FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Nos Ãltimos anos, a melhoria dos mÃtodos de diagnÃstico micolÃgico e as doenÃas imunossupressoras causaram grande impacto na incidÃncia das micoses profundas e oportunistas em todo o mundo, fato que impulsionou a realizaÃÃo de estudos de prospecÃÃo por novas drogas antifÃngicas. A histoplasmose à uma micose sistÃmica, causada pelo fungo Histoplasma capsulatum var. capsulatum que, em pacientes hÃgidos, pode mimetizar a tuberculose quanto aos aspectos clÃnicos e radiolÃgicos. Alguns casos de histoplasmose refratÃria ao tratamento com drogas antifÃngicas convencionais vÃm sendo descritos. O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito inibitÃrio, in vitro, das drogas antituberculose: isoniazida (INH), pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB); antifÃngicas: anfotericina B (AMB), fluconazol (FLC), itraconazol (ITC) e voriconazol (VRZ) e de anÃlogos quÃmicos da isoniazida frente a cepas de H. capsulatum (n=30), assim como avaliar o emprego de diferentes meios de cultura para a realizaÃÃo dos testes de sensibilidade. Para isso, primeiramente, foram repicadas 18 cepas de H. capsulatum em Ãgar BHI e utilizadas na realizaÃÃo dos testes de sensibilidade frente aos agentes antituberculose citados e anÃlogos quÃmicos da isoniazida, isolados e em combinaÃÃo com os antifÃngicos FLC, ITC e VRZ por meio da tÃcnica de macrodiluiÃÃo em caldo. Cada uma das 12 cepas restantes foi repicada em Ãgar batata dextrose, Ãgar BHI, Ãgar malte a 2% e Ãgar lactrimel e, analisadas ao microscÃpio Ãptico quanto a presenÃa de macroconÃdios tuberculados, sendo quantificados de acordo com os parÃmetros: (0-10); (10-50); (>50) macroconÃdios/campo. As culturas foram empregadas na determinaÃÃo dos testes de sensibilidade frente aos agentes antifÃngicos AMB, FLC, ITC e VRZ, utilizando a tÃcnica de microdiluiÃÃo em caldo. As drogas antituberculose inibiram o crescimento das cepas in vitro com valores de CIM de 0,04 a 0,30 mg/mL para INH, 0,55 a 3,13 mg/mL para PZA e 1,56 a 6,25 mg/mL para EMB. No tocante Ãs drogas antifÃngicas, todas as cepas foram sensÃveis apresentando valores de CIM que variaram de 0,0625 a 0,25 Âg/mL para AMB; 15,62 a 62,5 Âg/mL para FLC; 0,0039 a 0,0312 Âg/mL para ITC e 0,00156 a 0,25 Âg/mL para VRZ. Quanto Ãs combinaÃÃes entre os fÃrmacos antituberculose e os derivados azÃlicos, todas foram capazes de inibir o crescimento in vitro das cepas de H. capsulatum, sendo detectado sinergismo nas nove combinaÃÃes. Os anÃlogos da isoniazida apresentaram valores de CIM 2, 4, 8 e 15 vezes superior a atividade da droga antituberculose padrÃo. A partir da anÃlise micromorfolÃgica do fungo repicados nos quatro meios de cultura foi identificado a menor quantificaÃÃo (0-10 macroconÃdios/campo) para Ãgar batata, Ãgar BHI, Ãgar malte e Ãgar lactrimel, perfazendo um total de 11, 10, 6 e 7 cepas, respectivamente. O meio de cultura Ãgar malte foi o mais adequado para produÃÃo de macroconÃdios (10-50) e (>50), norteando um total de 6 cepas, seguido do meio lactrimel, 5 cepas. Em relaÃÃo a determinaÃÃo da CIM e o meio de cultura utilizado para o procedimento, observou-se que quando o inÃculo era proveniente de cepas em Ãgar malte e Ãgar BHI foi possÃvel a visualizaÃÃo da CIM em 11 cepas. Enquanto repiques feitos em Ãgar batata e lactrimel nÃo foi possÃvel determinar os valores de CIM para 8 e 5 cepas, respectivamente. Os resultados deste estudo fornecem dados adicionais sobre o potencial antifÃngico das drogas antituberculose e suas interaÃÃes com os derivados azÃlicos. Entretanto, novos estudos se fazem necessÃrio, visando determinar os mecanismos de aÃÃo desses compostos no metabolismo celular dos fungos. / In the past years, the improvement of mycological diagnosis methods and immunosuppressive diseases have caused a great impact in the incidence of opportunistic and deep mycoses all around the world, which motivated the performance of new antifungal drugs prospective studies. Histoplasmosis is a systemic mycosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum var. capsulatum, which may mimic tuberculosis, in healthy individuals, concerning clinical and radiological aspects.ome cases of histoplasmosis that are refractory to the treatment with conventional antifungal drugs have been described. The aim of this study was to determine the in vitro inhibitory effect of the antituberculosis drugs: isoniazid (INH), pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB); antifungal drugs: amphotericin B (AMB), fluconazole (FLC), itraconazole (ITC) and voriconazole (VRZ) and chemical analogs of isoniazid against strains of H. capsulatum (n=30), as well as to evaluate the use of different culture media for the performance of the susceptibility tests. For such, first, the antituberculosis agents INH, PZA and EMB and the analogs of isoniazid were tested isolatedely, and then, in association with the antifungal drugs FLC, ITC and VRZ, against 18 strains of H. capsulatum, previously grown onto BHI agar, through broth macrodilution technique. Each of the 12 remaining strains grown onto potato agar, BHI agar, 2% malt extract agar and lactritmel agar were microscopically analyzed, concerning the presence of tuberculate macroconidia, which were quantified as follows: 0-10, 10-50 and >50 macroconidia/field. Fungal cultures were used to determine the susceptibility of H. capsulatum to the antifungal agents AMB, FLC, ITC and VRZ, through broth microdilution methodology. The antituberculosis drugs inhibited the in vitro growth of the fungal strains, with MICs ranging from 0.04 to 0.30 mg/mL for INH; 0.55 to 3.13 mg/mL for PZA and 1.56 to 6.25 mg/mL for EMB. Concerning antifungal drugs, all the strains were susceptible, with MIC values ranging from 0.0625 to 0.25 Âg/mL for AMB; 15.62 to 62.5 Âg/mL for FLC; 0.0039 to 0.0312 Âg/mL for ITC, and 0.00156 to 0.25 Âg/mL for VRZ. When associating antituberculosis drugs with azole derivatives, all associations inhibited the in vitro growth of H. capsulatum strains, and synergy was observed for the nine combinations tested. Analogs of isoniazide presented MICs of 2, 4, 8 and 15-fold better than the standard antituberculosis drug. Basing on micromorphological analysis, the lowest quantification of macroconidia/field (0-10) was observed for 11, 10, 6 and 7 strains previously grown onto potato agar, BHI agar, malt agar and lactritmel agar, respectively. Malt agar was the most adequate medium for the production of macroconidia, 10-50 and >50/field, with a total of six strains; followed by lactritmel agar, with 5 strains. Concerning the relationship between MIC and culture medium used during the test, it was observed that inoculum from strains grown onto malt agar and BHI agar allowed the detection of the MIC for 11 strains. On the other hand, for those inocula grown onto potato agar and lactritmel agar, the MIC values were not detected for 8 and 5 strains, respectively. The results of this study provide additional data on the antifungal potential of antituberculosis drugs and their interactions with azole derivatives. However, new studies are necessary in order to determine the mechanism of action of these compounds on fungal cellular metabolism.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A coccidioidomicose e a histoplasmose sÃo micoses sistÃmicas que acometem o homem e animais, causadas por espÃcies de fungos dimÃrficos, com Ãnfase para Coccidioides posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum, respectivamente. SÃo consideradas doenÃas profundas importantes, podendo culminar em diversas complicaÃÃes secundÃrias. Nos Ãltimos anos, a melhoria dos mÃtodos de diagnÃstico micolÃgico e o aumento da ocorrÃncia de doenÃas imunossupressoras causaram grande impacto na incidÃncia das micoses profundas e oportunistas no mundo. Apesar da existÃncia de terapias eficazes com antifÃngicos contra a coccidioidomicose e a histoplasmose, a busca por novas drogas para o tratamento destas doenÃas se faz necessÃria. Ciprofloxacina à uma droga antibacteriana clÃssica do grupo das fluoroquinolonas, que inibe a atividade catalÃtica da DNA girase e topoisomerase IV, essenciais na replicaÃÃo e transcriÃÃo do DNA bacteriano. Estudos verificaram que ciprofloxacina pode atuar na DNA girase dos fungos. Assim, o presente estudo visou avaliar o efeito inibitÃrio in vitro de ciprofloxacina (CIP) isolada e em combinaÃÃo com os antifÃngicos anfotericina B (AMB), itraconazol (ITC), voriconazol (VRC) e caspofungina (CAS) frente à C. posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum. Foram utilizados 16 cepas de C. posadasii na fase filamentosa, 16 cepas de H. capsulatum var. capsulatum na fase filamentosa e 9 cepas de H. capsulatum var. capsulatum na fase leveduriforme. O estudo foi conduzido em ensaio de macrodiluiÃÃo e microdiluiÃÃo em caldo, descritos nos documentos M-38A e M-27A2, padronizados pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), sendo utilizados para C. posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum, respectivamente. A interaÃÃo das drogas foi analisada atravÃs do cÃlculo do Ãndice da ConcentraÃÃo InibitÃria FracionÃria (FICI), definido como a soma das relaÃÃes entre a concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) de cada droga em combinaÃÃo e a CIM da mesma droga isolada, considerando os valores menores ou iguais a 0,5 indicativos de sinergismo. Com relaÃÃo Ãs cepas de C. posadasii, foram observadas interaÃÃes sinÃrgicas em todas as combinaÃÃes, com destaque para as associaÃÃes de CIP (3,125≤CIM≤12,5 ug mL-1) com ITC (0,0078≤CIM≤0,125 ug mL-1) (n=13/16), CIP (3,125≤CIM≤12,5 ug mL-1) com VRC (0,0078≤CIM≤0,0312 ug mL-1) (n=13/16) e CIP (3,125≤CIM≤12,5 ug mL-1) com CAS (2≤CIM≤8 ug mL-1) (n=14/16). Para as cepas de H. capsulatum na fase filamentosa, tambÃm foram observadas interaÃÃes sinÃrgicas em todas as combinaÃÃes, com destaque para as associaÃÃes de CIP (3,906≤CIM≤62,5 ug mL-1) com ITC (0,00006≤CIM≤0,0078 ug mL-1) (n=14/16) e CIP (31,25≤CIM≤125 ug mL-1) com VRC (0,0156≤CIM≤0,125 ug mL-1) (n=16/16). No tocante Ãs cepas de H. capsulatum na fase leveduriforme, foram observadas poucas interaÃÃes sinÃrgicas nas combinaÃÃes de drogas testadas. Nenhuma das associaÃÃes de drogas testadas apresentou antagonismo. Os dados obtidos apontam uma nova alternativa para o tratamento da coccidioidomicose e da histoplasmose, sendo necessÃrios novos estudos que visem investigar os mecanismos de aÃÃo dessas combinaÃÃes de drogas no metabolismo celular fÃngico, bem como o delineamento de experimentos in vivo para confirmar a significÃncia desses achados. / Coccidioidomycosis and histoplasmosis are systemic mycoses that occur in humans and other animals and are caused by the dimorphic fungi Coccidioides posadasii and Histoplasma capsulatum var. capsulatum, respectively. They are considered important deep mycoses that can lead to several secondary complications. In the past years, the improvement of the techniques applied in mycological diagnosis and the increase in the occurrence of immunocompromising diseases have caused a great impact in the incidence of deep and opportunistic mycoses in the world. In spite of the existence of effective antifungal therapy against coccidioidomycosis and histoplasmosis, the pursue of new drugs to treat theses diseases is necessary. Ciprofloxacin is a classic antibacterial drug that belongs to the group of fluoroquinolones, which inhibit the catalytic activity of DNA gyrase and topoisomerase IV, which are essential in bacterial DNA replication and transcription. Some studies have shown that ciprofloxacin can act on fungal DNA gyrase. Thus, the present study aimed at evaluating the in vitro inhibitory effect of ciprofloxacin (CIP), when associated with amphotericin B (AMB), itraconazole (ITC), voriconazole (VRC) or caspofungina (CAS), on C. posadasii and H. capsulatum var. capsulatum. Sixteen strains of C. posadasii in the filamentous phase and 16 and 9 strains of H. capsulatum in the filamentous and yeast-like phase, respectively, were used. Broth macrodilution and microdilution assays were performed, as described in the documents M38-A and M27-A2, respectively, of the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Drug interaction was analyzed by calculating the fractional inhibitory concentration index (FICI), which is defined as the sum of the ratios between the minimal inhibitory concentration (MIC) of each combined drug and the MIC of the same drug isolatedly. Values of FICI smaller or equal to 0.5 indicate the occurrence of synergy. Concerning the isolates of C. posadasii, synergistic interactions were observed for all combinations, especially for the associations of CIP (3.125≤CIM≤12.5 ug mL-1) with ITC (0.0078≤CIM≤0.125 ug mL-1) (n=13/16), CIP (3.125≤CIM≤12.5 ug mL-1) with VRC (0.0078≤CIM≤0.0312 ug mL-1) (n=13/16) and CIP (3.125≤CIM≤12.5 ug mL-1) with CAS (2≤CIM≤8 ug mL-1) (n=14/16). For the isolates of H. capsulatum in the filamentous phase synergistic interactions were also observed for all combinations, with emphasis to the associations of CIP (3.906≤CIM≤62.5 ug mL-1) with ITC (0.00006≤CIM≤0.0078 ug mL-1) (n=14/16) and CIP (31.25≤CIM≤125 ug mL-1) with VRC (0.0156≤CIM≤0.125 ug mL-1) (n=16/16). For H. capsulatum in yeast-like phase, few synergistic interactions were observed for the tested drug combinations. None of the tested combinations presented antagonism. The obtained data may point at a new alternative for the treatment of coccidioidomycosis and histoplasmosis. Thus, it is necessary to investigate the mechanisms of action of these drug combinations on the fungal cellular metabolism and to perform in vivo experiments to confirm the relevance of these findings.

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