A contaminação de ambientes aquáticos por metais pesados é uma ameaça cada vez mais presente em muitos ecossistemas, especialmente próximo a áreas industriais e urbanas. Utilizando a capacidade que os fungos têm de biosorver metais pesados alguns pesquisadores preocupados com esse problema, começaram a estudar técnicas de biorremediação usando microrganismos, dentre eles os fungos. Essa técnica consiste em remover íons tóxicos do ambiente com o auxílio de organismos vivos. Porém, esses íons promovem a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), as quais estimulam a produção de enzimas responsáveis por sua desintoxicação, dentre elas as peroxidases, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), guaiacol peroxidase, e outras. Este trabalho teve como proposta estudar variações nas enzimas antioxidantes em resposta à administração do Cd em uma linhagem do fungo Aspergillus nidulans (MSE), por possuir marcadores em todos os cromossomos e ser considerada um modelo de estudos genéticos. Paralelamente, uma linhagem mutante denominada CadG1 foi selecionada por ser tolerante ao Cd e incluída nos estudos de resposta ao Cd. Foram estudadas as respostas antioxidantes destas linhagens na presença do Cd. O primeiro propósito foi conhecer o comportamento enzimático da linhagem MSE em resposta ao Cd, e para isso foi realizado um experimento básico dividido em duas partes; a primeira envolvendo a determinação de peso seco e a segunda com o propósito de estudar as atividades enzimáticas, nas concentrações de 0, 0,005, 0,01, 0,025 e 0,05 mM de CdCl2, e períodos de tempo de 6, 9, 12 e 24 horas, a partir de um crescimento de 12 horas em meio completo (MC). O segundo propósito do trabalho consistiu numa comparação entre a linhagem MSE, previamente caracterizada, e a linhagem mutante resistente ao Cd (CadG1), utilizando-se concentrações de 0, 0,05, 0,025 e 0,05 CdCl2, pelo período de 24 horas. A linhagem MSE apresentou resposta positiva para as enzimas CAT e GR com o aumento do Cd, a enzima SOD apresentou um aumento não significativo e ainda, houve uma redução significativa na quantidade total de proteínas na concentração de 0,05 mM. O período de tempo que melhor expressou a resposta enzimática ao Cd foi de 24 horas. A linhagem CadG1, tolerante ao Cd, mostrou um aumento de 3,6 vezes na enzima GR, enquanto a MSE aumentou em 2 vezes, no mesmo experimento. Houve uma resposta negativa da CadG1 em relação ao aumento do Cd para a enzima CAT, e não houve resposta significativa para a SOD. Ambas as linhagens não apresentaram a enzima guaiacol peroxidase, tanto no controle como na presença do Cd. Os resultados obtidos sugerem que na linhagem mais sensível ao Cd, a MSE, este metal induziu a formação de peróxido de hidrogênio e, por conseqüência, induziu a atividade de CAT e, em menor escala, a GR. Na linhagem mais tolerante, a CadG1, o mecanismo principal de resposta antioxidante foi a enzima GR, sugerindo que ocorreu eliminação de ROS por meio da glutationa reduzida. / The contamination of aquatic environments by heavy metals has became a serious threat to distinct ecossystems, particularly those nearby urban and industrial areas. Based on the ability of fungi to uptake heavy metals from the environment, research has been focused on bioremediation techniques involving microrganisms such as fungi. Such technique involve the removal of toxic ions from the environment by living organisms. These toxic ions can induce the formation of reactive oxygen species (ROS), which can stimulate enzymes such as, peroxidases, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione reductase (GR), guaiacol peroxidase, among others, that involved in the defense system. The aim of this work was to study the response of antioxidant enzymes of Aspergillus nidulans to Cd exposure. The strain used was the MSE which contains several markers in all cromossomes and has been studied in detail. A Cd-resistant strain, denominated CadG1, was isolated and also used in this study. The first aspect studied was the enzimatic response of the strain MSE to Cd exposure. Initially, the dry weight was determined for MSE in the presence of Cd. After initial growth for 12 h in complete medium, MSE was further grown in the presence of varying concentrations of CdCl2 (0, 0.005, 0.01, 0.025 and 0.05 mM) for 6, 9, 12 and 24 hours. The activities of antioxidant enzymes were analysed in the different treatments. In a separate experiment using 0, 0.05, 0.025 and 0.05 mM CdCl2 for 24 h, the responses of MSE and CadG1 to Cd exposure were compared. MSE exhibited increased CAT and GR activities in response to Cd, whereas SOD also exhibited some increase in activity, but not significant. Soluble protein content was also shown to be reduced in 0.05 mM CdCl2 treatment. The 24 h CdCl2 treatment was shown to be effective to analysed the response to Cd stress. The Cd-resistant CadG1 strain exhibited a 3.6-fold increase in GR activity, while in MSE the increase was in the range of 2-fold. For CAT a negative response was observed for CadG1 whereas for SOD a significant change in activity was not observed. In both, MSE and CadG1 strains, the activity of guaiacol peroxidase was not observed. The results suggest that Cd induces the formation of hydrogen peroxide in MSE, inducing CAT activity and to a lesser extent, GR activity. However, for the Cd-resistant CadG1 strain, the main effect was observed for Gr activity, which was enhanced, suggesting that in this mutant the dismutation of ROS is mainly due to the mechanism involving GR and reduced glutathione.

A contaminação de ambientes aquáticos por metais pesados é uma ameaça cada vez mais presente em muitos ecossistemas, especialmente próximo a áreas industriais e urbanas. Utilizando a capacidade que os fungos têm de biosorver metais pesados alguns pesquisadores preocupados com esse problema, começaram a estudar técnicas de biorremediação usando microrganismos, dentre eles os fungos. Essa técnica consiste em remover íons tóxicos do ambiente com o auxílio de organismos vivos. Porém, esses íons promovem a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), as quais estimulam a produção de enzimas responsáveis por sua desintoxicação, dentre elas as peroxidases, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), guaiacol peroxidase, e outras. Este trabalho teve como proposta estudar variações nas enzimas antioxidantes em resposta à administração do Cd em uma linhagem do fungo Aspergillus nidulans (MSE), por possuir marcadores em todos os cromossomos e ser considerada um modelo de estudos genéticos. Paralelamente, uma linhagem mutante denominada CadG1 foi selecionada por ser tolerante ao Cd e incluída nos estudos de resposta ao Cd. Foram estudadas as respostas antioxidantes destas linhagens na presença do Cd. O primeiro propósito foi conhecer o comportamento enzimático da linhagem MSE em resposta ao Cd, e para isso foi realizado um experimento básico dividido em duas partes; a primeira envolvendo a determinação de peso seco e a segunda com o propósito de estudar as atividades enzimáticas, nas concentrações de 0, 0,005, 0,01, 0,025 e 0,05 mM de CdCl2, e períodos de tempo de 6, 9, 12 e 24 horas, a partir de um crescimento de 12 horas em meio completo (MC). O segundo propósito do trabalho consistiu numa comparação entre a linhagem MSE, previamente caracterizada, e a linhagem mutante resistente ao Cd (CadG1), utilizando-se concentrações de 0, 0,05, 0,025 e 0,05 CdCl2, pelo período de 24 horas. A linhagem MSE apresentou resposta positiva para as enzimas CAT e GR com o aumento do Cd, a enzima SOD apresentou um aumento não significativo e ainda, houve uma redução significativa na quantidade total de proteínas na concentração de 0,05 mM. O período de tempo que melhor expressou a resposta enzimática ao Cd foi de 24 horas. A linhagem CadG1, tolerante ao Cd, mostrou um aumento de 3,6 vezes na enzima GR, enquanto a MSE aumentou em 2 vezes, no mesmo experimento. Houve uma resposta negativa da CadG1 em relação ao aumento do Cd para a enzima CAT, e não houve resposta significativa para a SOD. Ambas as linhagens não apresentaram a enzima guaiacol peroxidase, tanto no controle como na presença do Cd. Os resultados obtidos sugerem que na linhagem mais sensível ao Cd, a MSE, este metal induziu a formação de peróxido de hidrogênio e, por conseqüência, induziu a atividade de CAT e, em menor escala, a GR. Na linhagem mais tolerante, a CadG1, o mecanismo principal de resposta antioxidante foi a enzima GR, sugerindo que ocorreu eliminação de ROS por meio da glutationa reduzida. / The contamination of aquatic environments by heavy metals has became a serious threat to distinct ecossystems, particularly those nearby urban and industrial areas. Based on the ability of fungi to uptake heavy metals from the environment, research has been focused on bioremediation techniques involving microrganisms such as fungi. Such technique involve the removal of toxic ions from the environment by living organisms. These toxic ions can induce the formation of reactive oxygen species (ROS), which can stimulate enzymes such as, peroxidases, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione reductase (GR), guaiacol peroxidase, among others, that involved in the defense system. The aim of this work was to study the response of antioxidant enzymes of Aspergillus nidulans to Cd exposure. The strain used was the MSE which contains several markers in all cromossomes and has been studied in detail. A Cd-resistant strain, denominated CadG1, was isolated and also used in this study. The first aspect studied was the enzimatic response of the strain MSE to Cd exposure. Initially, the dry weight was determined for MSE in the presence of Cd. After initial growth for 12 h in complete medium, MSE was further grown in the presence of varying concentrations of CdCl2 (0, 0.005, 0.01, 0.025 and 0.05 mM) for 6, 9, 12 and 24 hours. The activities of antioxidant enzymes were analysed in the different treatments. In a separate experiment using 0, 0.05, 0.025 and 0.05 mM CdCl2 for 24 h, the responses of MSE and CadG1 to Cd exposure were compared. MSE exhibited increased CAT and GR activities in response to Cd, whereas SOD also exhibited some increase in activity, but not significant. Soluble protein content was also shown to be reduced in 0.05 mM CdCl2 treatment. The 24 h CdCl2 treatment was shown to be effective to analysed the response to Cd stress. The Cd-resistant CadG1 strain exhibited a 3.6-fold increase in GR activity, while in MSE the increase was in the range of 2-fold. For CAT a negative response was observed for CadG1 whereas for SOD a significant change in activity was not observed. In both, MSE and CadG1 strains, the activity of guaiacol peroxidase was not observed. The results suggest that Cd induces the formation of hydrogen peroxide in MSE, inducing CAT activity and to a lesser extent, GR activity. However, for the Cd-resistant CadG1 strain, the main effect was observed for Gr activity, which was enhanced, suggesting that in this mutant the dismutation of ROS is mainly due to the mechanism involving GR and reduced glutathione.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:09:12Z : No. of bitstreams: 1 covizzi_lg_me_sjrp.pdf: 1482206 bytes, checksum: 2f1c1f77dc261f160aba2bc3a1d1ffea (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O uso de células microbianas imobilizadas para aumentar a produção de metabólitos fúngicos em processos fermentativos tem mostrado altos rendimentos. Nesse trabalho foi avaliado pela primeira vez, a imobilização de células do Botryosphaeria rhodina, um fungo ligninolitico produtor constitutivo de lacases. Três suportes foram avaliados: Fibra Acrílica Fina (FAF); Espuma de Poliuretano Expandido (EPE); Espuma de Poliuretano Fibroso (EPF). O EPF foi o melhor suporte por ter mostrado uma imobilização mais homogenia das células. Um planejamento fatorial foi desenvolvido para otimizar a produção de lacases por células livres, na presença de álcool veratrílico (AV). A análise da superfície de resposta mostrou que 18mM como a melhor concentração de AV para a produção de lacases, usando-se 3 mL de homogeinato de células como inóculo (DOλ400nm 0.4-0.6) para 25 mL de meio de cultura em frascos de 125mL, a 180 rmp, durante 126 horas a 28ºC. O perfil de crescimento do fungo, associado a produção de lacase foram comparados na presença e na ausência de AV, usando-se células livres e células imobilizadas do B. rhodina. A imobilização aumentou aproximadamente 3 vezes a produção de lacases e manteve estável o nível de produção durante 6 reciclos. A imobilização de células do B. rhodina mostrou-se útil uma vez que economizou 72horas para atingir a maior produção de lacase, quando comparada com células livres e também aumentou a tolerância do fungo a concentrações mais altas de AV (500mM) / The use of microbial immobilized cells to increase the production of fungal metabolites in fermentation processes has showed higher yields. This work evaluated by the first time, the immobilization of Botryosphaeria rhodina cells, a ligninolytic fungus that produces laccase. Three carriers were evaluated: acrylic fine fiber (FAF), expanded polyurethane foam (EPE), and fiber polyurethane foam (EPF). The EPF was the best carrier because showed a homogeneous immobilization cells. A factorial design was developed in order to optimize the laccase production by free cells in the presence of the laccase inducer veratryl alcohol (VA). The analysis by response surface answer showed 18 mM as the best VA concentration to produce laccase using 3 mL of a cell homogenate (ODλ400nm 0.4-0.6) as inoculum, to 25 mL of culture medium in shaked flasks (125 mL) at 180 rpm, during 126 hours at 28 °C. A growth profile for laccase and fungal biomass production were compared with and without VA using free and immobilized cells of B. rhodina. The cell immobilization increased approximately 3 folds the laccase production and maintained it stable during 6 consecutive recycles. The cell immobilization of B. rhodina showed to be useful once saved 72 hours to achieve the higher laccase production when compared to the one with free cells, and also increased the fungal cell tolerance at higher VA concentrations (500 mM)