La méiose ovocytaire comprend une succession de deux divisions cellulaires, sans phase intermédiaire de réplication de l'ADN, permettant l'haploïdisation du gamète femelle en vue de la fusion des génomes parentaux lors de la fécondation. Le caractère fortement asymétrique de ces divisions permet l'expulsion du matériel génétique surnuméraire, dans de petits globules polaires, tout en conservant l'essentiel des ressources cytoplasmiques qui seront nécessaires au développement précoce de l'embryon. De nombreuses études réalisées sur l'ovocyte de souris ont mis en évidence les capacités intrinsèques du gamète à rompre sa symétrie en positionnant son fuseau de manière excentrée à proximité du cortex. En se positionnant de la sorte le fuseau induit, via un gradient de Ran-GTP porté par les chromosomes, une polarisation du cortex ovocytaire qui permettra de restreindre le site d'émission des futurs globules polaires. Cette polarisation se caractérise notamment par une forte accumulation de filaments d'actines dépendante du facteur de nucléation Arp2/3. Nos travaux nous ont permis de mettre en évidence le rôle de Cdc42-GTP, via l'activation de N-WASP, comme intermédiaire entre le gradient de Ran-GTP et la polymérisation polarisée des filaments d'actine. Nous nous sommes également intéressés à la localisation des protéines ERM (Ezrin Radixin Moesin), connues pour favoriser la formation des microvillosités membranaires. Dans l'ovocyte, les microvillosités et les ERM sont toutes deux exclues du cortex polarisé et nous avons pu démontrer le rôle de Ran-GTP dans ce processus. Enfin, nous avons étudié la localisation du réseau d'acto-myosine cortical lors de la deuxième division méiotique qui nécessite la rotation du fuseau de l'ovocyte de souris. Nos résultats révèlent l'existence de deux sous-populations de myosine 2 corticale, l'une dépendante de la chromatine (Ran-GTP/Cdc42-GTP) et l'autre dépendante du fuseau central (Ect2/RhoA). / Oocyte meiosis is accomplished through two successive rounds of cellular divisions, without DNA replication, allowing for gamete haploidization necessary for parental genome fusion after fertilization. These divisions are highly asymmetric and allow extra-DNA expulsion, in small polar bodies, while retaining most of the cytoplasmic resources needed for early embryo development. Studies in mouse oocyte have demonstrated the capabilities of the gamete to autonomously break his symmetry by positioning the spindle near the cortex. By doing so, the spindle is able to induce a cortical polarization that is dependent on a Ran-GTP gradient emanating from the chromosomes. This polarization will be necessary for delimiting extrusion sites of the future polar bodies. A polarized accumulation of Arp2/3 actin filaments is one of the most evident features of oocyte polarization. We have shown that polarization of Cdc42-GTP, trough N-WASP activation, is an essential intermediate between Ran-GTP and the polarized polymerization of actin filaments. We also investigated ERM (Ezrin Radixin Moesin) proteins localization that are known to promote microvilli assembly. According to our data, microvilli and ERM are excluded from the polarized cortex in a Ran-GTP dependent manner. Finally, we studied cortical acto-myosin dynamics during the second meiotic division which requires spindle rotation. We demonstrated the existence of two cortical myosin 2 sub-populations which depend either on chromosomes (Ran-GTP/Cdc42-GTP) or on the central spindle (Ect2/RhoA).

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第20213号 / 理博第4298号 / 新制||理||1617(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)講師 嶋田 知生, 教授 長谷 あきら, 教授 鹿内 利治 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DFAM

Les divisions méiotiques sont très asymétriques en taille et génèrent une très grosse cellule, l'ovocyte, et deux petites cellules, les globules polaires. Cette asymétrie est permise par la migration du fuseau lors de la première division jusqu'au cortex le plus proche. Cette migration ne dépend pas des microbutules mais de la Myosin-II et d'un réseau de filaments d'actine nucléé par la coopération des nucléateurs de filaments droits Formin-2 et Spire1/2. Des observations préliminaires effectuées au laboratoire ont décrit un épaississement du cortex d'actine pendant la migration du fuseau, mais pourtant il avait été montré que la tension corticale, un paramètre décrivant la rigidité de l'ovocyte, diminue pendant la migration du fuseau. J'ai montré que cet épaississement est indispensable à la migration du fuseau et est nucléé par le nucléateur de filaments branchés Arp2/3, sous le contrôle de la voie Mos/MAPK. De plus, il provoque la diminution de la tension corticale en délocalisant la Myosin-II, ce qui est indispensable à la migration du fuseau. Finalement, j'ai montré que le chute de tension est un mécanisme d'amplification du déséquilibre des forces présent initialement (grâce au léger décentrage du noyau) qui déclenche la migration du fuseau. / Meiotic divisions are highly asymmetric divisions in size, generating a big cell, the oocyte, and two tiny cells, the polar bodies. This asymmetry is ensured by the migration of the first meiotic spindle to the closest cortex. This migration does not depend on microtubules but on Myosin-II and an F-actin meshwork nucleated by cooperation of straight filament nucleators Formin-2 and Spire1/2. Preliminary studies in the lab described a thickening of the F-actin cortex during spindle migration, but paradoxically cortical tension, a physical parameter describing the stiffness of the cell, drops during spindle migration. I have shown that this thickening is required for spindle migration and nucleated by the branched actin nucleator Arp2/3, under the control of the Mos/MAPK pathway. Furthermore, it promotes the decrease in cortical tension by triggering the delocalization of Myosin-II from the oocyte cortex, which is crucial for spindle migration. Finally, I have shown that the drop in cortical tension is an amplificatory mechanism to the initial unbalance of forces (due to a slight off-centered position of the nucleus) triggering the motion of the spindle.

No description available.

Aurora-A (AurA) est une sérine/thréonine kinase jouant un rôle majeur dans le cycle cellulaire. Elle est connue pour son rôle oncogène et les compagnies pharmaceutiques développent des inhibiteurs ciblant son activité kinase. Cependant, il a été montré chez différentes espèces qu’Aurora-A possède des rôles indépendants de son activité kinase et agit également comme suppresseur de tumeur quand son activité kinase est altérée. Ceci pose donc un problème dans le développement des inhibiteurs car cibler l’activité kinase d’Aurora-A pour traiter le cancer pourrait mener à l’effet inverse. Pour résoudre ce dilemme, j’ai étudié en détail les phénotypes de mutants AurA nul et hypomorphe chez Drosophila melanogaster. J’ai étudié à la fois les défauts de développement en me basant sur le temps de pupation des larves et le rôle de suppresseur de tumeur en me basant sur les neuroblastes du cerveau central. Dans ce modèle, une caractéristique des suppresseurs de tumeur est leur capacité à induire la formation de neuroblastes supplémentaires dans le cerveau central conduisant à une surcroissance du cerveau. Chez les mutants AurA, la taille du cerveau est plus petite jusqu’à 96h de développement larvaire. Cependant, la pupation arrivant normalement entre 96h et 120h de développement larvaire est retardée chez le mutant et les larves ont une taille plus importante. Chez les mutants en retard de pupation le cerveau devient plus gros que ceux du contrôle. Le cerveau des mutants AurA a une importante augmentation du nombre de cellules positives pour Deadpan, un marqueur spécifique des neuroblastes et ce, avant que le cerveau des mutants AurA devienne plus grand que celui du contrôle. De plus, les disques imaginaux d’ailes et la glande annulaire sont clairement plus petits que ceux du contrôle à 96h de développement larvaire et les larves mutantes atteignent les stades L2 et L3 plus tôt. En conclusion, les mutants AurA montrent 1) une avance dans leur développement précoce certainement reliée au défaut de croissance de la glande annulaire ; 2) un retard de pupation ressemblant à celui observé en cas de défauts dans la voie de l’ecdysone, certainement dû à des défauts de croissance des disques imaginaux d’ailes ; 3) une surcroissance du cerveau à mettre en lien à la fois avec une augmentation du nombre de pseudo-neuroblastes et avec le retard de pupation. / Aurora-A (AurA) is a major kinase playing various roles in cell cycle. It’s a well-known oncogene and companies are developing drugs inhibiting its kinase activity. However, it has been shown in different species that AurA can have a kinase independent role or act as a tumor suppressor when its kinase activity is altered. This represents a problem for drugs development as inhibiting AurA kinase activity only could lead to life threatening phenotypes. To address this dilemma, we carefully deciphered phenotypes of AurA null and AurA hypomorph mutants in Drosophila melanogaster using the pupation as readout for development timing and larval central brain neuroblasts as model for tumorigenic study. One readout to define a tumor suppressor in this model is a brain overgrowth phenotype associated to central brain neuroblasts over-proliferation. In AurA mutants, brain size appears slightly smaller until 96h of larval development. However, pupation occurring normally between 96 and 120h of larval development is delayed in AurA mutants and larvae have an increased size. In this “delayed” mutant larvae, brains are eventually bigger than wild-type controls. Furthermore, AurA mutant central brains show a huge increased number of cells positive for deadpan, a marker of neuroblast identity, even before the appearance of brain over-growth phenotype. Additionally, wing discs and ring glands are clearly smaller in AurA mutants at 96h compared to control and mutant larvae reach L2 and L3 developmental stage earlier than control. In conclusion, AurA mutants have: 1) a precocious developmental advance certainly related to ring gland growth defect; 2) a pupation delay which resembles Ecdysone pathway timing defects certainly due to wing discs growth defect; 3) an enlarged brains phenotype due to an increased of the number of neuroblast-like cells and the pupation delay.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a disorder caused by loss-of-function mutations in dystrophin, a critical protein that maintains muscle fiber integrity. Our lab discovered that dystrophin-deficient skeletal muscle stem cells, also known as satellite cells, cannot generate enough myogenic progenitors for proper muscle regeneration. Previously, we demonstrated that WNT7A, a protein expressed during muscle regeneration, stimulates symmetric division of satellite cells, and gives rise to two daughter satellite cells. Conversely, epidermal growth factor (EGF) induces asymmetric division, which generates one daughter satellite cell and one committed precursor cell. We aimed to investigate these satellite cell division mechanisms following WNT7A or EGF treatment in a human model using healthy and DMD-patient derived hiPSCs differentiated into the myogenic lineage. The presence of satellite-like cells was confirmed in both lines by their characteristic expression of PAX7 and other myogenic markers. Intriguingly, DMD-patient hiPSCs precociously differentiated compared to healthy control human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). More notably, WNT7A treatment had a potent effect on the DMD differentiated cells. High content analysis revealed an expansion of the satellite-like cell pool as observed by a higher number of PAX7+ cells within the total population and gene expression analysis demonstrated a significant increase in global PAX7 expression. In contrast, EGF treatment reduced the number of PAX7+ cells and increased the proportion of MYOG+ cells within the myogenic population, indicating an increase in myogenic progenitors. Taken together, WNT7A and EGF can alter the myogenic differentiation program of healthy and DMD-patient derived hiPSCs by modulating the satellite-like cell division dynamics.

The regulation of muscle stem cell (MuSC) asymmetric division plays an essential role in controlling the growth and repair of skeletal muscle. Perturbations in MuSC function have been demonstrated in disease and aging contexts such as Duchenne’s Muscular Dystrophy (DMD) and sarcopenia. We developed and optimized a high content analysis platform combining lineage tracing, myofiber culture, imaging, and bioinformatic analysis to determine modulators of muscle stem cell division. We discover kinase domain receptor (KDR) as a positive modulator of MuSC asymmetric division and confirmed its expression in satellite cells by ddPCR and immunofluorescence. Knockdown of KDR significantly reduces the numbers of asymmetric divisions, whereas ligand stimulation of KDR increases the numbers of asymmetric divisions. KDR signaling is impaired in dystrophin- deficient satellite cells and requires a polarized cell environment established by the dystrophin glycoprotein complex (DGC) to direct asymmetric division. Mice lacking KDR in MuSCs exhibit reduced numbers of satellite cells due to precocious differentiation, and deficits in regeneration consistent with impaired asymmetric division and reduced generation of progenitors. Therefore, our experiments identify KDR signaling as playing an essential role in MuSC function in muscle regeneration. These findings further our understanding of muscle stem cell biology, and in particular, the role of asymmetric division under homeostatic and regenerative conditions.

No description available.