifène en première ligne de traitement, cela étant attribué à sa faible biodisponibilité. D’autres SERD oralement disponibles sont en cours d’évaluation clinique. Des mutations du gène ESR1 (ERα) sont retrouvées dans environ 20% des tumeurs avancées résistantes à l’hormonothérapie et contribuent à la résistance au fulvestrant. Les mutations sont toutes retrouvées dans le domaine de liaison au ligand. La maladie progressera éventuellement avec le développement de métastases qui sont incurables. Il est donc crucial de (1) comprendre les mécanismes moléculaires médiant l’antiestrogénicité pure et l’impact des altérations génétiques impliquées dans la résistance aux AE pour (2) développer des thérapies ciblées plus efficaces qui pourraient lutter contre les tumeurs avancées résistantes. Les résultats prometteurs de plusieurs études in vitro et en clinique combinant un AE avec un inhibiteur d’histones désacétylases (HDACi) ont mené à la création de molécules hybrides combinant les deux fonctionnalités en une seule molécule. Nos travaux montrent que ces molécules hybrides dérivées du tamoxifène démontrent des propriétés inhibitrices améliorées par l’ajout d’un groupe fonctionnel inhibiteur des HDAC sur le squelette du tamoxifène. Ces composés sont antagonistes contre ERα et plusieurs HDAC et l’un d’eux possède une activité antiproliférative accrue par rapport aux composés parentaux dans les cellules de cancer du sein ER+ MCF-7. Notre étude fournit une preuve de concept que la combinaison d’une fonction pharmacologique HDACi sur le noyau d’un AE est prometteuse. Afin de mieux comprendre les déterminants moléculaires liés à l’induction de la SUMOylation de ERα et l’inhibition de son activité transcriptionnelle par le fulvestrant, nous avons testé l’impact de différentes mutations sur l’activité de plusieurs SERD, comprenant le fulvestrant. Nos résultats valident l’importance du résidu L536 dans la SUMOylation et la répression transcriptionnelle de ERα en réponse aux SERD. Les mutations ponctuelles L536P, Q et R, trouvées en clinique, compromettent la réponse au fulvestrant et à une sélection de SERD oraux in vitro. En résumé, nos résultats participent à une meilleure compréhension des caractéristiques moléculaires liées au mécanisme d’action du fulvestrant et de plusieurs SERD oraux de nouvelle génération. L’ensemble de nos résultats devraient aider au développement de nouvelles molécules plus efficaces contre les tumeurs résistantes, y compris des composés avec une double fonction inhibitrice AE-HDACi. / Two thirds of breast tumors are classified as positive for estrogen receptor alpha (ERα), a ligand-dependent transcription factor driving breast cancer cell proliferation. ER-positive (ER+) tumors benefit from endocrine therapies such as antiestrogens (AE). AE compete with ERα natural ligands and inhibit its transcriptional activity. Tamoxifen is the gold-standard for antiestrogenic therapy in patients with primary ER+ breast cancer. Despite a good initial prognosis, more than one-third will eventually develop resistance, sometimes after long periods of latency. Fulvestrant, known as a “pure” AE, is the only selective ER deregulator (SERD) approved in advanced breast cancer even after development of resistance to tamoxifen. Despite its pure antagonistic profile, fulvestrant has not proven superior to tamoxifen in first-line treatment, which is attributed to poor pharmacological properties. New generation SERDs with orally bioavailable properties are currently tested in the clinic. Mutations of ERα are found in about 20% of hormone-resistant advanced tumors and contribute to resistance to fulvestrant. The mutations are all located in the ligand binding domain. Resistant tumors will eventually progress and develop metastases which are deadly. It is therefore crucial to (1) understand the molecular determinants of pure antiestrogenicity and the impact of genetic alterations involved in AE resistance to (2) develop treatments with improved cytotoxic activities to achieve a more efficient suppression of advanced tumors. Promising results from several in vitro and clinical studies combining an AE with a histone deacetylase inhibitor (HDACi) have led to the design of hybrid molecules combining both functionalities into a single molecule. Our work shows that tamoxifen-derived hybrids display properties by the addition of an HDAC inhibitory functional group (HDACi) on the tamoxifen backbone. These compounds have inhibitory activities against ERα and several HDACs. One hybrid exhibits an improved cytotoxic activity against ER+ MCF-7 breast cancer cells compared to parental molecules. Our study provides proof of concept that combining HDACi function to the core of an AE is promising. To better understand the molecular determinants related to the induction of ERα SUMOylation and transcriptional repression by fulvestrant, we evaluated the impact of different mutations on the activity of several SERDs, including fulvestrant. Our results validate the importance of residue L536 in SUMOylation and transcriptional repression of ERα in response to SERDs. L536P, Q, and R point mutations are found in the clinic compromise the response to fulvestrant and to several oral SERDs in vitro. In summary, our results give better insights into the mechanism of action of fulvestrant and new generation oral SERDs and on the impact of naturally occurring mutations on transcriptional responses to these AE. Taken together, our results should help in the design of more efficient molecules, including compounds with dual AE-HDACi inhibitory function.