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Investigação in vitro de atividade antirretroviral e citotóxica de peptídeos da peçonha de escorpiõesMata, Élida Cleyse Gomes da 16 December 2016 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-13T15:40:17Z
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2016_ÉlidaCleyseGomesdaMata.pdf: 20672845 bytes, checksum: a126098842e2704babe5730ae79a7ae9 (MD5) / O presente trabalho avaliou as atividades antirretroviral e citotóxica de 9 peptídeos sintetizados a partir da análise transcritômica parcial de bibliotecas de cDNA obtidas das glândulas de peçonhas de diferentes espécies de escorpiões. Foram utilizados o Vírus da Imunodeficiência Símia/SIV e o HIV defectivo, em linhagens celulares humanas linfoblásticas, leucocitárias primárias e estabelecidas aderentes para a detecção de atividade antirretroviral, assim como citotóxica dos peptídeos sintéticos. Incluíram-se ensaios de viabilidade celular com azul de Tripan, citotoxicidade quantificando-se LDH e citometria de fluxo com detecção de Anexina/Iodeto de propídio. Os peptídeos escorpiônicos 1, 2, 4 e 6 reduziram a produção de SIV em células HUT-78 e 174X100, dentre os quais, os peptídeos 1 e 6 reduziram em 50% a viabilidade celular, em concentrações de 50 μM e 12,5 μM, respectivamente, tornando-os mais adequados aos ensaios. Em análises finais, o peptídeo 6 a 3,12 μM reduziu em 75% a produção viral em relação ao controle de células unicamente infectadas. Células HUT-78 tratadas com o peptídeo 6 e infectadas com SIV, unicamente produziram IL-8, enquanto que os leucócitos primários apresentaram níveis detectáveis de IFN-γ, IL-4, IL-6 e IL- 10. Em estudos de morfologia ultra-estrutural detectou-se o brotamento de virions de SIV unicamente em leucócitos primários infectados, enquanto que os tratados com o peptídeo 6 e AZT, infectados com SIV, não se detectou o brotamento viral. Observou-se lesões citoplasmáticas, extravasamento de material nuclear e acúmulo de cromatina na membrana perinuclear em leucócitos primários tratados com o peptídeo 6, compatível com os resultados obtidos por citometria de fluxo. Exclui-se a possiblidade de lise celular por destruição de membranas, visto que virions infectivos tratados em altas concentrações do peptídeo 6 não inibiram a infecção viral. Ensaios preliminares com células HeLa P4 previamente tratadas com o peptídeo 6 e transfectadas com plasmídeo pCHIV carreando o genoma defectivo de HIV, apresentaram redução da progênie viral quando comparada à produção de células transfectadas sem tratamento, células transfectadas e tratadas posteriormente com peptídeo 6 e tratadas com AZT. De modo geral, os experimentos de cultivo celular com o peptídeo 6 e posterior infecção viral, demonstraram que, nos intervalos iniciais, ocorre forte redução do número de células nas populações em tratamento, no entanto, após 96 horas as células proliferam, ultrapassando o número de células não tratadas, exercendo forte impacto quando avalia-se a interferência nos mecanismos de replicação viral, resultando na redução de progênie viral. Propõe-se que os mecanismos de proteção celular, em resposta à toxicidade do peptídeo 6, induz a expressão de citocinas, dosadas neste estudo e, muito provavelmente, fatores de restrição viral induzidos principalmente por IFN-γ, e modulados por IL-6, IL-10 e IL-4, ademais de outras citocinas e quimiocinas que não foram quantificadas neste estudo. / The present work evaluated the antiretroviral and cytotoxic activity of 9 synthetized peptides based on the transcriptome of the partial cDNA library of different Scorpions venenom glands. The Simian Immunodeficiency Virus/SIV and the defective HIV were utilized in human cell lineages, lymphoblastic cells, primary leucocytes and adherent cells, to screen for antiretroviral activity as also the peptides cytotoxicity. There were included assays for cell viability with trypan blue, citotoxicity quantifying LDH and flow citometry for detection of annexin/propidium iodide. The scorpionic peptides 1, 2, 4 and 6 reduced the SIV production in HUT-78 and 174XCEM cell lines, and among them, the peptides 1 and 6 reduced by 50 % the cell viability at 50 μM and 12,5 μM concentration, respectively, which was more suitable for the assays. In final analyses, the peptide 6 at 3,12 μM concentration reduced at 75 % the SIV production compared to untreated cells but infected. HUT-78 cells treated with peptide 6 and SIV infected solely produced IL-8 while the primary leucocytes displayed detectable levels of IFN-γ, IL-4, IL-6 and IL-10. In morphological ultrastructural studies it could be detected the budding of SIV virions exclusively in infected primary leucocytes, while among leucocytes treated with peptide 6, AZT and SIV infected, no virions budding were observed. Cytoplasmatic lesions, leaking of nuclear material and chromatin condensation in the perinuclear region were evident in leucocytes treated with peptide 6, which was compatible with the results obtained by flow cytometry analysis. It was excluded the possibility of cell lysis by membrane destruction, as infectious virions treated with high concentrations of peptide 6 did not inhibit viral infection. Preliminary assays with HeLa P4 cells previously treated with peptide 6 and transfected with the pCHIV plasmid carrying a defective HIV genome, showed viral progenie reduction when compared with the production of transfected cells without treatment, transfected cells subsequently treated with pepetide 6 and cells treated with AZT. In a general way, the cell culture experiments with peptide 6 and subsequent viral infection showed that, in the initial intervals, a strong cell number reduction occur, but after 96 hours the cells proliferate, outnumbering the untreated cells, exerting significative effect when evaluating the interference in the mechanisms of viral replication, which culminates in the reduction of viral progenie. It is proposed that the mechanisms of cell protection, in response to the peptide 6 toxicity, induce the expression of cytokines, quantified in this work and, very probably, viral restriction factors mainly triggered by IFN-γ, and modulated by IL-6, IL-10 e IL-4, besides other cytokines and chemokines that were not quantified here.
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Avaliação de atividade antiretroviral de plantas amazônicas utilizando como modelo o vírus da imunodeficiência símiaMata, Élida Cleyse Gomes da 28 March 2011 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Marília Freitas (marilia@bce.unb.br) on 2011-08-23T16:32:50Z
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ÚLTIMA VERSÃO PARA IMPRIMIR! (Reparado).pdf: 1997179 bytes, checksum: d4d46d318aab6c42192ba32b4465e607 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2011-08-23T16:33:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1
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ÚLTIMA VERSÃO PARA IMPRIMIR! (Reparado).pdf: 1997179 bytes, checksum: d4d46d318aab6c42192ba32b4465e607 (MD5) / Plantas amazônicas das famílias Apocynaceae, Rubiaceae, Fabaceae, Caesalpiniaceae, Ochnaceae, Clusiaceae, Arecaceae, Chrysobalanaceae e Olacaceae coletadas em solo amapaense foram testadas quanto à atividade antiviral utilizando como modelo o Vírus da Imundeficiência Símia/SIV. Das 20 amostras analisadas, o extrato aquoso de apenas uma planta, da família Fabaceae, exibiu forte inibição da replicação viral sem contudo alterar a cinética da divisão celular de linha linfoblástica estabelecida, H9. Além da atividade antiretroviral detectada, observou-se que, dependendo da concentração do extrato da planta ensaiada, potencial atividade antineoplásica exercem determinadas plantas neste estudo, visto que as linhagens celulares utilizadas para a replicação do SIV, foram estabelecidas a partir de linfoblastos transformados de pacientes humanos com diagnóstico de leucemia/linfoma. Estes resultados preliminares fundamentam estudos que conduzam ao desenvolvimento de fármacos ou mesmo fitoterápicos com ação antiretroviral e antineoplásica. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antiretroviral activity was assayed among 20 samples of amazonian plants belonging to the families Apocynaceae, Rubiaceae, Fabaceae, Caesalpiniaceae, Ochnaceae, Clusiaceae, Arecaceae, Chrysobalanaceae and Olacaceae. All plants were colected in northern Brazil, in the Amapa state. Just one of the aqueous plant extract of the Fabaceae family here investigated strongly inhibited the replication of the Simian Immunodeficieny Virus in cell culture. Besides antiretroviral activity, some plants depending on the extract concentration interfered in the cell division pointing out to some possible and potential antineoplastic activity as the cell lines utilized in these assays were established from transformed lymphoblasts obtained of human patients diagnosed with leukemia and lymphoma. These preliminary results are promissing as a fundamental basis for the development of antiretroviral and anti-cancer new drugs and as new phytotherapics concerning retrovirus infection and neoplasia.
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