O câncer de pele pode ser do tipo melanoma ou não melanoma, sendo comum em pessoas acima de 40 anos, de pele clara ou com doenças cutâneas prévias. A incidência do melanoma é baixa, porém, é considerado o mais agressivo e mortal devido ao seu alto poder metastático. A cirurgia ainda é a forma de tratamento mais empregada para a doença, sendo muito invasiva e, portanto, terapias coadjuvantes estão sendo empregadas a fim de melhorar a qualidade de vida dos pacientes, como o laser de baixa potência (LBP). Sabe-se que o LBP pode desencadear efeito bioestimulatório em culturas celulares crescidas sob déficit nutricional, porém em linhagens tumorais sua ação é controversa. Dessa forma, o objetivo desse estudo consiste em investigar os efeitos inibitórios do LBP no comportamento de células de melanoma murino B16F10 e humano SKMEL 37 utilizando um laser de emissão infravermelha (λ = 780 nm) com diferentes densidades de energia. Foram adotados 4 grupos experimentais: G0 (grupo controle), G30 (30 J.cm-2), G90 (90 J.cm-2) e G150 (150 J.cm-2) a fim de verificar a viabilidade celular, através do ensaio de MTT e vermelho neutro; o comportamento de invasão celular, obtido através do ensaio de invasão transwell; e o papel do LBP na expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), verificado através do ensaio imunoenzimático ELISA. Os resultados mostraram que a densidade de energia de 30 J.cm-2 estimulou o comportamento de invasão da linhagem celular B16F10. Por outro lado, o LBP não exerceu influência na expressão do fator de crescimento endotelial vascular, na viabilidade celular, e na atividade mitocondrial de ambas as linhagens celulares, em nenhuma das densidades de energia utilizadas, em comparação ao controle. / Skin cancer can be melanoma or non-melanoma type, being usual in people over 40 years of age, caucasian and with previous skin diseases. Its incidence is low, however, it is considered the most aggressive and fatal due to its great capacity of metastasis. Surgery is the most commonly treatment, nonetheless is highly invasive and therefore coadjuvant therapies, such as low level light (LLL) are being employed to improve patients quality of life. It is known that LLL has a biostimulatory effect in cell cultures growing in nutritional deficit, however in tumor cell lines its effects remain controversial. Thus, the aim of this study is to evaluate the inhibitory effect of LLL on the behavior of murine and human melanoma cells using an infrared LLL (λ = 780nm) delivering different energy densities. For this purpose, four experimental groups were designed: G0 (control group), G30 (30J/cm2), G90 (90J/cm2), G150 (150J/cm2) to verify cell viability by MTT and neutral red assay; the cell invasion behavior, obtained through the transwell invasion assays; and the role of LLL in the vascular endothelial growth factor expression, as verified by the enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that the lowest energy density stimulated the invasion behavior of B16F10 cells. On the other hand, LLL had no influence in the vascular endothelial growth factor expression, cell viability or in the metabolic activity of both cell lines in any energy density used when compared to control group.

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-17Bitstream added on 2014-06-13T19:24:36Z : No. of bitstreams: 1 sousa_db_dr_botfmvz.pdf: 488884 bytes, checksum: cee00747e11c814a32c18443659e8194 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Várias pesquisas foram desenvolvidas visando a melhoria da congelabilidade do sêmen ovino. Contudo, ainda não houve progressos significativos na fertilidade do sêmen congelado após a inseminação artificial cervical. Diversos sistemas de análise computadorizada do movimento espermático (CASA) têm sido propostos e aplicados na tentativa de quantificar características específicas do movimento espermático, podendo ainda determinar a presença e a cinética das subpopulações de espermatozóides. Muitos testes para avaliar a função espermática foram desenvolvidos, permitindo analisar simultaneamente diferentes aspectos da função espermática. Análise da função mitocondrial oferece uma maneira de acessar a motilidade espermática. Foram objetivos otimizar o sistema CASA na avaliação do sêmen congelado; determinar parâmetros da cinética espermática que expressem analogia com as características da avaliação das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial (IP, FITC-PSA e JC-1; MITO; R-123) e utilizar conjuntamente os parâmetros fornecidos pelo sistema CASA e pelas sondas fluorescentes para agrupar as amostras de maneira qualitativa. Vinte e seis amostras de sêmen congelado de diferentes carneiros foram estudadas pelo CASA obtendo-se para os parâmetros VCL, VAP, VSL, ALH, BCF, LIN, STR, ELONG dados médios e individuais para cada espermatozóide e por sondas fluorescentes para a avaliação simultânea da integridade de membrana plasmática, reação acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Estatisticamente aplicou-se a análise exploratória de técnicas multivariadas obtendo-se três fatoriais sendo o primeiro fator F1 positivo e alto para as variáveis VAP, VSL, STR e LIN, que é interpretado com um fator relacionado à progressividade. Para o segundo fator F2, associam as variáveis VCL, ALH e MT, que representam um fator de deslocamento... / Many researches were developed to improve the ram semen criopreservation. However, no significant advances in the fertility rates with the frozen semen were observed with cervical artificial insemination. Several computer-assisted motility assessments (CASA) systems have been considered and applied in the attempt to quantify specific characteristics of the sperm motion and still them being able to determine the spermatozoa presence and subpopulations kinematics. A large number of sperm functions evaluation had been developed, making it possible to analyze different aspects of the sperm function simultaneously. Analysis of the mitochondrial function offers a way to have access the sperm motility. The aim of this study was to optimize the CASA system in the evaluation of the ram frozen semen; determine parameters of the sperm kinematics that express analogy with the characteristics of the evaluation of plasmatic, acrossomal and mitochondrial membranes (PI, FITC-PSA and JC-1; MITO; R-123) and use CASA parameters together with the fluorescent probes to group samples in a qualitative way. Twenty and six frozen semen samples of different rams were evaluated by CASA system for mean and individual sperm motion parameters VCL, VAP, VSL, ALH, BCF, LIN, STR, ELONG and for fluorescent probes leads for the simultaneous evaluation of the integrity of plasmatic, acrossomal membranes and membrane mitochondrial potential. The statistic applied was multivariate analysis getting to three different factorials. The first factor was positive and high (F1 factor) for variables VAP, VSL, STR and LIN, that were interpreted with the forward displacement. For F2 factor, there were associate variables VCL, ALH and MT that represent the displacement. The F3 factor, whose interpretation has to do with available energy, was associated with variables BCF, MITO and ELONG...(Complete abstract, click electronic address below)