Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-31T13:58:02Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 804179 bytes, checksum: 1597177b0f14d598cb67395bf82a4ce8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-31T13:58:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 804179 bytes, checksum: 1597177b0f14d598cb67395bf82a4ce8 (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de MInas Gerais / Objetivou-se com este trabalho, avaliar o potencial inseticida de quatro extratos etanólicos e hexânicos das espécies de atemóia (Annona atemoya), camomila (Matricaria chamomilla), cravo-da-índia (Syzygium aromaticum) e pimenta-do-reino (Piper nigrum) em Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). O efeito de toxicidade foi testado com aplicação tópica dos extratos sobre as lagartas. A partir dos resultados do experimento de toxicidade foi escolhido um subvolume dos extratos etanólicos e hexânicos para avaliar os efeitos subletais na praga (período larval, período pupal, período da fase adulta, razão sexual e oviposição). O comportamento dos lepidópteros foi avaliado por meio da preferência alimentar e repelência à oviposição dos adultos. A alimentação foi analisada através de dois experimentos, com e sem chance de escolha em placa de Petri e arena de PVC. Para avaliar o comportamento na oviposição foi conduzido um experimento com chance de escolha (quatro plantas pulverizadas com extratos etanólicos, quatro hexânicos, uma com o solvente e outra sem aplicação com a liberação de cinco casais de mariposas de S. frugiperda). A maior porcentagens de mortalidade foi para o cravo-da-índia etanólico no quinto dia avaliado com 90% de mortalidade. O desenvolvimento larval foi reduzido por atemóia hexânico. O extrato de atemóia etanólico promoveu o menor tempo pupal. O extrato etanólico de cravo-da-índia resultou no menor peso de pupa fêmea e pimenta-do-reino o menor peso para pupas macho. O extrato hexânico de cravo-da-índia resultou no menor tempo da fase adulta e os extratos de pimenta-do-reino e atemóia foram responsáveis por prolongar a fase adulta. A razão sexual foi reduzida pelos extratos de cravo-da-índia e os extratos de atemóia e pimenta do reino reduziram a oviposição e viabilidade dos ovos de S. frugiperda. Quando houve a chance de escolha, os extratos de atemóia e pimenta-do-reino foram os menos preferidos. Atemóia, cravo-da-índia e pimenta-do-reino não foram escolhidos para postura de ovos no teste comportamental e também afetaram a eclosão de ovos no teste subletal. Atemóia, cravo-da-índia e pimenta-do-reino demostraram potencial inseticida e de repelência contra as lagartas de segundo instar de S. frugiperda. / The objective of this work was to evaluate the insecticidal potential of four ethanolic and hexane extracts of the species of atemóia (Annona atemoya), chamomile (Matricaria chamomilla), clove (Syzygium aromaticum) and black pepper (Piper nigrum) in Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). The toxicity effect was tested with topical application of the extracts on the caterpillars. From the results of the toxicity experiment, a subvolume of the ethanolic and hexane extracts was chosen to evaluate the sublethal effects in the pest (larval period, pupal period, adult period, sexual ratio and oviposition). Lepidopteran behavior was evaluated through feeding preference and oviposition repellency of adults. Feeding was analyzed through two experiments, with and without possibility of choice in Petri dish and PVC sand. To evaluate the behavior in the oviposition, an experiment with a chance of choice was conducted (four plants sprayed with ethanolic extracts, four hexanes, one with the solvent and the other without application with the liberation of five pairs of S. frugiperda butterflies). The highest percentages of mortality were for ethanolic cloves on the fifth day evaluated with 90% mortality. The larval development was reduced by hexane atemoia. The extract of ethanol ethanolic promoted the lowest pupal time. The ethanolic extract of clove resulted in the lowest weight of female pupae and black pepper the lowest weight for male pupae. The hexane clove extract resulted in the shortest time of the adult phase and the extracts of black pepper and atemóia were responsible for prolonging the adult phase. The sex ratio was reduced by the clove extracts and the extracts of atemóia and chili pepper reduced the oviposition and viability of S. frugiperda eggs. When there was a choice, the extracts of atemoia and black pepper were the least preferred. Atemoia, cloves and black pepper were not chosen for egg laying on the behavioral test and affected egg hatching in the sublethal test. Atemóia, clove and black pepper showed insecticidal and repellent potential against S. frugiperda second instar caterpillars. / O autor nao enviou a parte impressa até o momento.

A pele desempenha um importante papel na homeostasia e é uma via muito utilizada na administração de fármacos. O envelhecimento compromete sua função protetora e contribui para o aparecimento de sintomas como a rugosidade, flacidez, secura, prurido, hiperpigmentação dificuldade de cicatrização e a incidência de melanomas. Os raios UV são a principal causa do envelhecimento devido à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e peroxidação lipídica. Os danos causados pelos ROS podem ser mitigados pelo uso de antioxidantes tópicos como a curcumina e timol (TML). No entanto, a baixa permeabilidade e estabilidade são fatores limitantes para sua aplicação. Para superar esses desafios, ECUR e TML podem ser encapsulados em nanopartículas, como os carreadores lipídicos nanoestruturado (CLN). Assim, os objetivos desse projeto foi desenvolver um CLN estável com manteiga Illipê, óleo de calêndula e TPGS para co-encapsular ECUR e TML e incorporação em uma formulação tópica. O padrão analítico dos curcuminóides foi isolado de amostra comercial, identificado por LC-MS e RMN e a metodologia analítica para quantificação CUR e TML foi validada. Os CLNs foram produzidos por emulsão quente e sonicação e otimizados utilizando a ferramenta de DoE Box-Behnken. Foram caracterizados em relação às propriedades físicas, citotoxicidade em cálulas HaCaT e atividade antioxidante. O CLN otimizado apresentou tamanho em torno de 130 nm, índice de polidispersão abaixo de 0,200 e potencial zeta negativo. A eficiência de encapsulação foi acima de 97% tanto para TML quanto CUR. CLN com e sem ativos demonstrou baixo índice de recristalização e forma esférica caracterização por DSC e AFM e não foram citotóxicos para células HaCaT, mostrando viabilidade celular superior a 80% na concentração 1,48x1012 partículas/ml, correspondente a 0,8 ?g/ml de TML/CUR co-encapsulados. Além disso, TML/CUR livre e co-encapsulado mostrou alta atividade antioxidante em ensaios in vitro para inibição de xantina oxidade e auto-oxidação do pirrogalol, indicando sua potente capacidade de inibição da enzima superóxido dismutase mesmo quando encapsulados. O emulgel tópico foi desenvolvido e apresentou estabilidade física após a incorporação do CLN no teste de estabilidade acelerada. O perfil reológico do emulgel demonstrou característica plástica e reoplexa e se manteve estável com o tempo e sob as variações de temperatura de analise, indicando alta estabilidade física da formulação. O perfil de liberação de ECUR e TML indicou cinética de liberação correspondente ao modelo de Higuchi sem influência da co-encapsulação na liberação da CUR e com liberação mais lenta do TML encapsulado. Os dados de permeação sugerem que os ativos possam permear na pele. A extensão e a intensidade da permeabilidade dos ativos promovida pelo CLN determinarão a aplicabilidade da formulação que poderá ser interessante para o desenvolvimento de um produto cosmético, dermocosmético, ou mesmo para um medicamento transdérmico. Em conclusão, o CLN desenvolvido apresentou características físicas e biológicas interessantes para a aplicação tópica. / Skin plays an important role in homeostasis and it is an important route for drug delivery. Aging compromises its protective function and contributes to the appearance of symptoms such as roughness, sagging, dryness, pruritus, hyperpigmentation, scarring deficient and the incidence of melanomas. UV rays are the main cause of photo-aging due of ROS generation and lipid peroxidation. ROS damage can be mitigated by using topical antioxidants as curcumin and thymol. However, low permeability and physico-chemical stability are disadvantages for its clinical application. To overcome these challenges, ECUR and TML can be encapsulated in nanoparticles such as nanostructured lipid carriers (NLC). This project aimed to develop a stable NLC composed by Illipê butter, calendula oil and TPGS to co-encapsulate ECUR and TML, followed by the NLC incorporation into a cosmetic formulation. Curcuminoid\'s analytical standard was isolated from commercial sample, identified by LC-MS and NMR, and the analytical methodology for quantification CUR and TML was validated. NLCs were produced by sonication emulsification method and their development was designed by Box-Behnken DoE and characterized in relation to physical properties, HaCaT cell cytotoxicity and antioxidant activity. Optimized NLC with size around 130 nm, polydispersity index (PdI) below 0.200 and negative zeta potential was obtained. The encapsulation efficiency (EE%) was above 97% for both TML and CUR. Empty and co-encapsulated NLC showed in DSC and AFM characterization low recrystallization index and spherical shapes and were not cytotoxic for HaCaT cells, showing cell viability over 80% at the maximum concentration evaluated (1.48x1012 particles / ml, wich corresponds to 0.8 ?g / ml co-encapsulated TML / CUR). Furthermore, free and co-encapsulated TML / CUR showed high antioxidant activity in in vitro assays due inhibition of xanthine oxidation and pyrogallol autoxidation, indicating their potent superoxide dismutase inhibition even when co-encapsulated. The cosmetic emulgel was developed and physically stable after NLC incorporation in accelerated stability. Emulgel rheological profile showed a plastic and rheopexy characteristic, which remained storage stability. The rheological profile did not change due variations in the temperature analysis, indicating good formulation physical stability and cosmetic acceptability. The release profile of ECUR/TML release kinetics corresponded to the Higuchi model without influence of co-encapsulation with slower release of the encapsulated TML. Permeation data suggest that the active substances may permeate deep into skin. The actives permeability extent and intensity promoted by CLN will determine the applicability of the formulation that can be interest for the development of a cosmetic, dermocosmetic product or even for a transdermal drug. In conclusion, the developed CLN presented interesting physical and biological characteristics for topical application.

O NO é uma molécula endógena, envolvida em numerosos processos fisiológicos e patológicos. Diversas substâncias capazes de liberar NO in vivo têm sido estudadas, incluindo os complexos nitrosilo de rutênio, como o [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3, capaz de liberar NO após fotoestímulo. Considerando que as funções específicas do NO dependem de sua localização e cinética de liberação, e que a sua aplicação tópica pode evitar possíveis efeitos colaterais, o objetivo deste trabalho foi estudar a absorção cutânea passiva e iontoforética do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)(NO)](PF6)3, assim como a do NO dele liberado. A atividade citotóxica do complexo também foi estudada em cultura de células tumorais A431 na presença e ausência de luz e de corrente elétrica. Foi desenvolvido e validado um método analítico para a quantificação do complexo de rutênio por CLAE e estudos de pré-formulação de solubilidade, coeficiente de partilha e estabilidade do complexo foram realizados antes dos estudos de penetração cutânea. O complexo de rutênio manteve-se estável em solução aquosa a temperatura ambiente até o período de 48h, mas instável em contato com a pele inteira, com a degradação de 61% após 8h. Em contato apenas com o estrato córneo (EC), no entanto, a degradação do complexo não foi considerada significativa após 4 h. A aplicação de uma corrente elétrica fraca a uma solução do complexo em pH fisiológico não alterou a estabilidade do mesmo, que não apresentou degradação significativa por 6h. Nos estudos de penetração passiva, observou-se por CLAE e por espectrometria de massas com fonte de plasma acoplado (ICP-MS) que o complexo foi capaz de penetrar o EC sem sofrer degradação, mas liberando parte do NO quando em contato com a epiderme viável. A aplicação da iontoforese aumentou significativamente a quantidade de rutênio na epiderme viável e solução receptora (6 e 15 vezes respectivamente), indicando maior penetração do complexo. O complexo Ru-NO assim como seu aquo complexo (formado após liberação do NO), não apresentaram citotoxicidade às células A431, na ausência de luz. A irradiação das células incubadas com o complexo, passivamente, em 377 e 532nm com diferentes doses também não acarretou morte celular significativa. No entanto, a aplicação de corrente elétrica constante (0,3mA cm-2) seguida de incubação por 4h com o complexo levou a morte celular de aproximadamente 50% das células A431 após irradiação em 377 nm com a dose de 10J cm-2. Para atingir este mesmo resultado com a irradiação em 532nm foi necessário aumentar o tempo de incubação com o complexo para 24h. Conclui-se, resumidamente, que a corrente elétrica aumentou a entrada do complexo na pele e nas células, levando a liberação de maior quantidade de NO dentro delas, com consequente morte celular. A liberação do NO do complexo estudado ocorre não apenas por estímulo luminoso mas também por reações de oxi-redução quando em contato com a pele ou com a cultura de células estudadas. Sendo assim, propõe-se a encapsulação deste complexo em sistemas de liberação com o intuito de controlar a liberação do NO. Experimentos preliminares de nanopartículas contendo o complexo estão descritos no Apêndice 1 desta tese. / NO is an endogenous molecule that is involved in numerous physiological and pathological processes. Several compounds capable of releasing NO in vivo have been studied, including nitrosyl ruthenium complexes such as the [Ru (terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 that is capable of releasing NO after photo-stimulus. Because the specific role of NO depends on its location and kinetics of release, and its topical application may avoid possible side effects, the aim of this work was to study the passive and the iontophoretic skin absorption of the [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 complex, as well as its NO release. The cytotoxic activity of the complex was also studied in A431 tumor cells in the presence and absence of light and electrical current. An analytical method for the quantification of the ruthenium complex by HPLC was developed and validated; studies of pre-formulation such as solubility, partition coefficient and stability of the complex were also performed before the penetration studies. The ruthenium complex was stable in aqueous solution at room temperature for 48 hours, but unstable in contact with the full-thickness skin (61% was degraded after 8 h). However, the complexs contact for 4 h with the stratum corneum (SC) alone did not lead to the complex degradation. The application of a weak electric current in a solution of the complex at physiological pH did not affect its stability, which showed no significant degradation for 6 h. In the passive penetration studies it was observed, by HPLC and inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS), that the complex was able to penetrate the SC without degradation, but with some NO release when in contact with the epidermis. The application of iontophoresis significantly increased the amount of ruthenium in the viable epidermis and in the receiver solution (6 and 15 times, respectively), indicating greater complex penetration. The nitrosyl ruthenium complex and its aquo complex (formed after release of NO) showed no cytotoxicity to A431 cells in the absence of light. The irradiation of the cells incubated with the complex, passively, in 377 and 532 nm with different doses also did not cause significant cell death. However, the application of a constant electric current (0.3 mA cm-2) for 30 min followed by incubation for 4 h with the complex led to approximately 50% of A431 cell death after irradiation at 377 nm with a dose of 10J cm-2. To achieve this same result with irradiation at 532 nm it was necessary to increase the incubation time with the complex for 24 hours. In summary, the electric current increased the nitrosyl ruthenium complex skin and cell penetration, leading to release of higher amounts of NO into them, with consequent cell death. Furthermore, the release of NO from the ruthenium complex is showed to happen not only by light stimuli but also by redox reactions when it is in contact with the skin or with the culture of cells studied. Therefore, we propose the encapsulation of this complex in delivery systems in order to control the release of NO. Preliminary experiments with nanoparticles containing the complex are described in Appendix 1.

A terapia gênica por RNA de interferência (RNAi) trata-se de um processo de silenciamento pós-transcricional capaz de suprimir a expressão de um determinado gene. No entanto, para se tornar eficaz, a terapia gênica utilizando siRNA (small interfering RNA - siRNA) é dependente de uma eficiente liberação e expressão do acido nucléico nas células-alvo dentro dos tecidos ou órgãos. A literatura atual mostra algumas propostas de sistemas de liberação tópica de siRNA, entretanto, o uso de nanopartículas híbridas polimérico-lipídicas para complexação e liberação de siRNA na pele para o tratamento tópico de doenças cutâneas, ainda é pouco explorado, o que configura a inovação deste trabalho. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de uma nanopartícula hibrida lipídica associada a um polímero catiônico (NLS-PEI) como sistema de liberação tópica para siRNA, visando a terapia gênica como nova abordagem no tratamento de patologias cutâneas. Primeiramente a composição e o método de produção das NLS-PEI foram otimizados. Como polímero catiônico, utilizou-se a polietilenoimina (PEI). As NLS-PEIs otimizadas, compostas pelo lipídeo Compritol® 888 ATO (2,0%), Poloxamer 188 (1,5%) e PEI (0,15 e 0,25%), apresentaram-se esféricas com superfície lisa e um tamanho médio de 165 nm, potencial zeta médio de +20 mV, concentração de partículas de 1013/mL e com alta estabilidade (90 dias a 4°C). Foi demonstrado, por DSC, que a PEI interage tanto com o tensoativo na superficie das nanoparticulas como também com o lipídeo. A avaliação de comportamento e ação in vitro das NLS-PEIs foi estudada em queratinócitos e fibroblastos, evidenciando que o tratamento não diminuiu a viabilidade celular e houve alta captação verificada por citometria de fluxo (acima de 80% de células transfectadas) e por microscopia confocal. No estudo in vitro de penetração das NLS-PEI complexado com siRNA-FAM em pele de orelha de porco, foi demonstrado a penetração cutânea aumentada de siRNA-FAM a partir das NLS-PEIs. Ensaio in vivo em modelo de inflamação cutânea aguda e crônica mostrou a eficácia das NLS-PEIs contendo siTNF-?, reduzindo a espessura da epiderme em comparação ao grupo controle, reduzindo o rubor, a descamação e os níveis da citocina pró-inflamatória TNF-? e seu RNAm correspondente. A NLS-PEI também promoveu a penetração cutânea das moléculas de siRNA nas camadas mais profunda da pele, in vivo. Diante dos resultados obtidos, podese concluir que as formulações desenvolvidas são sistemas de liberação promissores para administração tópica de siRNA para o tratamento de patologias cutâneas na terapia gênica. / Small-interfering RNA (siRNA) has a high application potential for therapeutic silencing of pathologic or drug-resistance genes. Nonetheless, free siRNA molecules are known to have poor transfection efficiency and biological stability, so a carrier use is necessary. Lipid-polymeric nanocarriers are the new generation of nanoparticulate that have been used as siRNA carrier system and are attracting attention as novel colloidal drug carrier for topical use. In this context, the aim of this study was to develop of hybrid lipidpolyethylenimine nanocarriers (SLN-PEI) as topical delivery systems for siRNA. First, the SLN-PEI composition and production method were optimized. Polyethyleneimine (PEI) was used as cationic polymer. The optimized SLN-PEIs, composed of the lipid Compritol® 888 ATO (2.0%), Poloxamer 188 (1.5%) and PEI (0.15 and 0.25%), were spherical with a smooth surface and average size of 200 nm, mean zeta potential of +20 mV, mean number of particles per mL in the 1013 frame and remained stable for 90 days at 4 °C. It has been demonstrated by DSC that PEI interacts with both the surface surfactant of the nanoparticles and with the lipid. The evaluation SLN-PEI\'s behavior and in vitro action was studied in keratinocytes and fibroblasts, evidencing that the nanoparticles did not decrease cell viability and there was high cellular uptake evidenced by flow cytometry (above 80% of transfected cells) and by confocal microscopy. In the permeation in vitro study, it was demonstrated that SLN-PEI increased cutaneous penetration of siRNA-FAM. In vivo assay, in model of acute and chronic skin inflammation, demonstrated the efficacy of SLN-PEIs carrying siTNF-?, reducing epidermal thickness compared to control group, reducing redness, desquamation and levels of the pro-inflammatory cytokine TNF- ? and its corresponding mRNA. SLN-PEI also promoted penetration of the siRNA molecules in the deeper layers of the skin, in vivo. In view of the results obtained, we can conclude that the formulations developed are promising delivery systems for topical administration of siRNA for the treatment of cutaneous pathologies in gene therapy.

O NO é uma molécula endógena, envolvida em numerosos processos fisiológicos e patológicos. Diversas substâncias capazes de liberar NO in vivo têm sido estudadas, incluindo os complexos nitrosilo de rutênio, como o [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3, capaz de liberar NO após fotoestímulo. Considerando que as funções específicas do NO dependem de sua localização e cinética de liberação, e que a sua aplicação tópica pode evitar possíveis efeitos colaterais, o objetivo deste trabalho foi estudar a absorção cutânea passiva e iontoforética do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)(NO)](PF6)3, assim como a do NO dele liberado. A atividade citotóxica do complexo também foi estudada em cultura de células tumorais A431 na presença e ausência de luz e de corrente elétrica. Foi desenvolvido e validado um método analítico para a quantificação do complexo de rutênio por CLAE e estudos de pré-formulação de solubilidade, coeficiente de partilha e estabilidade do complexo foram realizados antes dos estudos de penetração cutânea. O complexo de rutênio manteve-se estável em solução aquosa a temperatura ambiente até o período de 48h, mas instável em contato com a pele inteira, com a degradação de 61% após 8h. Em contato apenas com o estrato córneo (EC), no entanto, a degradação do complexo não foi considerada significativa após 4 h. A aplicação de uma corrente elétrica fraca a uma solução do complexo em pH fisiológico não alterou a estabilidade do mesmo, que não apresentou degradação significativa por 6h. Nos estudos de penetração passiva, observou-se por CLAE e por espectrometria de massas com fonte de plasma acoplado (ICP-MS) que o complexo foi capaz de penetrar o EC sem sofrer degradação, mas liberando parte do NO quando em contato com a epiderme viável. A aplicação da iontoforese aumentou significativamente a quantidade de rutênio na epiderme viável e solução receptora (6 e 15 vezes respectivamente), indicando maior penetração do complexo. O complexo Ru-NO assim como seu aquo complexo (formado após liberação do NO), não apresentaram citotoxicidade às células A431, na ausência de luz. A irradiação das células incubadas com o complexo, passivamente, em 377 e 532nm com diferentes doses também não acarretou morte celular significativa. No entanto, a aplicação de corrente elétrica constante (0,3mA cm-2) seguida de incubação por 4h com o complexo levou a morte celular de aproximadamente 50% das células A431 após irradiação em 377 nm com a dose de 10J cm-2. Para atingir este mesmo resultado com a irradiação em 532nm foi necessário aumentar o tempo de incubação com o complexo para 24h. Conclui-se, resumidamente, que a corrente elétrica aumentou a entrada do complexo na pele e nas células, levando a liberação de maior quantidade de NO dentro delas, com consequente morte celular. A liberação do NO do complexo estudado ocorre não apenas por estímulo luminoso mas também por reações de oxi-redução quando em contato com a pele ou com a cultura de células estudadas. Sendo assim, propõe-se a encapsulação deste complexo em sistemas de liberação com o intuito de controlar a liberação do NO. Experimentos preliminares de nanopartículas contendo o complexo estão descritos no Apêndice 1 desta tese. / NO is an endogenous molecule that is involved in numerous physiological and pathological processes. Several compounds capable of releasing NO in vivo have been studied, including nitrosyl ruthenium complexes such as the [Ru (terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 that is capable of releasing NO after photo-stimulus. Because the specific role of NO depends on its location and kinetics of release, and its topical application may avoid possible side effects, the aim of this work was to study the passive and the iontophoretic skin absorption of the [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 complex, as well as its NO release. The cytotoxic activity of the complex was also studied in A431 tumor cells in the presence and absence of light and electrical current. An analytical method for the quantification of the ruthenium complex by HPLC was developed and validated; studies of pre-formulation such as solubility, partition coefficient and stability of the complex were also performed before the penetration studies. The ruthenium complex was stable in aqueous solution at room temperature for 48 hours, but unstable in contact with the full-thickness skin (61% was degraded after 8 h). However, the complexs contact for 4 h with the stratum corneum (SC) alone did not lead to the complex degradation. The application of a weak electric current in a solution of the complex at physiological pH did not affect its stability, which showed no significant degradation for 6 h. In the passive penetration studies it was observed, by HPLC and inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS), that the complex was able to penetrate the SC without degradation, but with some NO release when in contact with the epidermis. The application of iontophoresis significantly increased the amount of ruthenium in the viable epidermis and in the receiver solution (6 and 15 times, respectively), indicating greater complex penetration. The nitrosyl ruthenium complex and its aquo complex (formed after release of NO) showed no cytotoxicity to A431 cells in the absence of light. The irradiation of the cells incubated with the complex, passively, in 377 and 532 nm with different doses also did not cause significant cell death. However, the application of a constant electric current (0.3 mA cm-2) for 30 min followed by incubation for 4 h with the complex led to approximately 50% of A431 cell death after irradiation at 377 nm with a dose of 10J cm-2. To achieve this same result with irradiation at 532 nm it was necessary to increase the incubation time with the complex for 24 hours. In summary, the electric current increased the nitrosyl ruthenium complex skin and cell penetration, leading to release of higher amounts of NO into them, with consequent cell death. Furthermore, the release of NO from the ruthenium complex is showed to happen not only by light stimuli but also by redox reactions when it is in contact with the skin or with the culture of cells studied. Therefore, we propose the encapsulation of this complex in delivery systems in order to control the release of NO. Preliminary experiments with nanoparticles containing the complex are described in Appendix 1.

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T01:47:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lourenco_SarahdeMarchi_M.pdf: 4886643 bytes, checksum: 5a7f5c0b7aed7c8f6aea7bd9acf6ae6d (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O Óxido nítrico (NO) é uma espécie radicalar endógena que desempenha papéis importantes em diversos processos fisiológicos, incluindo controle do tônus vascular. Desordens microcirculatórias associadas à depleção da produção endógena de NO são as principais causas de doenças isquêmicas e têm demandado o desenvolvimento de biomateriais capazes de liberarem NO localmente em tecidos. O poli(álcool vinílico), PVA, é um polímero hidroxilado biocompatível já utilizado para propósitos médicos que permite modificações químicas através de reações de condensação com ácidos carboxíli cos. Neste trabalho, utilizamos o ácido mercaptosuccínico (AMS) para preparar membranas de PVA reticuladas quimicamente contendo grupos ¿SH (PVA-SH), capazes de serem posteriormente S-nitrosadas e liberarem NO localmente por vias térmica e fotoquímica. O PVA foi esterificado com AMS em meio acidificado com HCl. As membranas foram moldadas por precipitação da solução polimérica através de imersão em acetona, secas por liofilização e, subsequentemente, S-nitrosadas com ácido nitroso. As membranas de PVS-SH apresentaram cristalinidade reduzida e graus de intumescimento maiores que 600% em água. Medidas por quimiluminescência em tempo real mostraram que as membranas S-nitrosadas são capazes de liberar NO termicamente e que a sua irradiação com luz visível aumenta significativamente a taxa de liberação de NO. Foi demonstrado que estas propriedades de liberação de NO levam à vasodilatação após a aplicação tópica das membranas no antebraço de volun tários saudáveis, mostrando sua potencial aplicabilidade para o tratamento tópico de doenças isquêmicas da pele / Abstract: Nitric oxide (NO) is an endogenous radical species, which plays important roles in many physiological processes, including the control of vascular tone. Microcirculatory disorders associated with the depletion of endogenous NO production are the main causes of ischemic diseases and have demanded biomaterials capable of delivering NO locally to tissues. Poly(vinyl alcohol), PVA, is a biocompatible hydroxylated polymer already used for medical purposes that allows chemical modification through condensation reactions with carboxylic acids. In this work, we used mercaptosuccinic acid (MSA) to prepare SH-containing crosslinked PVA membranes (PVA-SH) capable of being further S-nitrosated to release NO locally through thermal and photochemical pathways. PVA was esterified with MSA in aqueous HCl-acidified medium. The membranes were cast by precipitation of the polymeric solutions, through their immersion in acetone, dried by lyophilization and subsequently S-nitrosated with nitrous acid. The PVA-SH membranes displayed a reduced crystallinity and swelling degrees in water higher than 600%. Real time chemiluminescence measurements showed that the S-nitrosated membranes are capable of releasing NO thermally and that their irradiation with visible light increases significantly the rate of NO release. These NO-release properties promoted local vasodilation after topical application of the membranes on the forearm of health volunteers, showing their potential applicability for the topical treatment of ischemic skin diseases / Mestrado / Físico-Química / Mestra em Química

A modulação da penetração de fármacos na/através da pele representa um desafio para sobrepor o efeito barreira proporcionado pela camada mais externa da pele, o estrato córneo. Sistemas de liberação nanoestruturados e funcionalizados representam uma importante estratégia para promover a penetração de fármacos nas camadas mais profundas da pele. O ácido lipóico (AL) é uma molécula com atividade antioxidante e constitui terapia antioxidante tópica para tratamento de estresse oxidativo e inflamação recorrente em patologias cutâneas. A encapsulação de AL em nanodispersões líquido-cristalinas (NDLCs) funcionalizadas com os peptídeos de penetração celular (PPCs), a saber, os peptídeos D4 e TAT, visa promover a liberação de AL em camadas específicas da pele através de uma estratégia inovadora associando tanto as vantagens de um sistema nanoparticulado como a superfície modificada para melhorar a interação com células e tecido-alvos. Nesse trabalho, foram desenvolvidos e validados métodos de cromatografia líquida de alta eficiência com detectores ultravioleta, eletroquímico e espalhamento de luz evaporativo específicos para quantificação do AL em várias faixas de linearidade para as diferentes etapas experimentais. As NDLCs foram preparadas com monooleato de glicerila, ácido oleico, lipopolímeros, peptídeos TAT e D4 em diversas proporções e associações. NDLCs foram caracterizadas por diferentes métodos. A microscopia de luz polarizada e difração de raios X de baixo ângulo identificaram o sistema líquido-cristalino como fase hexagonal reversa. As técnicas de espalhamento dinâmico de luz e análise de rastreamento mostraram nanopartículas na ordem de 200 nm, estreito índice de polidispersividade, portencial zeta negativo e número de partículas por mL na faixa de 1012. A eficiência de encapsulação foi em torno de 79% e a capacidade de carga (drug loading) de AL nas NDLCs atinigiu 15%. A avaliação de comportamento e ação in vitro das NDLCs foi estudada em queratinócitos e fibroblastos, evidenciando que o tratamento com as NDLCs não diminuiu a viabilidade celular nas células estudadas. A internalização celular das NDLCs comprovada por microscopia confocal a laser e citometria de fluxo foi aumentada com a funcionalização com peptídeo D4 de maneira dependente da concentração e do tempo de incubação e com peptídeo TAT por mecanismo inespecífico. Em estudos de permeação in vitro foi demonstrada a penetração cutânea aumentada de AL a partir das NDLCs. Ensaio in vivo com camundongos hairless expostos à radiação UVB evidenciou a eficácia das NDLCs contendo AL pela atividade de mieloperoxidase ter sido diminuída, além de menor liberação da citocina inflamatória TNF-?, mostrando que as NDLCs desenvolvidas podem ser uma opção de tratamento tópico contra processos de estresse oxidativo e inflamação presentes no envelhecimento cutâneo e outras desordens cutâneas. / The modulation of drug penetration into/ through the skin presents a challenge to overcome the barrier effect provided by the outermost layer of skin, the stratum corneum. Nanostructured and functionalized delivery systems represent an important strategy for promoting drugs penetration into the deeper layers of the skin. Lipoic acid (LA) is a molecule with antioxidant activity and it has application in topical antioxidant therapy for the treatments of oxidative stress and cutaneous inflammation pathologies . LA encapsulation into liquid crystalline nanodispersions (LCNDs) functionalized with cell penetrating peptides (CPPs), namely, D4 and TAT peptides, aims to promote LA release in specific layers of the skin through an innovative strategy combining both the advantages of nanoparticulate system with modified particle surface to enhance the interaction with cell and tissue-targets. In this work, we developed and validated high performance liquid chromatography methods with ultraviolet, electrochemical and evaporative light scattering detectors aiming to achieve specificity to assay LA in several linearity ranges for the different experimental stages. The NDLCs were prepared with glyceryl monooleate, oleic acid, lipopolymers, TAT and D4 peptides in various ratios and associations. LCNDs were characterized by several methods. The polarized light microscopy and small angle Xray diffraction identified the liquid crystalline system as reverse hexagonal phase. Techniques of dynamic light scattering and nanotracking analysis showed nanoparticles in the order of 200 nm, narrow polydispersity index, negative zeta potential and number of particles per mL in the range of 1012. The encapsulation efficiency was around 79%, and LA drug loading in LCNDs reached 15%. Assessment of in vitro behavior and effect of LCNDs was studied in keratinocytes and fibroblasts, demonstrating that LCNDs treatment did not decrease cell viability for studied cells. The cell internalization of LCNDs demonstrated by confocal laser microscopy and flow cytometry was increased by functionalization with D4 peptide in concentration and time of incubation dependent manners and with TAT peptide in a nonspecific mechanism. In vitro permeation studies demonstrated the increased skin penetration of LCNDs loaded LA. In vivo assay with hairless mice exposed to UVB radiation evidenced the efficacy of LCNDs loaded LA by myeloperoxidase activity have been reduced, also reduced release of inflammatory cytokine TNF-?, indicating that the developed LCNDs can be an alternative for topical treatment against processes of oxidative stress and inflammation present in skin aging and other skin disorders.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2220.pdf: 1450706 bytes, checksum: 0253030468c7f8632d10be1f594463aa (MD5) Previous issue date: 2008-08-08 / Universidade Federal de Sao Carlos / Photodynamic therapy (PDT) is a modality for treatment of tumors, and uses a combination of a drug (photosensitizer) and light in the presence of the molecular oxygen to selectively damage target tissue. In the absent of one of these components, the cytotoxic effect is not observed. Since 1990, many works in the literature studies the topical application of precursors of protoporphyrin IX (PpIX) in PDT, such 5- aminolevulinic acid (ALA) and methyl aminolevulinate (MAL). The purpose of this work was realized an comparative study in vivo between two commercial and available drugs precursors of PpIX, the ALAsense (5-aminolevulinic acid - ALA) from Russian and Metvix (methyl aminolevulinate MAL) from United Kingdom. Experiments were carried out in animals to analyze the performance and the ALA photodynamic MAL in liver of rats. The fluorescence spectra of the liver were collected at pre-determined time. The time of accumulation of PpIX was observed by 2 hours and 45 minutes for the ALA and MAL for 4 hours after application of drugs in the liver. The formation, accumulation and depth of penetration of PpIX in liver tissue were determined by fluorescence spectroscopy. Using a total of 21 animals were the irradiation of the liver fotossensibilizado with ALA or MAL alone with different doses of light (20, 50, 100 and 200J/cm2) or in a combination MAL + ALA to 8%, 16% and 32 dose of 100J/cm2. Thirty hours after the lighting, the animals were killed and livers removed. The area of necrosis of the liver was assessed macroscopically and the samples were prepared for histological study, considering especially the aspects and depth of necrosis. In histological analysis were carried out many aspects of necrosis and the normal liver. The depths of necrosis were measured and the threshold dose obtained using a mathematical model proposed in the literature. Moreover, the monitoring was carried out of O2 consumption of mitochondria isolated from livers of rats, after topical administration of drugs precursors of PpIX (ALA and MAL) in order to check the influence of these substances in mitochondrial bioenergetics. The results showed a higher penetration of MAL in the tissue, as well as greater depth of necrosis when compared to the ALA. These results suggest that MAL has a tendency to better photodynamic response than ALA to the criteria studied. / Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica para tratamento de tumores que provoca a destruição do tecido alvo através da combinação de uma droga (fotossensibilizador) e uma fonte de luz na presença de oxigênio molecular. Na ausência de algum desses componentes, o efeito citotóxico não é observado. Desde 1990, têm-se estudado a aplicação tópica de substâncias precursoras da protoporfirina IX (PpIX) associada à TFD, como o ácido 5-aminolevulínico (ALA) e o metil aminolevulinato (MAL). O objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo comparativo in vivo entre duas substâncias precursoras da PpIX , o ALAsense (ácido 5-aminolevulínico - ALA) da Rússia e o Metvix (metil aminolevulinato MAL) do Reino Unido. Foram realizados experimentos em animais para analisar o desempenho fotodinâmico ALA e pelo MAL em fígado de ratos. Os espectros de fluorescência do fígado foram coletados em tempos prédeterminados. O tempo de acúmulo da PpIX observado foi de 2 horas e 45 minutos para o ALA e 4 horas para o MAL após a aplicação da droga no fígado. A formação, acúmulo e a profundidade de penetração da PpIX no tecido hepático foram determinados através da espectroscopia de fluorescência. Utilizando um total de 21 animais foi realizada a irradiação do fígado fotossensibilizado com ALA ou com MAL isoladamente com diferentes doses de luz (20, 50, 100 e 200J/cm2) ou na forma combinada MAL + ALA a 8%, 16 e 32% com dose de 100J/cm2. Trinta horas após a iluminação, os animais foram mortos e os fígados removidos. A área necrosada do fígado foi avaliada macroscopicamente e as amostras foram preparadas para o estudo histológico, considerando, principalmente, os aspectos e a profundidade da necrose. Na análise histológica realizada foram observados vários aspectos da necrose e da região normal do fígado. As profundidades de necrose foram medidas e a dose limiar obtida utilizando-se um modelo matemático proposto na literatura. Além disso, foi realizado o monitoramento do consumo de O2 de mitocôndrias isoladas de fígados de ratos, após administração tópica dos medicamentos precursores da PpIX (ALA e MAL) afim de verificar a influência dessas substâncias na bioenergética mitocondrial. Os resultados obtidos mostraram uma maior penetrabilidade do MAL no tecido, bem como uma maior profundidade de necrose quando comparado ao ALA. Esses resultados sugerem que o MAL possui uma tendência a melhor resposta fotodinâmica que o ALA para os critérios estudados.