Abstract Cancer progression is a complex multi-step process. Two critical steps in tumor growth and invasion are the proteolytic processing of the extracellular matrix environment and the angiogenic switch enabling blood supply into the tumor. Matrix metalloproteases (MMPs) are a group of proteolytic enzymes involved in physiological and pathological extracellular matrix processing. Trypsinogen, a serine protease, is one of the first proteolytic enzymes characterized. The amount of one of its isoforms, tumor associated trypsinogen-2 (TAT-2) correlates with the malignant phenotype of several forms of cancers. Both of these protease groups are critically dependent on their activation from latent proforms to fully active enzymes. We found that the overproduction of TAT-2 in malignant oral squamous cell carcinoma cell line was associated with elevated proMMP-9 (but not proMMP-2) activation, as well as enhanced cancer cell intravasation in an in vivo model. This indicates that TAT-2 and MMP-9 activation play a role in the invasive growth of oral carcinomas. Proteases are involved in angiogenesis, the formation of new blood vessels, in several ways. One mechanism is the release of cryptic anti-angiogenic molecules from larger extracellular matrix components. Endostatin is one such cryptic endogenous inhibitor of angiogenesis. Certain MMPs were able to cleave endostatin from its parent molecule, collagen XVIII. The endostatin fragments generated by MMP-3, -7, -9, -13 and -20 inhibited angiogenesis in a similar fashion as the native endostatin. The regulation between MMPs and endostatin was shown to be reciprocal, as endostatin was able to block the activation and activities of MMP-2, -9 and -13. The inhibition of these tumor-associated MMPs explains at least in part the anti-tumor activity of endostatin. Endostatin not only affects endothelial cell growth as is usually thought, but it also inhibits the migration of oral carcinoma cells. In addition, cell density and proper concentration were proven to be critical for the activity of endostatin. Arresten is another endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth derived from type IV collagen. We confirmed that arresten binds to integrin α1β1 on endothelial cell surface. We found that this binding is functionally significant for the anti-angiogenic properties of arresten, as tumors planted to integrin α1 knockout mice or endothelial cells derived from those mice did not respond to arresten treatment.

Abstract Collagen XVIII is an evolutionarily conserved, ubiquitously-expressed basement membrane (BM) proteoglycan produced in three isoforms, the individual roles of which are largely unknown. The physiological in vivo roles of these collagen XVIII isoforms are studied here using novel genetically modified mouse strains deficient in either the short or the medium/long isoforms of the molecule. In addition, the effects of keratin-14-driven overexpression of the thrombospondin-1 (Tsp-1) –like domain, which is common to all three collagen XVIII isoforms, are studied. The findings underline the importance of the short collagen XVIII isoform in the eye, as its absence was sufficient to cause the aberrant vascularisation of the retina previously reported in mice lacking all isoforms of collagen XVIII. In addition, an excess of the collagen XVIII Tsp-1 domain led to serious eye abnormalities, possibly by interfering with the functions of the full-length collagen XVIII produced in mice. Collagen XVIII was also shown to contribute to adipogenesis in an isoform-specific manner, in that a lack of the medium/long isoforms of collagen XVIII led to impaired adipocyte maturation and the subsequent reduction in the adipocyte number induced liver steatosis and hypertriglyceridaemia. Hence this work establishes a new extracellular matrix ECM-directed mechanism contributing to control over the multistep adipogenesis programme and points to the functional consequences of its impairment for ectopic fat deposition. The enzymatic remodelling of ECM components results in molecules with novel biological activities. Arresten is a collagen IV(α1)-derived fragment with anti-angiogenic properties which was originally described as not having any direct anti-tumour effects on cancer cells themselves. The present data revealed novel inhibitory roles for arresten in oral squamous carcinoma cell proliferation, survival, motility and invasion. Since arresten is a potent inhibitor of angiogenesis, the data generated here further underline the possibility for using it as a therapeutic agent in cases of cancer. / Tiivistelmä Kollageeni XVIII on tyvikalvojen proteoglykaani ja yksi harvoista evoluutiossa konservoituneista kollageeneista. Se esiintyy elimistössä kolmena isomuotona, joiden biologiset tehtävät ovat vielä jokseenkin epäselviä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin kollageeni XVIII:n isomuotojen fysiologista merkitystä hyödyntäen uusia hiirilinjoja, joilta kollageeni XVIII:n lyhyt tai kaksi pisintä varianttia oli geneettisesti inaktivoitu. Poistogeenisten hiirimallien rinnalle tehtiin kaikille varianteille yhteistä trombospondiini-1 (Tsp-1)-domeinia yli-ilmentävä hiirilinja. Tämän väitöskirjatutkimuksen avulla saatiin uutta tietoa kollageeni XVIII:n ja etenkin sen lyhimmän variantin tärkeästä roolista silmässä. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet kollageeni XVIII:n puutteen häiritsevän silmän verkkokalvon verisuonituksen normaalia kehittymistä. Tässä työssä havaittiin, että pelkästään lyhyen isomuodon puute riitti altistamaan hiiret muutoksille verkkokalvon suonituksessa. Tsp-1-osan ylimäärän havaittiin lisäksi alistavan hiiret muutoksille silmän rakenteessa, mahdollisesti häiritsemällä silmässä jo olemassa olevan kollageeni XVIII:n toimintaa. Tässä työssä havaittiin myös uusi yhteys kollageeni XVIII:n ja rasvasolujen kypsymisen välillä. Verrokkihiiriin verrattuna muodostuvan rasvakudoksen havaittiin jäävän merkittävästi vähäisemmäksi poistogeenisillä hiirillä, joilta kollageeni XVIII:n pitkät isomuodot olivat geneettisesti inaktivoitu. Heikentynyt rasvakudoksen muodostuminen lisäsi triglyseridien kertymistä hiiren verenkiertoon ja maksaan. Tutkimustulos on merkittävä avaus soluväliaineen merkityksestä rasva-aineenvaihdunnalle ja kannustaa lisätutkimuksilla selvittämään, onko kollageeni XVIII:lla yhteys myös ihmisen metaboliseen oireyhtymään. Soluväliaineen komponenttien entsymaattinen muokkaus tuottaa usein molekyylejä, joilla on uusia isäntämolekyyleistä poikkeavia ominaisuuksia. Tässä työssä tutkittiin yhden tällaisen molekyylin, tyvikalvokollageenin IV hajoamistuotteen, arrestenin, suoria vaikutuksia syöpäsoluille. Arrestenin tiedettiin entuudestaan estävän syöpäkasvainten verisuonten uudismuodostusta koe-eläimillä. Työssä osoitettiin, että arresten vaikutti endoteelisolujen lisäksi myös itse syöpäsoluihin estäen niiden lisääntymistä ja vähentäen niiden elinkykyä ja liikkuvuutta, mikä tekee arrestenista entistä houkuttelevamman ehdokasmolekyylin lääkekehitystyöhön.

Abstract The tumor microenvironment (TME) is critically important for tumor development. The microenvironment consists of fibroblasts, endothelial and immune cells as well as extracellular matrix (ECM), proteases and various other soluble factors produced by the cells. It is challenging to develop methods that appropriately mimic the human microenvironment, but this effort is essential in order to reliably elucidate the properties of potential anti-tumor drugs. The aim of this study was to create new 3D organotypic invasion models based on human tissue that would be used to study the effects of the anti-angiogenic molecules arresten and endostatin on tongue squamous carcinoma cells. The classic way to study cancer invasion has been to use a collagen invasion model that is created by mixing rat type I collagen, matrix produced by mouse EHS tumor cells and human fibroblasts. Our research group has developed a novel human myoma tissue based invasion model, which is composed of several different cell types and molecules that are normally present in the human TME. We show how this model is suitable for invasion studies, not only for oral cancer, but for other invasive cell lines as well. There are several matrix-derived fragments that have been shown to possess anti-angiogenic activity. Arresten is a 26 kDa fragment that is cleaved from type IV collagen and is known to inhibit angiogenesis, the formation of new capillaries and tumor growth in vivo. However, its effect on the tumor microenvironment in addition to endothelial cells has not been studied. We show that arresten also directly affects oral cancer cells by decreasing their migration and invasion as well as tumor size, invasion and angiogenesis in in vivo mouse xenografts. Another inhibitor of angiogenesis, endostatin, is cleaved from type XVIII collagen. It has been shown to suppress angiogenesis and tumor growth without toxicity or side effects in mouse models. Our studies show that endostatin directly affects tongue squamous carcinoma cells by reducing their invasion and spreading in organotypic 3D assays and mouse tumor models. In summary, arresten and endostatin are anti-angiogenic as well as anti-invasive molecules and therefore potential cancer drugs. They seem to have a direct effect on carcinoma cells making the cells less invasive. The myoma model allows us to study the effects of anti-cancer molecules with a new prospective. / Tiivistelmä Syövän mikroympäristö on erittäin tärkeä syövän kehittymisen kannalta. Se koostuu fibroblasteista, endoteeli- ja immuunisoluista, soluväliaineesta, proteaaseista ja monista muista solujen tuottamista liukoisista molekyyleistä. On haastavaa kehittää uusia menetelmiä, jotka jäljittelisivät oikeaa ihmisen syövän mikroympäristöä, mutta se on välttämätöntä uusien syöpälääkkeiden tutkimiseksi. Väitöstutkimuksen tavoitteena oli kehittää kolmiulotteinen ihmisen myoomakudokseen perustuvan invaasiomalli, jonka avulla voisimme tutkia verisuonten kasvua estävien arresten ja endostatin molekyylien vaikutusta kielisyöpäsoluihin. Aiemin syövän invaasiota on tutkittu käyttämällä klassista kollageeni-invaasiomallia, joka tehdään sekoittamalla rotan tyypin I kollageeniä, hiiren sarkoomasolujen tuottamaa matriksia ja ihmisen fibroblasteja. Tutkimuksissamme kehitimme uuden invaasiomallin, joka perustuu ihmisen myoomakudokseen. Tutkimuksessa sen todettiin sisältävän monia erilaisia soluja ja molekyylejä, joita on normaalistikkin syövän mikroympäristössä. Lisäksi osoitimme, että se sopii invaasiotutkimuksiin monille syöpätyypeille. Soluvälitilamatriksista pilkotaan useita erilaisia molekyylejä joilla on osoitettu olevan angiogeneesia hillitseviä ominaisuuksia. Arresten on 26 kDa kokoinen polypeptidi, jota pilkotaan tyypin IV kollageenista. Sen tiedetään vähentävän angiogeneesia – uusien verisuonten muodostumista ja syövän kasvua in vivo. Sen vaikutuksia muihin kuin endoteelisoluihin ei ole kuitenkaan tutkittu. Tutkimuksissamme se vaikutti suoraan kielisyöpäsoluihin vähentäen niiden liikkumista ja invaasiota kolmiulotteisissa organotyyppisisssä malleissa ja hiirimallissa. Toinen tutkimamme angiogeneesin inhibiittori on endostatin, jota pilkotaan tyypin XVIII kollageenista. Sen tiedetään vähentävän angiogeneesia hiirimalleissa ilman toksisia sivuvaikutuksia. Me osoitimme tutkimuksissamme, että se vaikuttaa suoraan kielisyöpäsoluihin vähentäen niiden invaasiota ja leviämistä 3D organotyyppisissä malleissa sekä hiirikokeissa. Koska arresten ja endostatin ovat anti-angiogeenisiä ja anti-invasiivisia molekyylejä, ne ovat täten potentiaalisia syöpälääkkeitä. Ne näyttäisivät vaikuttavan suoraan syöpäsoluihin vähentämällä niiden invaasiota. Myoomainvaasiomalli mahdollistaa syöpää ehkäisevien molekyylien tutkimisen uudella ja todenmukaisemmalla tavalla.