La leishmaniose est une maladie parasitaire négligée touchant environ 12 millions de personnes dans le monde. Actuellement, les options thérapeutiques sont limitées à quatre médicaments : les dérivés d'antimoine pentavalent (SbV), l'amphotéricine B (AMB), la miltéfosine (MF) et la paromomycine (PMM). Ces traitements présentent de nombreux inconvénients, dont une toxicité importante pour les hôtes, un coût élevé et des protocoles de traitement invasifs. De plus, l'efficacité de ces traitements est de plus en plus compromise par l'émergence de souches de *Leishmania* résistantes aux antimicrobiens. Cette résistance est en grande partie due à la capacité du parasite à adapter rapidement son génome grâce à son aneuploïdie et à sa plasticité génomique. Pour surmonter ces défis, il est crucial de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques et de mieux comprendre les mécanismes de résistance du parasite. Les techniques de criblage, comme le Cos-Seq, ont permis d'identifier des mécanismes de résistance associés à l'amplification génique, tandis que d'autres méthodes comme le Mut-Seq et le Sel-Seq ont révélé des mutations menant à des phénotypes de résistance. Cependant, il manque encore des outils moléculaires optimisés pour des criblages à haut débit de perte de fonction, permettant une analyse complémentaire du génome et du transcriptome de *Leishmania* dans diverses conditions environnementales. Cette thèse propose trois outils moléculaires innovants adaptés aux criblages à l'échelle génomique pour développer l'étude du mode d'action des antimicrobiens et des mécanismes de résistance chez *Leishmania*. Dans le premier chapitre, deux criblages CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome ont été optimisés chez *Leishmania infantum*, une espèce responsable de la forme sévère de la leishmaniose. Un projet pilote ciblant quatre gènes a validé la fonctionnalité du système. Par la suite, une librairie de près de 50 000 ARN guides (ARNg) a été intégrée dans un vecteur d'expression pour le séquençage de nouvelle génération (Illumina), testée pour la couverture du génome et transfectée dans des souches exprimant l'endonucléase Cas9. Deux criblages ont été réalisés avec AMB et MF. Les ARNgs les plus enrichis dans le criblage de la MF ciblaient le gène du transporteur de la miltéfosine, tandis que ceux ciblant des gènes codant pour une protéine au domaine de type RING et une protéine transmembranaire étaient également enrichis. Les ARNgs enrichis dans le criblage avec AMB ciblaient des gènes impliqués dans la méthylation des stérols et un gène hypothétique. Les études fonctionnelles ont prouvé que la perte de fonction de ces gènes était associée à la résistance. Ce criblage à l'échelle du génome a permis d'identifier des cibles thérapeutiques connues et nouvelles, offrant un outil puissant pour découvrir de nouvelles molécules et identifier des cibles potentielles. Dans le deuxième chapitre, l'interférence à l'ARN (ARNi) a été explorée. Bien que cette approche soit bien maîtrisée chez *Trypanosoma brucei*, elle a été peu utilisée pour *Leishmania*. La présence d'un système ARNi actif a été confirmée dans *L. (Viannia) braziliensis*, avec la création d'une construction en boucle ciblant *MT*, entraînant une résistance à la miltéfosine. Une nouvelle construction intégrable avec des promoteurs et des terminateurs en position contraire a été conçue pour cibler *MT* et *AQP1*, démontrant des réductions significatives de l'expression (ou « knockdown ») et une résistance à la miltéfosine et au SbIII. Cette approche ouvre la voie à des études de gènes dont la suppression complète pourrait être délétère, permettant ainsi une régulation plus fine des gènes. Enfin, le troisième chapitre présente le développement du premier outil de criblage à haut débit d'inactivation des ARNs codants ou non codants chez *Leishmania* : le système CRISPR-Cas13b. Une preuve de concept a été réalisée chez *Leishmania infantum* en ciblant le gène de la luciférase, réduisant significativement l'expression de l'ARNm et l'activité de la luciférase. Des tests supplémentaires ont ciblé le gène *MT* avec neuf ARNgs, validant la diminution du niveau d'ARNm et optimisant la conception des ARNgs. Bien que des optimisations soient nécessaires pour une application à grande échelle, ce système de knockdown a le potentiel de faciliter de nombreuses études sur le transcriptome de *Leishmania*. Les trois outils moléculaires développés permettent d'améliorer la compréhension des mécanismes de résistance des parasites et le mode d'action des antimicrobiens, ouvrant la voie à des thérapies plus efficaces et à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques contre cette maladie complexe. / Leishmaniasis is a neglected parasitic disease affecting approximately 12 million people worldwide. Currently, therapeutic options are limited to four drugs: pentavalent antimony derivatives (SbV), amphotericin B (AMB), miltefosine (MF), and paromomycin (PMM). These treatments have many drawbacks, including significant toxicity to hosts, high costs, and invasive treatment protocols. Moreover, the effectiveness of these treatments is increasingly compromised by the emergence of antimicrobial-resistant *Leishmania* strains. This resistance is largely due to the parasite ability to rapidly adapt its genome through aneuploidy and genomic plasticity. To overcome these challenges, it is crucial to discover new therapeutic targets and better understand the parasite's resistance mechanisms. Screening techniques, such as Cos-Seq, have identified resistance mechanisms associated with gene amplification, while other methods like Mut-Seq and Sel-Seq have revealed mutations leading to resistance phenotypes. However, there is still a lack of optimized molecular tools for high-throughput loss-of-function screenings, which would provide complementary analyses of the *Leishmania* genome and transcriptome under various environmental conditions. This thesis describes three innovative molecular tools tailored for genomic-scale screenings to advance the study of antimicrobial mechanisms of action and resistance mechanisms in *Leishmania*. In the first chapter, two genome-wide CRISPR-Cas9 screenings were optimized in *Leishmania infantum*, a species responsible for the severe form of leishmaniasis. A pilot project targeting four genes validated the system's functionality. Subsequently, a library of nearly 50,000 guide RNAs (gRNAs) was incorporated into an expression vector for next-generation sequencing (Illumina), tested for genome coverage, and transfected into Cas9-expressing strains. Two screenings were conducted with AMB and MF. The most enriched gRNAs in the MF screening targeted the miltefosine transporter gene, while those targeting genes coding for a RING-type protein and a transmembrane protein were also enriched. The enriched gRNAs in the AMB screening targeted genes involved in sterol methylation and a hypothetical gene. Functional studies demonstrated that the loss of function of these genes was associated with resistance. This genome-wide screening identified both known and new therapeutic targets, offering a powerful tool for discovering new molecules and identifying potential targets. In the second chapter, RNA interference (RNAi) was explored. Although this approach is well-established in *Trypanosoma brucei*, it has been less used for *Leishmania*. The presence of an active RNAi system was confirmed in *L. (Viannia) braziliensis*, with the creation of a loop construct targeting *MT*, resulting in miltefosine resistance. A new integrable construct with opposing-positioned promoters and terminators was designed to target *MT* and *AQP1*, demonstrating significant knockdowns and resistance to miltefosine and SbIII. This approach paves the way for studies of genes where complete suppression could be deleterious, allowing for more precise gene analysis. Finally, the third chapter presents the development of the first high-throughput tool for the inactivation of coding and non-coding RNAs in *Leishmania*: the CRISPR-Cas13b system. A proof of concept was achieved in *Leishmania infantum* by targeting the luciferase gene, significantly reducing mRNA expression and luciferase activity. Additional tests targeted the *MT* gene with nine gRNAs, validating reduced mRNA levels and optimizing gRNA design. While further optimizations are needed for large-scale application, this knockdown system has the potential to facilitate numerous studies on the *Leishmania* transcriptome. The three developed molecular tools enhance the understanding of parasite resistance mechanisms and antimicrobial modes of action, paving the way for more effective therapies and the discovery of new therapeutic targets against this complex disease.

Le travail suivant est consacré d'une part à l'emploi du calix[4]arène comme une plate-forme organisatrice de principes actifs pour la conception de nouvelles prodrogues. Ce concept a été développé avec des substances antibactériennes ou antivirales, choisies comme modèles. Les conjugués calixarène - anti-infectieux ainsi synthétisés sont amphiphiles et insolubles dans l'eau. Leur comportement interfacial a été étudié via l'interface eau-air, mime d'une interface hydrophile-hydrophobe physiologique, à l'aide de la technique des films monomoléculaires de Langmuir. Nos résultats indiquent que ces prodrogues étalées à l'interface eau-air peuvent libérer leurs principes actifs dans la sous-phase. La méthodologie développée pour ces études de réactivité interfaciale pourrait à l'avenir être appliquée à d'autres prodrogues à base de calix[4]arène. Un second projet a concerné le trifluoroacétate de tétra-p-(guanidinoéthyl)-calix[4]arène (CX1). Ce composé présente des propriétés antibactériennes à large spectre, couplées à une faible toxicité cellulaire. Nos travaux ont visé à mieux comprendre son mode d'action, lié à une perturbation des parois bactériennes, par une approche physico-chimique. La technique de Langmuir a donc été employée afin d'étudier les interactions entre le CX1 et des films monomoléculaires de phospholipides étalés à l'interface eau-air, utilisés comme modèles de membrane bactérienne. Nos résultats nous ont permis de proposer un mode d'organisation des membranes bactériennes sous l'influence du CX1. Nous avons ainsi apporté des précisions sur son mécanisme d'action qui pourraient être utiles dans le développement de nouveaux calixarènes antibactériens / This work begins with utilization of the calix[4]arene macrocycle as organizing platform of anti-infectious molecules shaped as prodrug. The concept has been explored using antibacterial (nalidixic acid) and antiviral (aciclovir, ganciclovir) molecules, chosen as models. The calixarene - anti-infectious conjugates synthesized have amphiphilic structure and are insoluble in aqueous media. Their interfacial behavior was studied via the air-water interface, considered as mimic of biological hydrophilic-hydrophobic interfaces, using Langmuir monolayers technique. Our results indicate that calixarene-based prodrugs spread at the air-water interface are able to release anti-infectious molecules into the subphase. The original methodology employed for interfacial reactivity studies could be applied to further calixarene-based prodrugs. A second project concerns the trifluoroacetate salt of tetra-p-(guanidinoethyl)-calix[4]arene (CX1). CX1 is antibacterial, active against various Gram-positive and Gram-negative bacteria, with low eukaryotic cell toxicity. The aim of our work was to get more insight in the mechanism of action of CX1, involving bacterial wall disruption, by a physico-chemical approach. The Langmuir monolayers technique was employed in order to study interactions between CX1 and phospholipid monolayers spread at the air-water interface, used as models of bacterial membranes. Our results led us to propose a particular reorganization mode of bacterial membranes upon interactions with CX1. This proposal gives more understanding in the mechanism of biological activity of CX1, and could be helpful in developing new antibacterial calixarene derivatives