Ziel dieser Arbeit war es, technologiebedingte Veränderungen im Profil flüchtiger Inhaltsstoffe während der Fruchtsaftverarbeitung aufzuzeigen. Gleichzeitig sollte eine Bewertung von artfremden ‚carry over’-Aromastoffen erfolgen und deren Einfluss auf das Aromaprofil eines Fruchtsaftes beurteilt werden. Hierzu wurden aus unterschiedlichen Phasen der Fruchtsaftherstellung authentische Proben (Direktsäfte, Recovery-Aromen, Saftkonzentrate) von der Schutzgemeinschaft der Fruchtsaftindustrie (SGF) zur Verfügung gestellt. Ergänzt wurde diese Palette durch industrielle Halb- und Fertigwaren, um Abweichungen vom geforderten authentischen Profil zu definieren. Es kamen dabei für die Fruchtsaftverarbeitung wesentliche Fruchtarten (Apfel, Orange, Ananas, Pfirsich und Passionsfrucht) zur Anwendung. Die Bestimmung der Aromaprofile erfolgte anhand validierter qualitativer und quantitativer Aromastoffanalytik. Nach Abtrennung und Anreicherung der Aromastoffe mittels Simultaner Destillation-Extraktion (SDE) wurden die Extrakte per Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS) analysiert. Durch den Einsatz sensorischer Untersuchungen wurden Schwellenwerte von ausgewählten ‚carry over’-Aromastoffen und ‚off-flavour’-Komponenten in fünf verschiedenen Matrices ermittelt. Zusammenfassend lässt sich an Einzelergebnissen festhalten: Das bei Ananasfrüchten erhaltene Aromaprofil entsprach weitgehend Literaturangaben. Während bei den geprüften Recovery-Aromen partiell gute Übereinstimmung mit dem Aromaprofil der Frucht gefunden wurde, war bei den Handelssäften aus Konzentrat meist nur die jeweils bei den entsprechenden Saftkonzentraten ermittelte, praktisch nur von Furaneol determinierte Aromastoffzusammensetzung zu finden. Die geprüften Direktsäfte – sieht man von ihren vergleichsweise hohen Acetoinanteilen ab - zeigten fruchtähnliche Aromaprofile. 2-Ethylhexansäure (2-EHA) wurde als technologiebedingte Kontaminante in Fruchtsäften und Babynahrung festgestellt. In 80% bzw. 73% der geprüften Babynahrung- und Fruchtsaftproben – darunter auch Bio-Produkte - wurde die Substanz nachgewiesen. Die im Tierversuch als teratogen eingestufte Verbindung migriert aus den Deckel-Dichtungen der Glasverpackungen in das Lebensmittel. Orangensaft-Fertigprodukte wiesen im Vergleich zu authentischen ‚single strength’-Proben einen niedrigeren Gehalt an Aromastoffen auf. Empfindliche Aromastoffe wie Ethyl-2-methylbutanoat und Z-3-Hexenal sind in den analysierten Handelsproben nicht mehr detektiert worden. Die Verbindungen Ethylbutanoat, Hexanal und Z-3-Hexenal wurden nur im Essenzöl von Orangen nachgewiesen, nicht aber in Schalenölproben. Eine eindeutige Unterscheidung von (wertvollem) Orangen-Essenzöl und (geringwertigerem) Orangen-Schalenöl ist derzeit ausschließlich anhand von HRGC-MS ermittelter Aromaprofile nicht möglich. Um 13C-markierte Standards zur Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA) zu erhalten, wurden entsprechende Synthesen für die wichtigen Komponenten des Orangenaromas, Limonen und a–Terpineol, durchgeführt. Mittels SIVA ist es möglich, diese Verbindungen in Orangensäften, aber auch in Kosmetika exakt zu quantifizieren. Als Hauptkomponenten des Aromaprofils von Apfelsäften und Recovery-Aromen sind die Verbindungen 1-Butanol, 1-Hexanol, E-2-Hexenal, E-2-Hexenol und Butylacetat bestätigt worden. Das produzierte Saftkonzentrat enthält neben Erhitzungsprodukten wie Furfural keine charakteristischen Apfelaromastoffe mehr. Das ubiquitäre Auftreten in allen industriell frisch gepressten Apfelsäften von 3-Methyl-1-butanol und dessen Acetat, beides bekannte Indikatoren für Gärprozesse, scheint technologisch schwer vermeidbar zu sein. Die große Spanne von 0,01 mg/l bis 2,1 mg/l 3-Methyl-1-butanol in Apfelsaft macht aber deutlich, dass sich der Gehalt an fermentativ gebildeten Komponenten während der Fruchtsaftverarbeitung durchaus gering halten kann. Eine legislative Regulierung zum Vorkommen dieser Stoffe in Apfelsaft ist erforderlich. Bei der destillativen Recovery-Aroma-Gewinnung aus Apfelsäften zeigte sich die Tendenz einer leichten Abreicherung der d2HV-SMOW–Werte von Saft zu korrespondierendem Destillat. Anhand von Korrelationen der ermittelten 13C/12C- und 2H/1H-Daten von 1-Hexanol, E-2-Hexenal und E-2-Hexenol wird deutlich, dass eine Authentizitätsbewertung aber von diesem marginalen Effekt nicht berührt wird. Die Spuren an Fremdaromen zeigen, dass es unter der technologisch üblichen Produktions- und Reinigungspraxis zu Kontaminationen von artfremden Aromastoffen im Verlauf der Fruchtsaftherstellung kommen kann. Die Kombination aus ermittelten Schwellenwerten von ‚carry-over’-Aromastoffen und deren tatsächliches Auftreten in Fruchtsäften zeigte, dass keine sensorische Beeinträchtigung der Produkte vorliegt. Ein höheres Potential, Produkte negativ zu beeinflussen, bergen die in Orangensäften in relevanten Gehalten nachgewiesenen ‚off-flavour’-Komponenten a–Terpineol und Carvon. / The aim of this study was to elucidate technologically caused changes in the profile of volatile components during fruit juice processing. In addition, the occurrence of ’carry-over’ aroma compounds foreign to the species and their influence on the aroma profile should be evaluated. For this, authentic samples from different stages of the fruit juice processing, i.e. ’single strength’-juices, recovery aromas, and fruit juice concentrates, were provided by the Schutzgemeinschaft der Fruchtsaftindustrie (SGF). Included were also industrial semi-finished products and fruit juices purchased in supermarkets, to define variations from the authentic profile. The most important species used for fruit juice processing (apple, orange, pineapple, peach, and passion fruit) were considered. The determination of aroma profiles was carried out by a validated qualitative and quantitative aroma analysis. Aroma compounds were separated and enriched by simultaneous distillation-extraction (SDE) and subsequently analysed by high resolution gas chromatography-mass spectrometry (HRGC-MS). Using sensory tests the thresholds of selected ’carry-over’-compounds and off-flavour-components in five different matrices were determined. Summarizing, the following informations were acquired: The obtained aroma profile of pineapple fruits corresponded to a large extent with that described in the literature. Whereas the recovery aromas accorded, in part, with the profile of the fresh fruit, the pineapple juices made from concentrate showed an aroma profile that was similar to the aroma composition of juice concentrates. These were essentially dominated by furaneol. The commercial ’single strength’-juices under study exhibited, apart from high amounts of acetoin, fruit-like aroma profiles. 2-Ethylhexanoic acid (2-EHA) was found as technological contaminant in fruit juices and baby foods. In 80% of the baby food and 73% of the fruit juice samples under study – among them products labelled ’organic’ – this substance was identified. Being known as teratogenic and potent carcinogeric compound for rodents, 2-EHA migrates from the plastic askets inside the metal lids into the food. Commercial orange juices contained lower amounts of aroma compounds compared to authentic ’single strength’-juices. Sensitive volatile components like ethyl 2-methylbutanoate and Z-3-hexenal were not detected in the commercial orange juices under study. The substances ethyl butanoate, hexanal and Z-3-hexenal were determined only in orange essence oil but not in any orange peel oil. An unambiguous differentiation between the high priced orange essence oil and the less valuable orange peel oil is not possible on the basis of HRGC-MS data to date. In order to obtain 13C-labeled standards for the stable isotope dilution assay, syntheses for important orange flavour compounds, i.e. limonene and a–terpineol were carried out. By means of these standards it was possible to quantify these substances in orange juices and cosmetics (limonene is one of the aroma compounds classified as allergenic and has to be declared on cosmetics containing a defined amount). The components 1-butanol, 1-hexanol, E-2-hexenal, E-2-hexenol, and butyl acetate were verified as main constituents of the aroma profile of apple juices and recovery aromas. Besides heating products such as furfural, the profile of the juice concentrates contained no characteristic apple aroma compounds. The ubiquitous occurrence of 3-methyl 1-butanol and its acetate, both known indicators for fermentation processes, seems to be technologically hard to avoid in industrial ’single strength’-juices. The wide range from 0.01 to 2.1 mg/l shows that the yield of 3-methyl 1-butanol can be minimized during fruit juice processing. Legislative regulations to determine limits of the presence of 3-methyl 1-butanol and its acetate in apple juice are necessary. Using distillative recovery of apple juice aroma the slight trend of a depletion of d2HV-SMOW values was observed from apple juice to the corresponding recovery aroma. The correlation of 13C/12C- and 2H/1H-values of 1-hexanol, E-2-hexenal, and E-2-hexenol showed that the authenticity assessment by stable isotope ratio-mass spectrometry is not affected by this negligible effect. The detected traces of ’carry-over’ components indicate that contaminations of aroma compounds can occur under normal fruit juice production conditions. However, the combination of determined thresholds and the real amounts of the substances in fruit juices showed that the commercial products are not influenced in their sensory quality. ’Off-flavour’ components of orange juices, i.e. a–terpineol and carvon, possess with their relevant amounts an increased potential to affect the taste and odour of commercial products.

In der vorliegenden Arbeit werden instrumentell-analytische Studien zur enzymatischen und chemischen Bildung von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF) und 4-Hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (HMF) – zwei wichtigen Aromakomponenten zahl-reicher Früchte und verarbeiteter Lebensmittel – vorgestellt. Die Studien demonstrieren erstmals die Bildung dieser Verbindungen aus Zuckerphosphaten unter physiologischen Reaktionsbedingungen. Ein Schwerpunkt der Arbeiten lag dabei auf der Bildung von HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat (Fru-1,6-dP) durch den Hefestamm Zygosaccharomyces rouxii. Der Zusatz von 1-13C-Fru-1,6-dP bzw. 13C6-D-Glucose zum Nährmedium der Hefe Z. rouxii zeigte, dass ausschließlich exogen zugesetztes Fru-1,6-dP durch die Hefe zu HDMF transformiert wird. Untersuchungen, in denen der Einfluss verschiedener Wachstumsbedingungen auf die HDMF-Bildung durch Z. rouxii getestet wurde, zeigten bezüglich der HDMF-Bildung ein pH-Optimum bei pH 5.1 sowie eine maximale Produktivität der Zellen bei einer NaCl-Konzentration von 20%. Mittels einer neu entwickelten cKZE-Methode wurde für durch Z. rouxii gebildetes HDMF eine Enantiomerenanreicherung von 27%ee nachgewiesen, was eine enantioselektive Biosynthese durch Enzymsysteme der Hefe impliziert. Als Grundvoraussetzung für den Nachweis einer Enantiomerenanreicherung im HDMF-Molekül stellte sich ein schwach-saurer pH-Wert des wässrigen Mediums heraus. Dies konnte durch Ermittlung der Tautomerisierungsgeschwindigkeit des HDMF-Moleküls mittels 1H-NMR-Spektroskopie belegt werden. Anhand von HPLC-MS/MS-Analysen wurde die Bildung von HMF in zellfreien cytosolischen Rohproteinextrakte aus Z. rouxii, welche mit Fru-1,6-dP und Nicotinamidadenindinucleotiden (NAD, NADH, NADP, NADPH) inkubiert worden waren, nachgewiesen. In Substratstudien wurde HMF nach Applikation von Fru-1,6-dP, D-Fructose-6-phosphat, D-Glucose-6-phosphat, 6-Phosphogluconsäure, D-Ribose-5-phosphat (Rib-5-P) und D-Ribulose-1,5-diphosphat an cytosolische Proteinextrakte nachgewiesen. Die für die Transformationen der Hexosephosphate zu D-Ribulose-5-phosphat (Ribu-5-P) benötigten Enzyme Fructose-1,6-diphosphatase, Phosphohexose-Isomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase konnten mittels spezifischer Enzymassays in den cytosolischen Extrakten nachgewiesen werden. Gebildetes Ribu-5-P wird im Folgenden spontan in HMF umgelagert (> 1%). Die Inkubation von Phosphoribose-Isomerase mit Rib-5-P in Gegenwart von o-Phenylendiamin (o-PD) führte zur Bildung von 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin, das anhand seiner UV-, MS- und NMR-Daten eindeutig identifiziert wurde. Daraus konnte die Bildung von 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) in den Reaktionsansätzen abgeleitet werden, was durch die Synthese der entsprechenden deuterierten bzw. unmarkierten Alditolacetat-Derivate und anschließende HRGC-MS-Analyse abgesichert wurde. Durch Inkubation von 1-13C-Ribu-5-P bzw. 5-13C-Ribu-5-P mit o-PD und HPLC-MS/MS-Analyse der entstandenen Quinoxalinderivate konnte gezeigt werden, dass die Methylgruppe des DPD-Moleküls infolge einer nicht-enzymatischen Phosphat-Eliminierung gebildet wird. Nach Applikation von o-PD an reife Tomaten wurde mittels HPLC-MS/MS ebenfalls 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin detektiert. Dieses Ergebnis impliziert ein genuines Vorkommen von DPD in Tomaten, in deren Aromaextrakten auch HMF nachgewiesen wurde. Somit ist in natürlichen Systemen ebenfalls von einer HMF-Bildung über diese Zwischenverbindung auszugehen. Anhand von HPLC-UV-MS/MS-Analysen wurde eine selektive Bildung von HDMF aus Fru-1,6-dP in Gegenwart von NADH unter milden Reaktionsbedingungen nachgewiesen. Durch Inkubation von 1-13C-Fru-1,6-dP mit [4R,S-2H2]-NADH und anschließender HRGC-MS-Analyse des gebildeten isotopen-markierten HDMF konnte gezeigt werden, dass HDMF infolge eines nicht-enzymatischen Hydrid-Transfers von NADH auf eine aus Fru-1,6-dP abgeleitete Zwischenverbindung gebildet wird. Das Hydrid-Ion wird hierbei selektiv auf C-5 oder C-6 des Kohlenhydratgrundgerüstes des Zuckerphosphates übertragen. Der Zusatz von o-PD und Fru-1,6-dP zum Z. rouxii-Nährmedium und anschließende HPLC-DAD-Analyse führte zur Detektion von drei Quinoxalinderivaten. Diese wurden anhand ihrer MS/MS-Daten und NMR-Spektren als phosphorylierte Quinoxalinderivate identifiziert, aus denen sich die Bildung von 2-Hexosulose-6-phosphat, 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat und 1,4-Dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat in den Nährmedien ableiten ließ. Somit gelang erstmals der Beweis der Bildung von 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat im Nährmedium, einem vielfach postulierten, aber bislang nicht nachgewiesenen Intermediat der HDMF-Bildung aus Fru-1,6-dP. Aufgrund der enantioselektiven Bildung von HDMF durch die Hefen wird daher bei der HDMF-Biosynthese durch Z. rouxii von einer Kombination aus nicht-enzymatischen Reaktionsschritten und einer durch Oxidoreduktasen der Hefezellen vermittelten Reduktion ausgegangen. / The present work represents instrumental-analytical studies on the enzymatic and chemical formation of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (HDMF) and 4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone (HMF), two important flavour compounds in many fruits and processed food. The performed studies demonstrate for the first time the formation of these compounds from carbohydrate phosphates under physiological reaction conditions. Of special interest during these studies was the formation of HDMF from D-fructose-1,6-diphosphate (Fru-1,6-dP) by the yeast Zygosaccharomyces rouxii. The addition of 1-13C-D-Fru-1,6-dP and 13C6-D-glucose to the nutrient medium of Z. rouxii revealed the exclusive formation of HDMF by Z. rouxii from exogenously supplied Fru-1,6-dP. Studies dealing with the formation of HDMF by Z. rouxii under various culture conditions showed an optimal pH value of 5.1 with regard to the yield of HDMF and a maximum formation per yeast cell at 20 % sodium chloride in the nutrient medium. By means of a newly developed cKZE-method for HDMF formed by Z. rouxii an enantiomeric excess value of 27 % ee was demonstrated, implying an enantioselective biosynthesis catalysed by enzymes of the yeast. A slightly acidic pH value of the aqueous medium turned out to be essential for the detection of an enantiomeric enrichment in the HDMF molecule. This was unequivocally proved by the determination of the tautomerization velocity of the HDMF molecule by 1H-NMR spectroscopy. The formation of HMF in cell-free cytosolic protein extracts obtained from Z. rouxii incubated with Fru-1,6-dP and nicotinamide adenine dinucleotides (NAD, NADH, NADP and NADPH) was detected by means of HPLC-MS/MS analysis. HMF was formed from Fru-1,6-dP, D-fructose-6-phosphate, D-glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconate, D-ribose-5-phosphate (Rib-5-P) and D-ribulose-1,5-diphosphate after application to cytosolic protein extracts. Specific enzyme assays revealed activity of fructose-1,6-diphosphatase, phosphohexose isomerase, glucose-6-phosphate dehydro-genase and 6-phosphogluconate dehydrogenase in the cytosolic extracts, enzymes required for the transformation of the hexose phosphates to D-ribulose-5-phosphate (Ribu-5-P). Formed Ribu-5-P is spontaneously converted to HMF (> 1 %). Incubation of ribosephosphate isomerase with Rib-5-P in presence of o-phenylenediamine (o-PD) led to the formation of 2-methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxaline, which was unequivocally identified by its UV-, MS- and NMR-data. Thus, the formation of 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD) in the incubation mixtures could be deduced. The formation of this compound was ensured by its conversion to the respective deuterium labelled or unlabelled alditol acetate derivatives and subsequent HRGC-MS analysis. By incubation of 1-13C-Ribu-5-P as well as 5-13C-Ribu-5-P with o-PD and analysis of the respective quinoxaline derivatives by means of HPLC-MS/MS analysis we demonstrated a formation of the methyl-group in the DPD molecule in consequence of a non-enzymatic phosphate elimination. Application of o-PD to ripe tomatoes led to the detection of 2-methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxaline as well, using HPLC-MS/MS analysis, implying the genuine occurrence of DPD in tomatoes. Since HMF was also detected in aroma extracts obtained from tomatoes of the same sample HMF formation in natural systems via DPD is quite possible as well. A selective chemical formation of HDMF from Fru-1,6-dP in the presence of NADH under mild reaction conditions was detected by means of HPLC-UV-MS/MS analysis. The incubation of 1-13C-Fru-1,6-dP with [4R,S-2H2]-NADH followed by HRGC-MS analysis of the formed isotopically labelled HDMF revealed, that HDMF is produced in consequence of a non-enzymatic hydride-transfer from NADH to an unknown intermediate derived from Fru-1,6-dP. The hydride-ion is selectively transferred to C-5 or C-6 of the carbohydrate skeleton of the sugar phosphate. The addition of o-PD and Fru-1,6-dP to a Z. rouxii culture medium and subsequent HPLC-DAD analysis revealed the formation of three quinoxaline derivatives. By means of their MS/MS-data and NMR-spectra these compounds were identified as phosphorylated quinoxaline derivatives derived from 2-hexosulose-6-phosphate, 1-deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphate and 1,4-dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphate in the culture medium. Thus, for the first time the chemical formation of 1-deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphate in the culture medium was demonstrated, a generally expected but up to now never identified intermediate in the formation pathway of HDMF from Fru-1,6-dP. Due to the enantioselective formation of HDMF by the yeast an HDMF biosynthesis by Z. rouxii consisting of non-enzymatic reaction steps and a reduction mediated by oxidoreductases of the yeast cells was anticipated.

München, Techn. University, Diss., 2005.

Zugl.: Braunschweig, Techn. Univ., Diss., 2008

Unsere Lebensmittel haben eine zweifache, auch vom Gesetz vorgegebene Zweckbestimmung, d.h. sie dienen einerseits dem Genuss und andererseits der Ernährung. Aktuelle For-schungsstrategien in der Lebensmittelchemie auf diesen Gebieten lassen sich dahingehend zusammenfassen, dass im ersten Bereich die Suche nach wirksamen Aromastoffen und deren Vorläufern sowie auch zunehmend Probleme der Herkunftsanalytik im Vordergrund stehen. Auf dem Gebiet der Ernährung spiegeln die Schlagworte „Funktionalität“ und „Bioaktivität“ die derzeitigen Entwicklungen wider. Für alle Bereiche bilden instrumentell-analytische Techniken die Grundlage für Bewertungen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit haben wir daher das uns zur Verfügung stehende analytische Potential genutzt, in den oben genannten Gebieten einschlägige Beiträge zu leisten, d.h. die Suche nach wertgebenden Aromastoffen fortzuführen, Zuckerkonjugate zu untersuchen, die sowohl als Aromavorläufer als auch im Hinblick auf Bioaktivitätsstudien von Bedeutung sein können, und schließlich Methoden zur Herkunftsanalytik zu forcieren. Zu diesen Studien sind als attraktive und wirtschaftlich be-deutsame Rohwaren Rucola (Eruca sativa Mill.) und Kaffee (Coffea arabica) eingesetzt worden. Mit Hilfe der Kopplung aus S-selektiver Detektion und strukturselektiver massen-spektro-metrischer Analytik sind in Extrakten von Rucolablättern 22 schwefelhaltige Verbindungen strukturell charakterisiert worden. Darunter befanden sich neben Minorkomponenten wie 3-Sulfanyl-1-hexanol, Glucosinolatabbauprodukte wie 4-Methylthiobutylnitril, 4-Methylthiobutylthiocyanat und 4-Methylthiobutylisothiocyanat. Mit [1,3]-Thiazepan-2-thion ist eine bislang nicht bekannte Komponente erstmals beschrieben wor-den. Das Vorkommen von 3-Sulfanyl-1-hexanol, welches im Übrigen anhand von MDGC-MS-Analytik in nahezu racemischer Form (44:56 Prozent, R:S) in Rucola gefunden wurde, forderte dazu heraus, in einer Modellstudie eine allgemeine Methode zur Bestimmung der Absolutkonfiguration azyklischer 2- und 3-Sulfanyl-1-alkanole mittels der ECCD-Methode zu entwickeln. Dabei wurden in einer Ein-Schritt-Synthese die funktionellen Grup-pen der 2- und 3-Sulfanyl-1-alkanole (in der Studie handelte es sich um enantiomerenreine 2- und 3-Sulfanyl-1-hexanole) jeweils mit dem Chromophor 9-Anthroylflourid derivatisiert. Die ent-sprechenden CD-Splitkurven erlaubten eine eindeutige Zuordnung der Konfiguration. Die entwickelte Mikro-Maßstab-Methode wurde ebenfalls er-folgreich zur Bestimmung der Absolutkonfiguration von in der Studie als zusätzliche Modellverbindungen eingesetzten 1,2- und 1,3-Diolen angewendet. 3-Sulfanyl-1-hexanol wurde abschließend in einer Zwei-Schritt-Synthese mit 9- und 2-Anthroylflourid derivatisiert, auch diese Variation erlaubte eine eindeutige Zuordnung der Absolutkonfiguration. Mittels präparativer HPLC-Techniken wurden drei neue Flavonoidglykoside aus Rucolablättern isoliert. Deren Charakterisierung erfolgte mittels Tandemmassenspektrometrie sowie ein- und zweidimensionalen NMR-Messungen. Die Verbindungen sind als Quercetin-3,3’,4’-tri-O-beta-D-glucopyranosid, Quercetin-3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-py-ra-nosyl)-3,4’-di-O-beta-D-gluco-pyranosid und Quercetin-3-(2-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyranosyl)-3’-(6-sina-poyl-O-beta-D-glucopyranosyl)-4’-O-beta-D-gluco-py-rano-sid identifiziert worden. Diese Quercetin-Derivate zeigten sowohl hinsichtlich der Glucosilierung des Aglykons (an den Positionen 3, 3’ und 4’) als auch bezüglich der Acylierung ungewöhnliche Strukturen. Bei Rohkaffee hat man bislang keine Studien über das Vorkommen von Zuckerkonjugaten als Aromastoffvorläufer durchgeführt. Wir konnten diese Lücke anhand der Strukturaufklärung der nachfolgend aufgeführten Verbindungen schließen. Durch Kombination verschiedener präparativer Techniken (CCC, LC und HPLC) mit verschiedenen Methoden der Strukturaufklärung (HRGC-MS, HPLC-MS/MS, ein- und zweidimensionale NMR) sind aus Rohkaffee fünf Aromastoffprekursoren isoliert und identifiziert worden. Für die beiden aus Rohkaffee isolierten Linalyldisaccharide wurden als Strukturen 3(S)-Linalyl-3-O-beta-D-glucopyranosyl-(1-6)-alpha-L-arabinofuranosid (AK1) und 3(S)-Linalyl-3-O-beta-D-gluco-pyranosyl-(1-6)-beta-D-apiofuranosid ermittelt. Weiterhin sind erstmals drei neue Aromastoffprekursoren in Form von Zuckerestern, d.h. (3-Methylbutanoyl)-1-O-beta-D-glucopyranosyl-beta-D-apiofuranosid, (3-Methylbuta-noyl)-6-O-alpha-D-gluco-pyranosyl-(1-2)-beta-D-fructofuranosid und (3-Methyl-2-butenoyl)-O-beta-D-gluco-pyranosyl-beta-D-apio-furanosid in Rohkaffee charakterisiert worden. Die Kenntnis der Herkunft bestimmter Lebensmittel bzw. einzelner In-haltstoffe spielt für die Lebensmittelindustrie eine wichtige Rolle. Für die Zuordnung der geographischen Herkunft von Rohkaffee wurden in dieser Arbeit die 13C/12C-, 2H-/1H- und 18O/16O-Verhältnisse von extrahiertem Coffein mittels Elementaranalysator-Isotopen-massen-spektro-metrie (EA-IRMS) bestimmt. Zur Bewertung der Multielement-Messwerte wurden diese statistischen Berechnungen unterzogen. Zur Anwendung kamen die Lineare Diskrimi-nanzanalyse (LDA) und die Auswertung mittels sog. „Classification and Regression Trees“ (CART). In der Anpassung wurde dabei eine Probe aus der Klasse 1 (Provenienz Afrika) der Klasse 2 (Provenienz Amerika) zugeordnet und eine Probe der Klasse 2 der Klasse 1 zugeordnet (Fehlerrate von 5,1 Prozent). Bei Kreuzvalidierung wurden drei der 39 Proben falsch zugeordnet (jeweils zwei der Klasse 1 und eine der Klasse 2), die Fehlerrate betrug hier somit 7,7 Prozent. Die Proben der Klasse 3 (synthetisches Coffein) ließen sich zu 100 Prozent von denjenigen natürlichen Ursprungs unterscheiden. / Our foods exhibit two functions defined by legislation, too, i.e. to provide pleasure and nutri-tive effects. Current research strategies in food chemistry in these areas can be summarized as follows, i.e. that in the first-mentioned area the search for effective aroma substances and their precursors as well as, increasingly, also problems of authenticity assessments predominate. In the area of nutrition, the highlights “functionality” and “bioactivity” reflect the actual research trends. In all areas instrumental-analytical techniques form the fundament of evaluations. Thus, we used our analytical potential to provide new informations in the above-mentioned areas, i.e. to continue the search for valuable aroma compounds, to study sugar conjugates being important as flavour precursors and for bioactivity studies, as well as, finally, to strengthen methods for authenticity assessment. For these studies rocket salad (Eruca sativa Mill.) and green coffee (Arabica coffea), both known as attractive industrially important raw materials, were used. In flavour extracts of rocket salad leaves we characterized 22 sulphur-containing constituents by means of HRGC-MS/SCD analysis. This analytical tool allows parallel detection of com-pounds eluting from the GC column by mass spectrometry (to get structural information) and by chemiluminescence (to get selectively signals of sulphur-containing substances). Among the identified constituents we detected minor compounds such as 3-sulfanyl-1-hexanol, by-products of myrosinase hydrolysis such as 4-methylthiobutyl nitrile, 4-methylthio-butyl thiocyanate and 4-methylthiobutyl isothiocyanate as well as [1,3]-thiazepan-2-thion, the latter described for the first time. By means of multidimensional GC-MS (MDGC-MS) the enantiomeric ratio of 3-sulfanyl hexanol was determined as 44 per cent (R) to 56 per cent (S). In addition, a method for the determination of the absolute configuration of chiral 2- and 3-sulfanyl-1-alkanols (and 1,2 diols and 1,3 diols as model compounds) was developed. We demonstrated for the first time that the CD exciton chirality method can be extended to acyclic 2- and 3-sulfanyl-1-alkanols. The simple one-step derivatization using the 9-anthroate chromophore provided a general microscale method for the determination of the absolute configuration. Exciton coupling between the two 9-anthroate chromophores led to intense positive split CD curves for the (R)-configured 2-sulfanyl-1-alkanols and the (S)-configured 3-sulfanyl-1-alkanols as well as vice versa. The developed method was also useful for the stereochemical assignment of 1,2- and 1,3-diols. Furthermore, the application of the two step-derivatization using two different chromophores for both functional groups (2- and 9-anthroate) also resulted in mirror image split CD curves for both enantiomers, allowing the stereochemical assignment of 3-sulfanyl-1-alkanols. Three novel flavonoid glycosides were isolated of leaves of rocket salad by means of preparative techniques. Structural elucidation was performed using LC-MS/MS as well as one and two dimensional NMR experiments. The compounds were identified as quercetin 3’,4’-tri-O-beta-D-gluco-py-ra-no-side, quercetin 3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl)-3,4’-di-O-beta-D-gluco-py-ra-no-side and quercetin 3-(2-sinapoyl-O-beta-D-glucopyranosyl)-3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl)-4’-O-beta-D-gluco-py-rano-side. These quercetin derivatives exhibited unusual structures as to the glucosylation of the aglycones (at positions 3, 3’ and 4’) and the type of acylation. Studies of bound flavour precursors in green coffee beans (Coffea arabica) have not been carried out to date. We were able to fill out this gap by means of structural analysis of the following compounds. By combination of different preparative analytical steps (CCC, LC and HPLC) with several analytical methods of structural elucidation (HRGC-MS, HPLC-MS/MS, one and two dimensional NMR experiments) five flavour precursors were isolated and identi-fied in green coffee beans. The two isolated linalool disaccharides were identified as 3(S)-linalyl-3-O-beta-D-gluco-py-ra-nosyl-(1-6)-alpha-L-arabinofuranoside and 3(S)-linalyl-3-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl-(1-6)-beta-D-apiofuranoside. In addition, three novel flavour precursors were identified as sugar esters, i.e. (3-methyl-butanoyl)-1-O-beta-D-glucopyranosyl-beta-D-apiofuranoside, (3-methylbutanoyl)-6-O-alpha-D-gluco-pyranosyl-(1-2)-beta-D-fructo-furano-side and (3-Methyl-2-buteno-yl)-O-beta-D-gluco-pyranosyl-beta-D-apio-furanoside. The knowledge of the origin of food and its ingredients is actually one of the major topics for the food industry. For the assignment of the geographic origin of green coffee we determined the ratios of 13C/12C, 2H/1H and 18O/16O of extracted caffeine by means of elemental analysator/isotopic mass spectrometry (EA-IRMS). To check the suitability of the analytical data obtained by EA-IRMS we used statistical calculations, i.e. (i) linear discrimination analysis (LDA) and (ii) validation via classification and regression trees (CART). In the course of adap-tion one sample of class 1 (origin Africa) was assigned to class 2 (origin middle and south America) and vice versa, resulting in an error rate of 5.1 per cent. Using cross validation three of the 39 analyzed samples were assigned incorrectly resulting in an error rate of 7.7 per cent. Samples of class 3 (synthetic caffeine) were discriminated from that of natural origin at a rate of 100 per cent.

Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF) und 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), zwei wichtigen Aromakomponenten in Erdbeeren. Potentielle, mit stabilen Isotopen markierte Vorläufersubstanzen wurden an Erdbeeren appliziert und drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis über den erfolgreichen Einbau erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Anhand der Massenspektren von DMHF und DMMF, die aus den behandelten Erdbeeren mittels Festphasenextraktion isoliert wurden, konnte der Markierungsgrad der Verbindungen ermittelt werden und somit Rückschlüsse über die Effizienz der Metabolisierung der applizierten Zucker zu den beiden Furanonen DMHF und DMMF gezogen werden. Als mögliche Ausgangsstoffe dienten unterschiedlich markierte D-Glucose und D-Fructose, sowie Desoxyzucker, da diese als direkte Vorläufersubstanzen von DMHF und DMMF diskutiert werden. Isotopenmarkierte Desoxy-D-glucose oder Desoxy-D-fructose sind kommerziell nicht erhältlich, weshalb die Verbindungen [1-13C]-1-Desoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-Desoxy-D-glucose und [5,6,6,6-2H4]-6-Desoxyhexulose-1-phosphat zuerst synthetisiert werden mussten. Nach Applikation der Desoxyzucker wurde keine Erhöhung des Markierungsgrades an stabilen Isotopen gegenüber dem natürlichen Isotopenverhältnis festgestellt. Somit können 6-Desoxy-D-glucose, 1-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-D-fructose-1-phosphat als Prekursoren von DMHF und DMMF ausgeschlossen werden. Als gute Vorläufersubstanzen erwiesen sich D-Glucose und D-Fructose. Markierungen (13C und 2H) an Position C-1 oder C-6 der beiden Verbindungen wurden sowohl in DMHF als auch in dessen Methoxyderivat DMMF detektiert, wobei die Applikation von D-Fructose im Gegensatz zur D-Glucose einen höheren Markierungsgrad der Zielverbindungen zur Folge hatte. Durch den Einsatz positionsspezifisch markierter D-Glucose (2H-Markierung an Position C-1, C-2 oder C-4) sollten Aufschlüsse über den Metabolisierungsmechanismus gewonnen werden. Die Markierung der D-[2-2H]Glucose befand sich wie die der D-[1-2H]Glucose in den Methylgruppen der Furanone, was nur durch eine intramolekulare Verschiebung von C-2 nach C-1 erklärbar ist. Diese wurde bei der Glucosephosphatisomerase-katalysierten Umwandlung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat beobachtet. Somit muss D-Glucose bei der Biosynthese von DMHF und DMMF zuerst in diese Intermediate überführt werden. Im Gegensatz zu an Position C-2 markierter D-Glucose ging das Proton an Position C-4 im Laufe der Metabolisierung verloren. Demzufolge findet der in der Natur verbreitete Desoxygenierungsmechanismus von Monosacchariden nicht statt und schließt die Beteiligung von Desoxyzuckern an der Biosynthese von DMHF und DMMF gänzlich aus. Nach Einsatz von uniform markierter D-Fructose konnte sechsfach markiertes DMHF und DMMF identifiziert werden, was durch den Einbau der intakten Kohlenstoffkette zu erklären ist. Dieser Befund und weitere Untersuchungen mit verschiedenen Glykolyse-regulierenden Substanzen deuteten darauf hin, dass die Furanone dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel, der Glykolyse, entspringen. Vor der Aldolase-katalysierten Spaltung in zwei C3-Einheiten muss jedoch eine Abzweigung erfolgen, da sonst die Kohlenstoffkette nicht unverändert vorliegen könnte. Im zweiten Teil der Arbeit ist erstmals mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (OMT) aus Erdbeeren isoliert worden. Hierfür wurde mRNA aus reifenden Erdbeeren extrahiert und eine cDNA Bibliothek hergestellt. Diese wurde mit einer OMT-spezifschen Sonde durchmustert, welche durch PCR mit degenerierten Primern synthetisiert worden war. Nach mehreren Vereinzelungs-Zyklen konnte die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (STOMT, Strawberry OMT) erhalten werden. Northern-Analysen ergaben, dass die entsprechende RNA ausschließlich in den verschiedenen Reifestadien der Frucht akkumuliert, mit den höchsten Transkriptmengen in der rot-werdenden und reifen Frucht. In anderen Gewebeteilen wie Wurzel, Blätter, Stängel und Blüte konnte keine STOMT-RNA nachgewiesen werden. Das korrespondierende Protein zeigte hohe Homologien zu Kaffeesäure-OMTs aus Weidengewächsen der Gattung Populus. Nach erfolgreicher, heterologer Expression von STOMT in E. coli wurde die Substratspezifität des Enzyms untersucht, dessen Temperaturoptimum bei 30°C lag. Alle eingesetzten Substrate mit phenolischem Grundgerüst, wie Brenzcatechin, Kaffeesäure, Kaffeeoyl-CoA und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, aber auch das Furanonderivat DMHF wurden von der rekombinanten O-Methyltransferase umgesetzt. Als bestes Substrat erwies sich 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, das, im Gegensatz zu dessen Methylierungsprodukt Vanillin, bisher in Erdbeeren nicht nachgewiesen werden konnte. Kaffeesäure wurde ebenfalls effektiv methyliert, worin vermutlich die Hauptaufgabe von STOMT in der Pflanze liegt. Die Methylierung von Kaffeesäure oder 5-Hydroxyferulasäure ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung von Lignin. Die Tatsache, dass Erdbeeren teilweise in den Leitbündeln und verstärkt in den Achenen lignifiziert sind, erklärt das Vorhandensein eines solchen Enzyms. DMHF, das als Dienol-Tautomer eine aromatische Struktur mit Hydroxylgruppen aufweist und somit strukturelle Ähnlichkeiten zu phenolischen Verbindungen zeigt, wurde ebenfalls von STOMT als Substrat akzeptiert. Die Bildung von DMMF, dem Methoxyderivat von DMHF erfolgte vergleichsweise langsam, war aber eindeutig auf die Methyltransferase-Aktivität zurückzuführen. STOMT ist aufgrund des Expressionsmusters als fruchtspezifisch und reifeinduziert einzustufen. Primäre Funktion ist vermutlich zu Beginn der Fruchtreifung die Lignifizierung der Leitbündel und später die der Achenen. Gleichzeitig scheint STOMT wesentlich an der Bildung der Aromastoffe DMMF und Vanillin in Erdbeeren beteiligt zu sein. / The present work reveals new insight in the biosynthesis of 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone (DMHF) and 2,5-dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone (DMMF), two important flavor compounds in strawberries. Isotopically labeled precursors were applied to detached strawberries and incubated for three days at room temperature. The successful incorporation of the isotopes was determined by gas chromatography-mass spectroscopy. On the basis of the mass spectra of DMHF and DMMF, isolated from treated strawberries by solid phase extraction, the ratio of labeled and unlabeled compounds was determined. Thus, the conversion of sugars to the furanones DMHF and DMMF could be analyzed in regard to efficiency of metabolism. Differently labeled D-glucose, D-fructose and deoxysugars were used as they are considered to be good precursors of DMHF and DMMF. [1-13C]-1-Deoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-deoxy-D-glucose and [5,6,6,6-2H4]-6-deoxyhexulose-1-phosphate had to be synthesized first since these isotopically labeled deoxysugars are not commercially available. After application of the labeled deoxysugars, the ratio of stable isotopes did not change in comparison with the natural isotopic ratio. As a consequence 6-deoxy-D-glucose, 1-deoxy-D-fructose and 6-deoxyhexulose-1-phosphate can be ruled out as precursors of DMHF and DMMF. D-Glucose and D-fructose were converted efficiently to the furanones. The isotopic label (13C and 2H) from position C-1 and C-6 of both carbohydrates was detected in DMHF and its derivative DMMF. In contrast to D-glucose, D-fructose was metabolized more efficiently to the target molecules as the furanones showed a higher degree of labeling. The use of D-glucose labeled at different positions should provide information about the mechanism of the biosynthesis. The label of D-[2-2H]glucose as well as that of D-[1-2H]glucose was recovered in the methyl group of the furanones. This observation was explained by an intra molecular isotope shift from position C-2 to C-1 which was observed in the course of the conversion of D-glucose-6-phosphate to D-fructose-6-phosphate mediated by phosphohexose isomerase. Consequently, D-glucose has to be transformed into these intermediates prior to the formation of DMHF and DMMF. In contrast to D-glucose, which was labeled at position C-2, the label at position C-4 was lost during the transformation. Therefore, the natural mechanism of deoxygenation might not occur during the biosynthesis of DMHF and DMMF. After application of D-[U-13C6]fructose the incorporation of six 13C atoms into DMHF and DMMF was detected. This implies that the complete carbon skeleton is incorporated. These findings and additional studies with different regulatory substances of the glycolysis indicated that the central metabolism of carbohydrates (glycolysis) is involved in the biosynthesis of furanones. Prior to the final cleavage into two C3-fragments by aldolase, another pathway has to branch off, as otherwise the skeleton can not remain unchanged. In the second part of the thesis the complete cDNA of a O-methyltransferase from strawberry was isolated by the means of molecular techniques. First, mRNA was extracted from turning strawberries to construct a cDNA library. An OMT specific fragment, synthesized by PCR with degenerated primers, was used as probe in order to screen the cDNA library. After few cycles of separation a complete cDNA coding for a putative O-methyltransferase (STOMT, strawberry OMT) was obtained. Northern analysis revealed high abundance in the different stages of fruit ripening while highest RNA levels were found in turning and ripe fruit. On the contrary, there were no STOMT-RNA transcripts in other tissue such as root, leaf, petiole and flower. The corresponding protein showed high homology to caffeic acid OMTs from Salicacea (Populus). STOMT was successfully expressed in E. coli in order to determine the substrate specificity. The enzyme showed highest activity at 30°C. All tested phenolic compounds such as catechol, caffeic acid, caffeoyl CoA and protocatechuic aldehyde as well as the furanone derivative DMHF were accepted by the recombinant O-methyltransferase. STOMT converted most rapidly protocatechuic aldehyde, which has not been detected in strawberry yet, to its methylated counterpart vanillin. Caffeic acid was also accepted to a high degree, which is probably the main function in strawberry. The methylation of caffeic acid and 5-hydroxyferulic acid is an important process in the formation of lignin. The fact that the vascular bundles contain lignin and the achenes are strongly lignified explains the presence of such an enzyme in strawberry. The dienolic tautomer of DMHF exhibiting an aromatic structure with two hydroxy groups shows structural homology to phenolic compounds. Therefore, DMHF was accepted as substrate by STOMT. Although the conversion proceeds quite slowly, unequivocally the methoxy derivative descends from DMHF by OMT activity. In accordance with its expression pattern in strawberry, STOMT is fruit specific and induced during ripening. In the course of the maturation, the primary function of STOMT is probably the lignification of the vascular bundles in the beginning and later that of the achenes. On the other hand, STOMT seems to be substantially involved in the biosynthesis of the flavor compounds DMMF and vanillin, too.

Universiẗat, Diss., 2000--Giessen.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--Berlin.

Zugl.: Dortmund, Univ., Diss., 2008

Universiẗat Diss., 2005--Bonn.