Universiẗat, Diss., 2001--Köln.

Universiẗat, Diss., 2005--Bielefeld.

Whereas G-protein coupled receptors (GPCRs) have been long believed to signal through cyclic AMP exclusively at cell surface, our group has previously shown that GPCRs not only signal at the cell surface but can also continue doing so once internalized together with their ligands, leading to persistent cAMP production. This phenomenon, which we originally described for the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) in thyroid cells, has been observed also for other GPCRs. However, the intracellular compartment(s) responsible for such persistent signaling and its consequences on downstream effectors were insufficiently characterized. The aim of this study was to follow by live-cell imaging the trafficking of internalized TSHRs and other involved signaling proteins as well as to understand the consequences of signaling by internalized TSHRs on the downstream activation of protein kinase A (PKA). cAMP and PKA activity was measured in real-time in living thyroid cells using FRET-based sensors Epac1-camp and AKAR2 respectively. The results suggest that TSH co-internalizes with its receptor and that the internalized TSH/TSHR complexes traffic retrogradely to the trans-Golgi network (TGN). This study also provides evidence that these internalized TSH/TSHR complexes meet an intracellular pool of Gs proteins in sorting endosomes and in TGN and activate it there, as visualized in real-time using a conformational biosensor nanobody, Nb37. Acute Brefeldin A-induced Golgi collapse hinders the retrograde trafficking of TSH/TSHR complexes, leading to reduced cAMP production and PKA signaling. BFA pretreatment was also able to attenuate CREB phosphorylation suggesting that an intact Golgi/TGN organisation is essential for an efficient cAMP/PKA signaling by internalized TSH/TSHR complexes. Taken together this data provides evidence that internalized TSH/TSHR complexes meet and activate Gs proteins in sorting endosomes and at the TGN, leading to a local activation of PKA and consequently increased CREB activation. These findings suggest unexpected functions for receptor internalization, with major pathophysiological and pharmacological implications. / G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind nur in Eukaryonten vorhandeln und bilden die größte und diverseste Familie von Zellmembranrezeptoren. Sie reagieren auf eine vielfältige Gruppe von Stimuli die verschiedene Effektoren aktivieren und damit nachgelagerte Signalkaskaden auslösen, die letztlich entscheidend für die Zellphysiologie sind. Die Regelung der Ligand-vermittelten Signaltransduktion wird hauptsächlich durch die Desensibilisierung des GPCR mittels Dephosphorylierung (katalysiert durch GRK) und zusätzlich durch Internalisierung des GPCR gesteuert. Die Annahme, dass GPCRs für cAMP nur an der Zellmembran signalisieren und nicht mehr sobald sie in die Zelle internalisiert wurden, konnte durch wegweisende unabhängige Forschung an GPCRs im Besonderen an TSHR und PTHR geändert werden. So konnte gezeigt werden, dass sie für cAMP nicht nur an der Zellmembran signalisieren, sondern auch, wenn sie in intrazelluläre Zellkompartimente internalisiert wurde. Dieses Phänomen („sustained signaling“ hier „anhaltende Signalisierung“) wurde seitdem für andere GPCRs (z.B. 2-AR, V2R und LHR) beschrieben. Aber die Zellkompartimente wurden für nachhaltige intrazelluläre Signale nicht ausreichend charakterisiert. Das Ziel dieser Arbeit war es die Bewegung und die dynamische Natur der möglichen signalisierenden Kompartimente mittels „real-time TIRF“-Mikroskopie und die Signalisierung unter Verwendung von „real-time FRET“ in primären Maus Schilddrüsenzellen zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit berichtet, dass TSH/TSHR Komplexe internalisieren und ein signifikanter Teil, welcher vom Retromer Komplex angeführt wird, gelangt über den retrograden (rückwärts gerichteten) Transport in das trans-Golgi-Netzwerk (TGN). Diese TSH/TSHR-Komplexe treffen nicht in den frühen Endosomen auf die Gs-Proteine, sondern in den „Sortierer Endosomen“ und in dem TGN. Ein direkter Beweis für Gs Protein Aktivierung und Signaltransduktion am TGN und in Sortierer Endosomen konnte mittels des nanobody Nb37, einem spezifischen Biosensor für das aktive Gs Protein, erbracht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequestrierung von Nb37 an diesen Kompartimenten ein szintillierendes Verhalten in Zeit und Raum zeigt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die katalytische Untereinheit der PKA am Golgi/TGN angereichert ist. Die Behandlung mit Brefeldin A führt zum Verlust dieser PKA Lokalisation am Golgi. Die Beschädigung und Reorganisation des TGN durch Brefeldin A führt zu a) einer abgeschwächten cAMP Reaktion b) einer dreiphasigen PKA Reaktion charakterisiert durch eine schnelle erste Phase, eine langsame (deutlich abgeschwächte) zweite Phase und eine verzögerte dritte Phase und schließlich c) einer abgeschwächte CREB Phosphorylierung. Es gibt Anzeichen dafür, dass die Reorganisation des TGN Kompartimente betrifft, die verantwortlich für intrazelluläre cAMP- und PKA-Signalisierung sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das TGN eines der Kompartimente ist, das für die anhaltende TSHR-Signalisierung verantwortlich ist.

Heidelberg, Univ., Diss., 2007.

Stuttgart, Univ., Diss., 2006.

Techn. University, Diss., 2002--Berlin.

Universiẗat, Diss., 2000--Kiel.

En byggnad bör uppfylla kraven gällande energianvändning och god inomhusmiljö. Byggnadens ventilationssystem arbetar med att upprätthålla god luftkvalitet samt effektiv energianvändning. Genom att styra och reglera luftflödet efter behov med ett Variable Air Volume system (VAV-system) kan ventilationssystemets energianvändning minska utan att göra avkall på luftkvalitén inomhus. VAV-apparater arbetar oftast vid ett lämpligt minimumflöde över tid, vilket medför att VAV- apparatens precision vid låga flöden är viktig. Studien har syfte till att undersöka noggrannheten i flödesmätningar vid låga luftflöden med tre VAV-apparater, som var och en representerar en särskild mätteknik samt med mätmetoderna anemometer och stos. Datainsamlingen genomfördes via mätningarna i laboratoriemiljö. Insamlade mätdata hanterades i kalkylbladsprogrammet Excel. De tre VAV-apparaterna som användes i studien var utrustade med mätmetoderna, tryckskillnad över VAV-spjäll, ultraljud samt tryckskillnad över korslagda pitotrör. För att undersöka VAV-apparaternas, varmtrådsanemometerns och luftflödesstosens mätresultat användes standardiserad strypflänsmätning som referens på grund av dess låga mätosäkerhet. Alla VAV-apparaterna undersöktes för samma börvärden, 4 l/s som lägst och 50 l/s som störst. Experimentet delades in i test 1 och 2. I test 1 jämfördes de olika mätmetoderna med strypflänsens mätresultat. I test 2 undersöktes VAV-apparaternas mätosäkerhet vid två olika inloppsförhållande, rak kanal och 90° böj. Resultatet av studiens tester visade att VAV-apparaternas största mätfel skedde vid de lägsta inställda börvärdena 4–6 l/s. Även de två andra mätmetoderna, flödesstos och varmtrådsanemometer, visade störst mätfel vid de lägsta börvärdena 5 och 10 l/s. För att undersöka hur noggrant VAV-apparaterna reglerade mot det inställda börvärdet jämfördes strypflänsens mätresultat med de inställda börvärdena. Resultatet visade i de flesta fall att dessa luftflöden ej stämde överens med varandra. Resultatet för skillnaden mellan VAV-apparaternas mätresultat när de utsattes för två olika inloppsförhållande visade ingen tydlig indikation på att inloppsförhållandet 90° böj var den förutsättning som gav det största mätfelet förutom för VAV-apparat med ultraljud. Mer erfarenhet av att utföra mätningar hade bidragit till bättre utförda mätningar. Om mätningen skulle utföras med dagens erfarenhet hade det utförts flera mätningar på samma börvärde för att se om mätresultaten varierade eller om det gick att se ett tydligt mönster i resultaten, vilket hade stärkt studiens slutresultat.

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In any underground facilities especially tunnels, it is essential to seal the area against water ingress and leakage of reserved materials. Grouting is a common method used to seal rocks around tunnels, successful grouting reduces the duration and cost of the construction, guarantees better working environment and higher safety, minimizes the maintenance and most important decreases the corresponding environmental hazards significantly. Achieving a sufficient grout spread is one of the prerequisites for a successful and efficient sealing, the penetration of a grout is defined as the length of how far grout penetrates in the rock through fractures from a bore hole. Chemical grouts and cement-based grouts are the prevailing ones among the grouting materials. Despite the better penetrability of chemical grouts, they are unfavorable to use due to environmental hazards associated to them, whilst cement-based grouts are more convenient to use because of their low cost and low environmental impact.The major drawback with cement-based grouts is their limited ability to penetrate the very narrow fractures which is directly related to their filtration tendency which is defined as the tendency of cement grains to agglomerate and build an impermeable filter cake during the flow. Many previous studies investigated the factors that affect the filtration tendency. They drew different conclusions and suggested various methods to improve the penetrability of cement-based grouts.The mixing method is one of the factors that have a great influence on the penetrability of the grout. An effective mixing method improves the dispersion of cement particles in the mixture, thus the penetrability of the grout. As it is known from previous studies, the finer the cement particles the harder to disperse. Grouts based on micro-fine cement (< 30 μm) are essential for the development of grouts that can seal very narrow fractures (20-50) μm compared to (70-80) μm at the present.In this study, the dispersion efficiency of three different mixing methods was evaluated, a conventional lab dissolver equipped with 90-mm disk, a conventional lab dissolver equipped with R/S system and an ultrasound UP400St device. Two cement types, INJ30 and UF12, that are similar in chemical composition but differ in degree of milling were tested. Dispersion was tested with filter pump.The results showed that the conventional lab dissolver equipped with 90-mm disk is ineffective method. The conventional lab dissolver equipped with R/S system is a better method compared to the 90-mm disk but still not effective enough especially when it comes to grouts based on ultra-fine cement (UF12). The ultrasound dispersion is not only the best method between the three methods in comparison, but even more stable and reliable. The best result obtained was grout based on UF12 passing through the 54 μm filter. This could mean that fracture aperture down to 55 μm now can be sealed. This is a significant improvement but there is still a marginal for further improvements. In combination with the dispersion efficiency of different dispersion methods, the study investigated the effect of additives on dispersion in particular and penetrability in general. Results showed that additives do not directly contribute to better dispersion, but they are necessary for better spread since they affect the flow properties.