Pruritus tritt verstärkt bei älteren Menschen auf und ist mit vielen verschiedenen Dermatosen unterschiedlichen Ursprungs vergesellschaftet. Pruritus und ein fortgeschrittenes Lebensalter sind auch charakteristisch für die häufigste blasenbildende Autoimmundermatose, das bullöse Pemphigoid. Im prämonitorischen Stadium treten häufig nur Juckreiz und unspezifische Hautveränderungen auf. Das Prodromalstadium eines bullösen Pemphigoids dauert wenige Wochen bis zu mehreren Jahren. Ziel dieser Arbeit war es, die pruriginösen Erkrankungen Prurigo simplex subacuta [L28.2], Prurigo nodularis [L28.1], eosinophilenreiche Dermatitis [L30.8] und Prurigoform eines atopischen Ekzems [L20.0] im Hinblick auf das klinische, laborchemische und histologische Bild bei der Erstdiagnose der Erkrankungen auszuwerten. Insbesondere sollte überprüft werden, ob bei der Erstdiagnose typische Autoantikörper einer subepidermalen blasenbildenden Autoimmundermatose (BP180, BP230) nachgewiesen werden konnten und trotz des letzendlich ungewöhnlichen Erscheinungsbildes letztlich ein bullöses Pemphigoid vorgelegen haben könnte. Es erfolgte eine retrospektive Auswertung der oben genannten pruriginösen Erkrankungen, die über einen Zeitraum von über 10 Jahren in der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie des Universitätsklinikums Würzburg behandelt wurden. Die Patienten wurden gemäß ICD-Kodierung in die vier oben genannten Gruppen unterteilt. Nebst Patientencharakteristika wurden die Parameter direkte Immunfluoreszenz (DIF), indirekte Immunfluoreszenz (IIF), ELISA-Testverfahren, Immunoblot, eosinophile Granulozyten, Gesamt-IgE, histologische Untersuchung, Dermographismus und Blasenbildung ausgewertet. Es konnten insgesamt 325 Patienten in die Studie eingeschlossen werden, bei denen bei der Erstdiagnose einer pruriginösen Erkankung eine IIF auf der humanen Spalthaut und/oder auf dem Affenösophagus als Substrat veranlasst wurde. Es konnten bei insgesamt 54 (16,7%) Patienten Autoantikörper gegen IgG oder IgA mittels IIF nachgewiesen werden. Bei 42 (76,4%) Patienten wurde eine weiterführende Diagnostik mittels DIF durchgeführt, die bei 37 (88,1%) Personen als negativ befundet wurde. Bei fünf (11,9%) Patienten konnten Autoantikörper gegen IgG, IgA und IgM nachgewiesen werden. Alle stammten aus der Gruppe mit einer Prurigo simplex subacuta [L28.2]. Bei diesen fünf Patienten wurde zusätzlich noch ein ELISA-Test durchgeführt. Nur bei einem Patienten konnten Autoantikörper gegen BP180 und Desmoglein 1 nachgewiesen werden. 66 Mit dieser Studie konnte aufgezeigt werden, dass bei Patienten mit den Erkrankungen Prurigo simplex subacuta [L28.2], Prurigo nodularis [L28.1], eosinophilenreiche Dermatitis [L30.8] und Prurigoform eines atopischen Ekzems [L20.0] keine erhöhte Bildung von Autoantikörpern gegen die dermoepidermale Junktionszone stattfindet. Dennoch sollte bei Patienten mit pruriginösen Erkrankungen eine serologische Untersuchung mittels IIF – und im Falle einer Positivität mittels ELISA und ggf. DIF durchgeführt werden, vor allem bei älteren Patienten, bei welchen der Pruritus als führendes Symptom beschrieben wird, um die Diagnose einer bullösen Autoimmundermatose sicher ausschließen zu können. Zudem sollte eine Verlaufskontrolle über mehrere Jahre erfolgen, um die Auswirkung des Pruritus als Trigger auf die Bildung von Autoantikörpern einer bullösen Autoimmundermatose zu verfolgen. / Pruritus can be caused by many different dermatoses of different origin with older people suffering more often from pruritus. At the same time, Pruritus and advanced age are characteristics of the most common blistering autoimmune dermatosis, bullous pemphigoid. In the pre-monitoring stage, often only itching and non-specific skin changes occur. The prodromal stage of bullous pemphigoid lasts from a few weeks to several years. The aim of this work was to describe the pruritic diseases prurigo simplex subacuta [L28.2], prurigo nodularis [L28.1], eosinophil-rich dermatitis [L30.8] and prurigoform atopic eczema [L20.0] with regards to the clinical and laboratory-chemical aspects and to evaluate the histological picture in the initial diagnosis of the diseases. In particular, this work evaluated whether typical autoantibodies of a subepidermal blistering autoimmune dermatosis (BP180, BP230) could be detected in the initial diagnosis and whether bullous pemphigoid may have been present despite the unusual appearance. A retrospective evaluation of the above-mentioned pruritic diseases, which were treated over a period of more than 10 years in the Department of Dermatology, Venereology and Allergology of the University Hospital Würzburg, was carried out. The patients were divided into the four groups mentioned above according to ICD coding. In addition to patient characteristics, the parameters direct immunofluorescence (DIF), indirect immunofluorescence (IIF), ELISA test methods, immunoblot, eosinophilic granulocytes, total IgE, histological examination, dermographism and blistering were evaluated. A total of 325 patients was included in the study, in which an IIF was induced in the human split skin layer and/or in the monkey esophagus as substrate at the initial diagnosis of a pruritic disease. Autoantibodies against IgG or IgA could be detected in a total of 54 (16.7%) patients using IIF. In 42 (76.4%) patients, further diagnostics were carried out using DIF, of which 37 (88.1%) people were negative. Autoantibodies against IgG, IgA and IgM could be detected in five (11.9%) patients. All came from the group with prurigo simplex subacuta [L28.2]. An ELISA test was also performed on these five patients. As a result autoantibodies against BP180 and desmoglein 1 could only be detected in one patient. This study was able to show that patients with the diseases prurigo simplex subacuta [L28.2], prurigo nodularis [L28.1], eosinophilic dermatitis [L30.8] and prurigoform atopic eczema [L20.0] do not have an increased formation of autoantibodies against the dermoepidermal junction zone. Nevertheless, in patients with pruritic diseases, a serological examination using IIF - and in the case of positivity using ELISA and possibly DIF - should be carried out especially for elderly patients who describe pruritus as the leading symptom, in order to reliably diagnose bullous autoimmune dermatosis to be able to rule out. In addition, a follow- up examination should be carried out over several years in order to track the effect of pruritus as a trigger for the formation of autoantibodies in bullous autoimmune dermatosis.

Zusammenfassung Hintergrund: Das saure Gliafaserprotein (GFAP) kommt im ZNS vor allem in Astrozyten vor und spielt eine Rolle bei der Astrozytose, die wiederum ist ein pathogenetisches Merkmal von HIV-assoziierten neurologischen Erkrankungen (HAND). In dieser Arbeit wird das Vorkommen von GFAP-Autoantikörpern bei PLWH und deren Bedeutung bei der Entstehung von HAND untersucht. Außerdem wird eruiert, ob GFAP-Autoantikörper als Marker eines neurokognitiven Defizites bei HAND in Frage kommen. Methoden: Homogenisiert Gewebeschnitte von verschiedenen Gehirnareale wurden mittels SDS-Gelelektrophorese und Western Blot auf Membranen übertragen. Diese Membranen wurden mit Blutproben aus der HAND-1 Studie inkubiert. Der Nachweis von GFAP-Antikörpern erfolgte indirekt mittels eines IgG-Antikörpers. Die Anti-GFAP Signalintensitäten wurden semiquantitativ ausgewertet und mit den Daten der neurokognitiven Test der HAND-1 Studie korreliert. Egebnisse: Die GFAP-Autoantikörper Signalintensität unterscheidet sich je nach Gehirnareal (p < 0,0001). Insbesondere die DM-Signale sind signifikant stärker als die der anderen Areale (p < 0,01). Es lässt sich insgesamt kein signifikanter Unterschied in der Signalstärke zwischen Menschen mit HIV und Kontrollen feststellen (p = 0,1742). Bei der HIV-Gruppe zeigt das Gesamtergebnis des MMS einen signifikanten, negativen und starken Zusammenhang mit der GFAP- Antikörpersignalintensität der Areale DM (p = 0,004), ST (p = 0,011), MC (p = 0,007) und FC (p = 0,002). Es konnten keine signifikanten Korrelationen zwischen den CD4-Zellzahlen und den Anti-GFAP Signalintensitäten festgestellt werden. Bei der Kontrollgruppe fanden sich lediglich vereinzelt signifikante Korrelationen. Diskussion: Diese Promotion ist die bis dato erste Veröffentlichung, in der GFAP-Autoantikörper bei Menschen mit HIV gemessen wurden. Dass kein Unterschied im Vorkommen von GFAP-Ak bei PLWH und der Kontrollgruppe gefunden wurde, könnte an der geringen Teilnehmendenzahl oder am Mangel von Teilnehmenden mit HAD liegen. Andererseits könnte es auch dafür sprechen, dass anti-GFAP nicht obligat pathogen ist, sondern erst nach Übertritt über die Blut-Hirn-Schranke pathologische Folgen hat. Für diese Hypothese spricht die Erkenntnis, dass eine höhere Menge von GFAP-Ak mit einem schlechteren Abschneiden bei neurokognitiven Tests korreliert. Demnach könnten sich GFAP-Autoantikörper als diagnostische und möglicherweise prognostische Marker eines neurokognitiven Defizites bei HAND eignen. / Abstract Background: The glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the most important structural protein of astrocytes. It plays a role in the process of astrocytosis, which is a response of astrocytes to injury that is pathogenetic for HIV associated neurological diseases (HAND). This dissertation aims to examine the presence of GFAP autoantibodies in people living with HIV (PLWH) and the antibodies’ role in the development of HAND. Methods: Tissue sections of different brain areas were homogenized. Using SDS-Gelelectrophoresis and Western Blotting the proteins were then transferred onto membranes. Those membranes were incubated with blood samples from the HAND-1 study. A specific IgG antibody was used to detect GFAP antibodies. The anti-GFAP signals were evaluated with a semiquantitative method and correlated with data from neurocognitive tests done for the HAND-1 study. Results: Overall, there was no significant difference in anti-GFAP signal strength between PLWH and members of the control group (p = 0,1742). The intensity of the GFAP autoantibody signal differed depending on the brain area (p < 0,0001). The signals from the medulla oblongata region were significantly stronger that those from other areas (p < 0,01). There was a significant and strong negative correlation between the results of the neurocognitive tests and the intensity of the GFAP autoantibody signal. There was no significant correlation between the CD4 cell count and the GFAP antibody signal level. Discussion: To the best of our knowledge, this is the first time anti-GFAP was measured in PLWH. There was no significant difference in the amount of anti-GFAP found in PLWH and members of the control group. This could be due to the limited number of study participants or participants with HIV associated dementia (HAD). However, we hypothesize that GFAP autoantibodies are not intrinsically toxic but that they could have pathologic effects once they cross the blood brain barrier. The finding that the amount of GFAP antibodies correlates with the severity of the neurocognitive deficit supports this hypothesis. Due to this correlation GFAP antibodies are worth considering as a diagnostic and prognostic biomarker of neurocognitive deficits in people with HAND.

Aktuell herrscht in der Wissenschaft Unklarheit über die pathologischen Prozesse, die durch Caspr2-aAK ausgelöst werden. Dissens herrscht, ob es durch die aAK im Serum oder im Liquor zu einer Internalisierung von an der Zellmembran exprimierten Caspr2 kommt. Ebenso ist nicht abschließend geklärt, inwieweit die Struktur des VGKC durch die aAK-Bindung verändert wird. Mit der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Pathomechanismus von Caspr2-aAK vorgenommen, indem die Oberflächenexpression von Caspr2 in DRGs im Langzeitversuch näher untersucht wurde. Dafür wurden zunächst die Caspr2-aAK in den Patientenseren mithilfe immunzytochemischer Färbungen in vitro sowohl in transfizierten HEK293, als auch in adulten DRGs nachgewiesen. Zusätzlich wurde mit der Membranpräparation von Caspr2 transfizierten HEK293-Zellen die Caspr2 Bindung mittels proteinbiochemischen Nachweises verifiziert. Es wurde zudem eine Subklassenbestimmung an den 9 vorliegenden Patientenseren und einer Probe mit aufgereinigtem IgG durchgeführt. Die dominante Subklasse war IgG4 was mit dem wissenschaftlichen Forschungsstand kongruiert, dass IgG4 bei Caspr2-aAK der dominierende Subtyp ist. Im Langzeitversuch zur Untersuchung einer möglichen Internalisierung von Caspr2 durch die Inkubation in Caspr2-aAK positiven Seren wurden in vitro kultivierte DRGs adulter Mäuse für 24h, 48h, bzw. 96 h mit den Seren konfrontiert. Zusätzlich wurde überprüft wie sich ein Rescue der Zellen – nach 48 h wurde das Caspr2-aAK positive Serum gegen ein Caspr2-negatives Serum für weitere 48 h ausgetauscht – auf die Oberflächenexpression auswirkt. Zur Überprüfung der Dichte des an der Zellmembran exprimierten Caspr2 Proteins wurde diese abschließend quantifiziert und statistisch ausgewertet. Zusammenfassend ließ sich bei keinem der untersuchten Seren eine signifikante Veränderung der Caspr2 Oberflächenexpression erkennen. Mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass eine vorübergehende Erniedrigung/Erhöhung der Caspr2 Expression nach Inkubation mit aAK durch primäre DRG Neurone kompensiert wird und eine erhöhte Internalisierung nicht als ursächlich für den Pathomechanismus der Caspr2-aAK in Frage kommt. / Current research findings do not provide a clear picture about the pathological processes that are triggered by Caspr2-aAK. There are contrary observations about internalisation of Caspr2 expressed at the cellular membrane following aAK binding from patient serum or cerebrospinal fluid. Moreover, it has not been clarified to what extent the structure of the VGKC is altered upon aAK binding. The present study investigated the pathomechanisms of Caspr2-aAK by examining the surface expression of Caspr2 in DRGs in a long-term experiment. First, Caspr2-aAK from patient sera were proven for their in vitro binding to both transfected HEK293 and adult DRGs. In addition, membrane preparations of Caspr2 transfected HEK293 cells were used to verify Caspr2 binding by protein biochemical analysis. Furthermore, a subclass determination was performed on the 9 available patient sera and one sample of purified IgG. The dominant subclass was determined as IgG4, which is in line with current literature. During the long-term experiment to investigate a possible internalisation of Caspr2 following incubation with Caspr2-aAK positive sera, in vitro cultured DRGs of adult mice were exposed to the sera for 24 h, 48 h and 96 h, respectively. In addition, the effect of rescuing the cells from possible changes in Caspr2 expression - after 48 h, the Caspr2-aAK positive serum was replaced with Caspr2-negative control serum for another 48 h - was examined. To check the micron of Caspr2 expressed on the cellular membrane, Caspr2 was quantified and statistically evaluated. In summary, no significant changes in Caspr2 surface expression were detected in following incubation with any of the sera. These results demonstrate that a transient decrease/increase in Caspr2 expression after incubation with aAK is compensated by primary DRG neurons and increased internalisation cannot be considered as causative for the pathomechanism of Caspr2-aAK.

Fibromyalgia syndrome (FMS) is a pain disorder of unknown aetiology with a prevalence of up to 5% in the general population. About 80% of the affected persons are women. FMS is characterized by chronic widespread pain (CWP) and additional symptoms such as fatigue, depression and cognitive deficits, and positive tender points. In recent studies morphological and functional changes in peripheral nociceptors of FMS patients were described. In a cohort of patients with chronic widespread pain, lower gene expression and lower serum protein concentrations of the anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 were found in venous blood. Later, numerous other studies approached the question of cytokines, chemokines, and other inflammatory mediators in fibromyalgia, including IL-17A. A new hypothesis suggests that FMS patients, like patients with rheumatoid arthritis, develop autoantibodies that contribute to the pathophysiology of the disease. As in rheumatoid arthritis, it might be antibodies against citrullinated protein. We therefore used serum of a cohort of 184 FMS patients to test the hypothesis that FMS might be an autoimmune mediated disorder. We searched for autoantibodies with help of immunohistological binding assays using rat DRG sections. Additionally, we have examined our collected FMS sera for the presence of some known autoantibodies with Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Finally, we evaluated whether FMS subgroups with and without autoantibodies would differ in their demographic or clinical features. Upon analysis our cohort of FMS patients, we found autoantibodies to rat dorsal root ganglia (DRG) in 67/184 sera. The subgroups did not differ in demographic data, BMI, and accompanying diseases. Seropositive patients more often had lower pain intensities (0-4), than the DRG-seronegative patients, supporting the hypothesis that autoantibodies are rather protective than destructive. Moreover, the lower pain intensity among DRG-seropositive patients was related to the nuclear binding pattern at the level of large neurons. There were no further differences between seropositive and seronegative group regarding pain characteristics. Addressing the psychological status, the study shows higher STAI-T values in seronegative patients. There was no relation within the FMS cohort between the symptom severities, such as fatigue, waking unrefreshed, cognitive symptoms, and somatic symptom disabilities and presence of the autoantibodies. Thus, at present, we cannot propose FMS with autoantibodies is different from FMS without these. In terms of identification of a neuronal subtypes we could show a more prominent serum binding in IB4-negative neurons in the seropositive cohort, however without quantification measurements due to technical difficulties. Additionally, we would like to emphasize that there is a significant difference in ACPA- autoantibody prevalence and the presence of FMS. Additional studies and more research is needed to further investigate the autoimmune processes in FMS. These findings would contribute not only to the pathophysiology, but also to more accurate clinical investigations and potentially to improved treatment in these patients. / Das Fibromyalgiesyndrom ist eine Schmerzstörung von unbekannter Ätiologie mit einer Prävalenz von bis zu 5% in der Allgemeinbevölkerung. Rund um 80% der betroffenen Personen sind Frauen. FMS wird von chronischen Schmerzen in mehreren Körperregionen und zusätzlichen Symptomen wie Müdigkeit, Depressionen und kognitive Defizite, sowie Tenderpoints gekennzeichnet. In neulich durchgeführten Studien wurden sowohl morphologische als auch funktionelle Veränderungen an den peripheren Nozizeptoren in den FMS erkrankten Personen beschrieben. Eine Kohorte der Teilnehmer mit chronischen Schmerzen in mehreren Körperregionen zeigte eine niedrigere Genexpression und auch eine niedrigere Serumkonzentration der entzündungshemmenden Zytokine, wie zum Beispiel IL-4 und IL-10, im venösen Blut. Ebenso beschäftigten sich auch zahlreiche andere Studien mit dem Thema der Zytokine, Chemokine und Entzündungsmarker in Fibromyalgie, inklusive IL-17A. Eine neue Hypothese weist darauf hin, dass FMS-Patienten ähnlich wie Patienten mit der rheumatoiden Arthritis, Autoantikörper entwickeln, welche zum pathophysiologischen Mechanismus von der Krankheit beitragen. Wie in der rheumatoiden Arthritis könnten es die Antikörper gegen citrullinierte Proteine sein. Um die Hypothese, dass Fibromyalgie eine autoimmunbasierte Grunderkrankung ist, näher zu untersuchen, testeten wir eine Kohorte aus 184 Fibromyalgie-Patienten. Wir suchten nach Autoantikörpern mit Hilfe immunhistologischer Bindungsversuche auf dem Spinalganlienratengewebe. Zudem prüften wir mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), ob die Fibromyalgieseren bestimmte Autoantikörper aufweisen. Letztendlich verglichen wir die Fibromyalgiesubgruppen mit und ohne Autoantikörper basierend auf ihre demographischen und klinischen Eigenschaften. Nach der Auswertung unserer Kohorte von FMS-Patienten, konnten wir Autoantikörper im peripheren neuronalen Ratengewebe in 67/184 bestimmen. Die Subgruppen unterscheiden sich nicht in ihren demographischen Charakteristiken, BMI sowie in den begleitenden Erkrankungen. Die Spinalganglien-seropositiven Patienten präsentierten öfters niedrigere Schmerzintensitäten (0-4), als die spinalgangien-seronegativen, somit unterstützend die Hypothese, dass die Autoantikörper eher protektiv als destruktiv wirken. Ferner, die niedrige Schmerzintensität der spinalganglien-seropositiven Patienten stand im engen Zusammenhang mit dem Bindungsmuster der großen Neuronen. Weitere Untersuchungen zeigten keine erheblichen Unterschiede im Rahmen der Schmerzsybtypen zwischen der spinalganglien- seropositiven und spinalganglien-seronegativen Gruppe. Bezüglich psychologischer Merkmale, betont die Studie, dass STAI-T- Parameter höher unter den spinalganglien-seronegativen Teilnehmern vorzufinden waren. Dadurch dass wir keinen Zusammenhang in der Symptomatik wie zum Beispiel Müdigkeit, kognitives Denken, unerholsamer Schlaf sowie die somatische Symptomatik und der Anwesenheit der Antiköroper feststellen konnten, ist davon auszugehen, dass es sich bei dem autoimmungetriggerten FMS-Erkrankungsbild um die gleiche Krankheit handelt wie in dem nicht- autoimmungetriggerten. Bei der Bestimmung der neuronalen Subtypen gelingt es uns einen deutlichen Bindungsmuster der IB4-negativen Neuronen in der spinalganglien- seropositiven Kohorte nachtzuweisen. Eine Quantifizierung dieser war aufgrund technischer Schwierigkeiten nicht möglich. Ebenso möchten wir hervorheben, dass es einen Zusammenhang zwischen den ACPA- Autoantikörpernprävalenz und dem Auftreten der Fibrolmaylgieerkrankung gibt. Nichtsdestotrotz sind weitere Studien und mehr Forschungseinsatz notwendig, um vor allem weiter die autoimmunen Prozesse in FMS zu untersuchen. Dies würde nicht nur zur Pathophysiologie, sondern auch zu einer sorgfältigeren klinischen Diagnose und einer besseren Behandlungseffizienz beisteuern.

Neuromyelitis optica (NMO) ist eine schwerwiegende Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems, deren pathogene Ursache in Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen Aquaporin 4 (AQP4) steht. In einem intrathekalen Passiv-Transfermodell der Ratte wurden die Auswirkungen von NMO-Immunglobulin (IgG) aus Plasmapheresematerial und rekombinanten Antikörpern gegen AQP4 sowie der Effekt von additiver Applikation von humanem Komplement untersucht. NMO-IgG, rekombinante Antikörper und modifizierte Antikörper ohne Fähigkeit zur Aktivierung der Komplementkaskade waren bei repetitiver Applikation in der Lage, auch ohne additives humanes Komplement NMO-ähnliche progrediente motorische Symptome zu induzieren. Durch Ko-Injektion von humanem Komplement konnte keine signifikante Exazerbation der Pathologie bewirkt werden. MRT-Studien zeigten lokale Schrankenstörungen am Ort der höchsten Antikörperkonzentration. In histologischen Aufarbeitungen von Rückenmarksschnitten zeigten sich lokale Deposition an humanem IgG, ein dazu korrelierender Verlust an AQP4 sowie eine darüber hinausgehende Reduktion des Glutamattransporters EAAT2, während GFAP-reaktive Astrozyten tendenziell hypertroph und vermehrt waren. Auch bei additiver Applikation von humanem Komplement wiesen die Läsionsareale im Gegensatz zu histopathologischen Befunden bei NMO-Patienten und anderen Tiermodellen nur eine geringe Ablagerung von aktivem Komplement und wenig Infiltration durch ED1-positive Makrophagen auf. Da in einem Kontrollexperiment mit intrazerebraler intraparenchymaler Applikation von NMO-IgG die beschriebene additive Zytotoxizität von humanem Komplement reproduziert werden konnte, erscheint die Verwendbarkeit des intrathkalen Modells zur Evaluation der Wirkung von humanem Komplement bei Autoimmunerkrankungen mit intraspinalen Zielepitopen nicht geeignet. Die Ergebnisse lassen sich als Komplement-unabhängige intrinsische Wirkungen von Antikörpern gegen AQP4 deuten, die in einer Reduktion der Oberflächenexpresseion von AQP4 und EAAT2 resultieren und zu einer progredienten Myelopathie führen. Neben der bekannten Antikörper-induzierten Komplement-abhängigen Zytotoxizität könnten diese Effekte einen bislang nicht beschriebenen zusätzlichen Pathomechanismus bei der NMO darstellen. / Neuromyelitis optica (NMO) is a severe autoimmune disorder of the central nervous system that is causally linked to autoantibodies against aquaporin-4 (AQP4). In a intrathecal passive transfer rat model the effects of purified patient NMO-immunoglobuline (IgG) and recombinant anti-AQP4-antibodies were studied as well as those of additional application of human complement. Repetitive application of NMO-IgG, recombinant antibodies and modified antibodies without the ability of activation of the complement cascade caused NMO-like progressive symptoms. Additional application of human complement did not exacerbate the pathologic symptoms. MRI-studies revealed local spinal cord lesions at the site of the highest antibody concentration. Histopathological analysis of the spinal cord showed local deposition of human IgG, a corresponding loss of AQP4 and - even more pronounced - of the excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2), whereas immunoreactivity to the astrocytic marker glial fibrillary acid protein (GFAP) was increased. Even by additional application of human complement, only little deposition of activated complement und poor infiltration by ED1-positive macrophages was observed. However, direct intracerebral application of NMO-IgG revealed complement dependent cytotoxicity as described previously; therefore the intrathecal passive transfer model is not suited to evaluate the effects of human complement in autoimmune disorders with intraspinal targets. The results can be interpreted as intrinsic effects of anti-AQP4-antibodies that are independent of complement activation and that reduce expressivity of AQP4 und EAAT2 and cause a progressive myelopathy. Additionally to the previously described antibody and complement dependent cytotoxicity, these effects might be a new pathogenic pathway in neuromyelitis optica.

Hintergrund: Die der Pathogenese von Morbus Parkinson (PD, Parkinson’s disease) zugrunde liegenden Mechanismen sind bis heute nur unvollständig verstanden. Insbesondere ist unklar, durch welche ursächlichen Faktoren Parkinson ausgelöst wird. Bei der HIV-Infektion treten bei vielen Patienten neurologische Störungen auf (HIV-Associated Neurological Disorders, HAND), die in der klinischen Symptomatik und der Lokalisation der betroffenen Gehirnareale dem Morbus Parkinson ähneln. Möglicherweise könnte eine Fehlregulation der Immunantwort eine Rolle als Auslöser beider Erkrankungen spielen. In dieser Arbeit wurde die Autoimmunantwort von PD- und HAND-Patienten und gesunden Kontrollen gegen verschiedene Gehirnhomogenate untersucht, die während der Parkinsonerkrankung in unterschiedlichem Ausmaß geschädigt werden. Das Autoimmun-Signal wurde quantifiziert und prominente Autoantigene wurden identifiziert. Methoden: In dieser Arbeit wurde ein Western-Blot-basiertes Verfahren zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Gehirngewebe entwickelt. Dieses Verfahren wurde nach Optimierung mit Plasmaproben von gesunden Kontrollen, PD-Patienten und Patienten mit HIV-Infektion insbesondere an einer Gruppe von 40 Parkinson-Patienten (Durchschnittsalter 65 Jahre, 45 % weiblich) und 40 alters- und geschlechtsgemachten Kontrollen (Durchschnittsalter 62 Jahre, 50 % weiblich) angewendet und die humorale Autoimmunität gegen verschiedene Gehirnareale untersucht. Dazu wurden die verschiedenen Areale (dorsaler Motornucleus des Glossopharynx- und Vagusnervs (dm), Substantia nigra (SN), anteromedialer temporaler Mesocortex (MC), high order sensorische Assoziations- und präfrontale Felder (HC), first oder sensorische Assoziations- und prämotorische Felder, primäre sensorische und motorische Felder (FC)) von post-mortem Gehirnen homogenisiert, auf SDS-Gradienten-Gelen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Die Membranen wurden mit den Plasmen inkubiert und gebundene Autoantikörper immunologisch detektiert. Die Signale wurden qualitativ und quantitativ ausgewertet. Mit Hilfe einer zweidimensionalen Elektrophorese und anschließender Immunfärbung wurden prominente Autoantigene durch Massenspektroskopie identifiziert. Ergebnisse: Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Assay lässt sich die humorale Autoimmunantwort gegen Gehirngewebe semiquantitativ bestimmen. In allen untersuchten Proben konnten verschiedene Autoantikörper gegen unterschiedliche Antigene nachgewiesen werden. Der Gesamt-IgG-Gehalt der Plasmen unterscheidet sich weder zwischen PD-Patienten und gesunden Kontrollen, noch zwischen Männern und Frauen signifikant. Weibliche PD-Patienten zeigen signifikant stärkere Signale gegen dm als männliche (p = 0.02, Mann-Whitney-U-Test), der wiederum in jedem Patienten - unabhängig vom Geschlecht - von den untersuchten Hirnarealen signifikant stärker autoimmunologisch erkannt wird, als die übrigen Hirnareale (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). In jedem Hirnareal wurden drei Banden besonders häufig erkannt (45, 40 und 37 kDa), jede davon am stärksten im dm (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). Die Einzelanalysen der Signalintensitäten zeigt, dass PD-Patienten signifikant weniger Autoreaktivität gegen die 45 kDa-Bande in der SN (p = 0.056), im MC (p = 0.0277) und im FC (p = 0.0188) zeigen, als Kontrollen. Weitere Analysen zeigen, dass männliche PD-Patienten hochsignifikant weniger das 45 kDa-Protein im SN (p < 0.0001), MC (p = 0.0042) und FC (p = 0.0088) erkennen als Kontrollen, wohingegen bei den weiblichen Kontroll- und PD-Plasmen kein Unterschied festzustellen war. Ein weiteres Protein bei 160 kDa wird signifikant unterschiedlich stark in allen Gehirnarealen erkannt (p < 0.0001, Friedman-ANOVA), wobei die stärkste Immunreaktivität gegen FC besteht. Basierend auf dem Nachweis der 45 kDa-Bande aus der SN ergibt sich eine Odds Ratio für das Merkmal Parkinson von 3.38 (CI 1.11 – 10.30). Bei Männern ist diese Odds Ratio sogar 53.12 (CI 2.79 - 1012), bei Frauen 0.44 (CI 0.09 – 2.09). Die Sensitivität dieses Tests liegt bei Männern bei 1 (CI 0.84 – 1), die Spezifität bei 4.41 (0.31 – 0.78). Die negativ prädiktiven Werte liegen in allen Gruppen über 99.15 %. Die Identifizierung der Proteine mittels Massenspektroskopie ergab, dass es sich bei den 37 – 45 kDa Banden um Isoformen oder posttranslational modifizierte Formen des GFAP (glial fibrillary acidic protein), einem Bestandteil von Neurofilamenten v.a. in Astrozyten handelt. Außerdem wurde Fructose-Bisphosphate Aldolase A und Aspartat-Aminotransferase (mitochondriale Isoform 1 Vorläufer), beides Proteine des Kohlenhydrat-Stoffwechsels und der Glykolyse, als weitere Proteine mit ebenfalls 45 kDa identifiziert. Bei dem identifizierten Protein mit dem Molekulargewicht von 160 kDa handelt es sich wahrscheinlich um Dihydropyrimidinase-related protein 2, wie GFAP ebenfalls bei der Bildung des Zytoskeletts beteiligt. Diskussion: Autoantikörper gegen Gehirnantigene sind ein physiologisches Phänomen, das unabhängig von dem Vorliegen einer neurologischen Erkrankung besteht. Gehirnareale, die bei Parkinson besonders stark geschädigt werden, werden von dieser humoralen Autoimmunantwort besonders stark erkannt. Eine vorübergehende Permeabilisierung der Blut-Hirn-Schranke durch Infektion oder Trauma könnte den Zutritt der Autoantikörper zum Gehirn erlauben und so autoreaktive Prozesse in Gang setzen und zum Untergang dopaminerger Neuronen führen. Bei den identifizierten Proteinen handelt es sich um grundlegende Bestandteile eukaryotischer Zellen, was die Hypothese eines Art Beseitigungsmechanismus der Autoantikörper und damit die Aufgabe der Aufrechterhaltung der Homöostase darstellen könnte. Bei männlichen PD Patienten wird die 45 kDa Bande signifikant weniger stark von Auto-IgGs erkannt; dieser Mechanismus könnte somit in den männlichen PD-Patienten vermindert sein. Als Folge wäre die Ablagerung von Zelltrümmern im Gehirn vorstellbar, die dann auch langfristig eine Angriffsfläche für Autoimmunprozesse mit dem Verlust dopaminerger Neuronen bieten könnte. / Background: The pathogenic mechanisms of Parkinson’s disease (PD) are not yet fully understood. Particularly the basic cause of the disease remains unclear. In HIV-Infection many patients show neurologic impairments (HIV-associated neurological disorders, HAND), which are similar in clinic symptoms and localization of the affected brain areas to these observed in Parkinson’s disease. Possibly a dysregulation of immunologic responses might play a role as a cause for PD. In this work autoimmune processes in PD- and HAND-patients as well as in healthy controls against different brain homogenates were measured, which are damaged in variable extent during pathogenesis of PD. The autoimmune-signal was quantified and prominent autoantigens were identified. Methods: In this work we established a Western-Blot-based method to detect autoantibodies against brain homogenates. After the optimization with plasma of healthy controls, PD-patients and HIV-infected patients, the technique was used to measure the humoral autoimmunity against different brain areas in a group of 40 PD-patients (mean age 65, 45 % females), and 40 age- and sex-matched controls (mean age 62 years, 50 % female). Different brain areas (of the dorsal motor nucleus of the glossopharyngeal and vagal nerves (dm), substantia nigra (SN), anteromedial temporal mesocortex (MC), high order sensory association areas and prefrontal fields (HC), first order sensory association areas, premotor areas, as well as primary sensory and motor fields (FC)) of post-mortem brains were homogenized, separated by gel electrophoresis and blotted on a nitrocellulose membrane. The membranes were incubated with plasma and bound antibodies were detected immunologically. The signals were analyzed by quality and quantity. With a two-dimensional electrophoresis and following immune staining prominent autoantigens were identified by mass spectroscopy. Results: With the established assay, the humoral autoimmunity against brain tissue can be analyzed semi-quantitatively. In all investigated samples several autoantibodies against different antigens could be proven. The overall IgG-content did not differ significantly between PD-patients and healthy controls, nor between men and women. Female PD-patients show significant stronger signals against dm than male (p = 0.02, Mann-Whitney-U-test), which was recognized significantly stronger than the other brain areas in each patient, independently from sex (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). In each brain area 3 bands were recognized stronger than others (45, 40 and 37 kDa), each of them the strongest in dm (p < 0.0001, Friedman-ANOVA). The single analysis of the signal intensities show that PD-patients display significantly less autoreactivity against the 45 kDa-band in SN (p = 0.056), MC (p = 0.0277) and FC (p = 0.0188) than controls. Further analyses show that plasma of male PD-patients detect highly significantly less the 45 kDa-protein in SN (p < 0.0001), MC (p = 0.0042) and FC (p = 0.0088) than controls, whereas there was no difference measurable in female control- and PD-plasma. Another protein at 160 kDa is recognized at significantly different intensities in all brain areas (p < 0.0001, Friedman-ANOVA), whereas the strongest immunoreactivity is shown against FC. Based on the detection of the 45 kDa-band from the SN the odds ratio for the feature PD is 3.38 (CI 1.11 – 10.30). In men the odds ratio is even 53.12 (CI 2.79 - 1012), in female 0.44 (CI 0.09 – 2.09). The sensitivity for the test in the group of men displays 1 (CI 0.84 – 1), the specificity is 4.41 (0.31 – 0.78). The negative predictive values exceed 99.15 % in all investigated groups. The identification of the proteins by mass spectroscopy showed that the 37 – 45 kDa-bands might be isoforms of posttranslational modified forms of GFAP (glial fibrillary acidic protein), a part of neurofilaments in astrocytes. Furthermore, fructose-bisphosphate aldolase A and aspartate aminotransferase (mitochondrial isoform 1 precursor), both in the metabolism of carbon hydrates and glycolysis, have been identified for further 45 kDa-bands. The identified protein with a molecular weight of 160 kDa is probably dihydropyrimidinase-related protein 2, like GFAP involved in the formation of the cytoskeleton. Conclusion: The presence of anti-brain-autoantibodies are a physiological occurrence in human plasma, independent of the presence of neurological disease. Brain areas that are damaged prominently during the pathogenesis of PD are recognized stronger by humoral autoimmunity. A temporal permeabilization of the blood brain barrier through infection or trauma might allow autoantibodies access to the brain and initiate autoreactive processes that lead to the demise of dopaminergic neurons. The identified proteins are basic members of eukaryotic cells. This could suggest the hypothesis of sort of a cleaning mechanism of the antibodies, which might have the function of sustaining homeostasis. Male PD patients showed significantly decreased levels of autoreactive antibodies against the 45 kDa band in SN, MC and FC, which could enhance the accumulation of protein debris due to a missing removal mechanism and in long-distance might be responsible for neurodegenerative processes.

The Stiff-person syndrome (SPS) is a rare autoimmune disease that is characterized by symptoms including stiffness in axial and limb muscles as well as painful spasms. Different variants of SPS are known ranging from moderate forms like the stiff-limb syndrome to the most severe form progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus (PERM). SPS is elicited by autoantibodies that target different pre- or postsynaptic proteins. The focus of the present work is on autoantibodies against the glycine receptor (GlyR). At start of the present thesis, as main characteristic of the GlyR autoantibody pathology, receptor cross-linking followed by enhanced receptor internalization and degradation via the lysosomal pathway was described. If binding of autoantibodies modulates GlyR function and therefore contributes to the GlyR autoantibody pathology has not yet been investigated. Moreover, not all patients respond well to plasmapheresis or other treatments used in the clinic. Relapses with even higher autoantibody titers regularly occur. In the present work, further insights into the disease pathology of GlyRα autoantibodies were achieved. We identified a common GlyRα1 autoantibody epitope located in the far N-terminus including amino acids A1-G34 which at least represent a part of the autoantibody epitope. This part of the receptor is easily accessible for autoantibodies due to its location at the outermost surface of the GlyRα1 extracellular domain. It was further investigated if the glycosylation status of the GlyR interferes with autoantibody binding. Using a GlyRα1 de-glycosylation mutant exhibited that patient autoantibodies are able to detect the de-glycosylated GlyRα1 variant as well. The direct modulation of the GlyR analyzed by electrophysiological recordings demonstrated functional alterations of the GlyR upon autoantibody binding. Whole cell patch clamp recordings revealed that autoantibodies decreased the glycine potency, shown by increased EC50 values. Furthermore, an influence on the desensitization behavior of the receptor was shown. The GlyR autoantibodies, however, had no impact on the binding affinity of glycine. These issues can be explained by the localization of the GlyR autoantibody epitope. The determined epitope has been exhibited to influence GlyR desensitization upon binding of allosteric modulators and differs from the orthosteric binding site for glycine, which is localized much deeper in the structure at the interface between two adjacent subunits. To neutralize GlyR autoantibodies, two different methods have been carried out. Transfected HEK293 cells expressing GlyRα1 and ELISA plates coated with the GlyRα1 extracellular domain were used to efficiently neutralize the autoantibodies. Finally, the successful passive transfer of GlyRα1 autoantibodies into zebrafish larvae and mice was shown. The autoantibodies detected their target in spinal cord and brain regions rich in GlyRs of zebrafish and mice. A passive transfer of human GlyRα autoantibodies to zebrafish larvae generated an impaired escape behavior in the animals compatible with the abnormal startle response in SPS or PERM patients. / Das Stiff-person Syndrom (SPS) ist eine seltene Autoimmunerkrankung, die sich durch Symptome wie Steifheit in Muskeln des Rumpfes und der Gliedmaßen sowie schmerzhafte Spasmen auszeichnet. Vom SPS sind verschiedene Varianten bekannt, die von mäßigen Formen, wie dem Stiff-limb Syndrom (limb von engl. Extremitäten), bis zur schwersten Variante, der progressiven Enzephalomyelitis mit Steifheit und Myoklonus (PERM, vom engl. progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus), reichen. Ausgelöst wird das SPS durch Autoantikörper, die an verschiedene prä- und postsynaptische Proteine binden. Der Fokus in dieser Arbeit liegt dabei auf Autoantikörpern, die gegen den Glyzinrezeptor (GlyR) gerichtet sind. Zu Beginn dieser Thesis galten als Hauptcharakteristika der Pathologie von Autoantikörpern die Quervernetzung von Rezeptoren gefolgt von einer verstärkten Rezeptor Internalisierung und dem Abbau über das Lysosom. Allerdings wurde bisher noch nicht untersucht, ob die GlyR Funktion durch eine Autoantikörperbindung verändert wird. Darüber hinaus sprechen nicht alle Patienten gut auf Plasmapheresen oder andere Therapien an. Rückfälle mit noch viel höheren Autoantikörpertitern treten regelmäßig auf. Die vorliegende Arbeit erweitert die Kenntnisse der pathophysiologischen Mechanismen, die durch GlyRα Autoantikörper ausgelöst werden. Wir konnten ein Epitop der GlyRα1 Autoantikörper im N-terminalen Bereich ausfindig machen, wobei die Aminosäuren A1-G34 zumindest einen Teil des Epitops bilden. Dieser GlyR Bereich kann durch die Autoantikörper sehr leicht erreicht werden, weil er sich an der Oberfläche der extrazellulären Domäne des GlyRs befindet. Weiterhin wurde untersucht, ob die Glykosylierung des GlyRs die Autoantikörperbindung beeinflusst. Mit Hilfe von Mutanten, bei denen die Glykosylierungsstelle entfernt wurde, konnte gezeigt werden, dass Patientenautoantikörper die nicht-glykosylierte Variante des GlyRα1 ebenfalls detektieren können. Elektrophysiologische Messungen ergaben, dass die Funktionalität des GlyRs durch die Bindung von Autoantikörpern beeinträchtigt wird. Erhöhte EC50 Werte zeigen, dass Autoantikörper die Wirksamkeit von Glyzin in niedrigeren Konzentrationen auf den Rezeptor verringern. Außerdem beeinflussen die Autoantikörper die Desensitisierung des Rezeptors. Allerdings waren die Glyzin-Wirksamkeit in sättigenden Konzentrationen und die Affinität von Glyzin zum Rezeptor unverändert. Diese Ergebnisse können durch die Lokalisierung des GlyR Autoantikörper-Epitops erklärt werden. Das ermittelte Epitop ist bekannt dafür, dass dort allosterische Modulatoren binden können und dadurch die Desensitisierung beeinflusst wird. Außerdem unterscheidet sich das Epitop von der orthosterischen Bindestelle von Glyzin, welche viel tiefer in der Struktur an der Grenze zweier benachbarter Untereinheiten liegt. Um die GlyR Autoantikörper zu neutralisieren, wurden zwei verschiedene Methoden entwickelt. Transfizierte HEK293 Zellen, die den GlyRα1 exprimieren, und ELISA Platten, die mit der extrazellulären Domäne des GlyRα1 beschichtet waren, wurden zur effizienten Neutralisation der Autoantikörper verwendet. Abschließend konnte in der vorliegenden Arbeit die erfolgreiche passive Übertragung von GlyRα1 Autoantikörpern in Zebrafischlarven und Mäusen gezeigt werden. In Zebrafischen und Mäusen detektierten die Autoantikörper ihr Antigen im Rückenmark und in Gehirnregionen, in denen der GlyR zahlreich exprimiert ist. Ein passiver Transfer von menschlichen GlyRα Autoantikörpern in Zebrafischlarven beeinträchtigte das Fluchtverhalten der Tiere, welches kompatibel mit dem krankhaften Startle Reflex in SPS- oder PERM-Patienten ist.

Glycine receptors (GlyRs) are essential for fast inhibitory neurotransmission in the mammalian central nervous system. GlyRs form pentameric ligand-gated chloride channels and consist either of α subunits as homomers located at presynapses and extrasynaptic sites or of α and β subunits as heteromers located at the postsynapse via binding of the GlyR β subunit to the scaffold protein gephyrin. Failure in glycinergic inhibition leads to moto-neurological diseases. While mutations in genes (GLRA1, GLRB) encoding GlyR subunits are associated with hyperekplexia (startle disease), autoantibodies (aAbs) targeting GlyRs elicit the autoimmune diseases Stiff Person Syndrome (SPS) and progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus (PERM). In these diseases, symptoms are variable including excessive startle and stiffness in limb muscles. Hyperekplexia mutations directly interfere with ion channel functions or prevent correct receptor folding and trafficking to the membrane. In SPS, binding of GlyR aAbs leads to internalisation of receptors or directly impairs receptor function. The diseases can be treated symptomatically, but not all patients respond well to treatment options. This thesis provides further insights in hyperekplexia and SPS pathology. The involvement of the GlyR β subunit in hyperekplexia was investigated by characterisation of three novel missense mutations in GLRB: Y252S, S321F and A455P. We identified loss- or gain-of-function in combination with reduced synaptic localisation of mutated GlyRs eliciting the phenotype in patients. Furthermore, the role of unaffected GlyR β in the presence of GLRA1 mutations in mouse models for hyperekplexia carrying a missense mutation (shaky) or completely lacking GlyR α1 (oscillator) was investigated. While synaptic targeting of GlyR β was unaltered, different compensatory mechanisms were found in the mutant mice. In shaky animals, functionally impaired GlyR α1 gets transported to membranes together with GlyR β. In oscillator mice, overexpression of GlyR α2 was found to possibly compensate for the missing GlyR α1. However, compensation remains functionally insufficient in both mouse mutants. In SPS/PERM, novel targeted sites of GlyR aAbs were identified. Screening of 58 patient sera revealed autoimmune reactivity against the GlyR β subunit. Binding and specificity of aAbs to GlyR β was verified with recombinant cells, peptide microarrays, primary spinal cord neurons and tissue. Functional consequences of GlyR β aAbs differ from those of GlyR α1 aAbs. In contrast to reduced glycine potency upon binding of aAbs to GlyR α1, GlyR β aAbs decrease receptor efficacy for glycine. In addition, GlyR aAbs were shown to bind presynaptic homomeric GlyR α. We established a novel protocol to specifically culture interneurons from murine spinal cords and analysed binding of GlyR aAbs to pre- and postsynaptic sites with super-resolution microscopy. Binding to presynapses could thereby demonstrate novel insights on disease pathology mechanisms. Specification of individual targeting profiles of aAbs in SPS/PERM patients will help to further understand phenotypic differences and to develop new and more personalized treatment approaches. / Glyzin Rezeptoren (GlyR) sind essentiell für schnelle inhibitorische Neurotransmission im zentralen Nervensystem von Säugetieren. GlyR formen pentamere, Liganden-gesteuerte Chlorid Kanäle und bestehen entweder aus α Untereinheiten als Homomere lokalisiert an der Präsynapse oder extrasynaptischen Seiten oder aus α und β Untereinheiten als Heteromere lokalisiert an der Postsynapse durch Bindung von der GlyR β Untereinheit an das Gerüst-Protein Gephyrin. Versagen von glyzinerger Inhibition führt zu moto-neurologischen Krankheiten. Während Mutationen in Genen (GLRA1, GLRB) welche GlyR Untereinheiten codieren in Verbindung mit Hyperekplexie (engl. startle disease) gebracht werden, führen Autoantikörper (aAb, vom engl. autoantibody) gegen den GlyR zu den autoimmun Krankheiten Stiff Person Syndrome (SPS) und progressive Enzephalomyelitis mit Steifheit und Myoklonus (PERM, vom engl. progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus). Symptome dieser Krankheiten sind variabel und beinhalten übermassiges Erschrecken und Steifheit in Muskeln der Gliedmaßen. Hyperekplexie Mutationen beeinträchtigen direkt die Ionenkanal Funktion oder verhindern die korrekte Rezeptorfaltung und den Transport zur Membran. Bindung von GlyR aAb in SPS führen zur Internalisierung der Rezeptoren oder beschädigen direkt die Rezeptorfunktion. Die Krankheiten sind symptomatisch behandelbar aber nicht alle Patienten reagieren gut auf die Behandlungsoptionen. Diese Arbeit liefert weitere Kenntnisse in der Pathologie von Hyperekplexie und SPS. Die Beteiligung der GlyR β Untereinheit in Hyperekplexie wurde untersucht indem drei neue GLRB missense-Mutationen, Y252S, S321F und A455P, charakterisiert wurden. Wir identifizierten Funktionsverlust oder -gewinn in Kombination mit reduzierter synaptischer Lokalisation von mutierten GlyR als Auslösung der Phänotypen in Patienten. Darüber hinaus untersuchten wir die Rolle von unbeeinträchtigtem GlyR β in Gegenwart von GLRA1 Mutationen in Mausmodellen für Hyperekplexie welche eine missense-Mutation (shaky) tragen oder in welchen GlyR α1 komplett fehlt (oscillator). Während die synaptische Binding von GlyR β unverändert war, fanden wir verschiedene Kompensationsmechanismen in den mutierten Mäusen. In shaky Tieren werden funktionell gestörte GlyR α1 zusammen mit GlyR β zur Membran transportiert. In oscillator Mäusen wurde eine Überexpression von GlyR α2 festgestellt welche möglicherweise das fehlende GlyR α1 kompensiert. Allerdings verbleibt die Kompensation in beiden Mäuse-Mutanten funktionell unzureichend. In SPS/PERM identifizierten wir neue Bindungsziele von GlyR aAb. Screening von 58 Patientenseren enthüllte eine autoimmune Reaktivität gegen GlyR β. Bindung und Spezifizität von aAb gegen GlyR β wurde mit rekombinanten Zellen, Peptid Mikro-arrays, primären Rückenmarksneuronen und -gewebe überprüft. Funktionelle Konsequenzen von GlyR β aAb unterschieden sich von GlyR α1 aAb. Im Kontrast zu reduzierter Wirksamkeit von Glyzin nach Bindung von aAb an GlyR α1, verringern GlyR β aAb die Effizienz von Glyzin. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass GlyR aAb an präsynaptische, homomere GlyR α binden. Wir etablierten ein neues Protokoll, um spezifische Interneuronen-Kulturen von murinen Rückenmärkern zu kultivieren und analysierten die Bindung von GlyR aAb an prä- und postsynaptische Seiten mit hochauflösender Mikroskopie. Bindung an Präsynapsen kann dabei neue Einblicke über die Mechanismen der Krankheitspathologie aufzeigen. Spezifizierung von individuellen Bindungsprofilen von aAb in SPS/PERM Patienten wird dabei helfen die phänotypischen Unterschiede mehr zu verstehen und neue, personalisierte Behandlungsansätze zu entwickeln.

In dieser Studie wurden zwei Immunoassays zur Bestimmung von TG- und TPO-Antikörpern hinsichtlich diagnostischer Trennschärfe sowie klinischer Relevanz in der Diagnostik der chronischen lymphozytären Thyreoiditis-Hashimoto (CLT) untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden zwei Patientengruppen erfasst: ein Kollektiv mit der Diagnose CLT (n=203) und das sogenannte Normalkollektiv, das 205 Probanden umfasste. Die diagnostischen Kriterien zur Diagnosestellung CLT ergaben sich aus dem Zusammenspiel von klinischem Befund, Ultraschalluntersuchung und Antikörpertiter. Verglichen wurden der an der Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin der Universität Würzburg für die Routinediagnostik eingesetzte manuelle VarELISA TG und TPO Antibodies Assay, PHARMACIA Diagnostics mit dem automatisierten BRAHMS anti-TGn bzw. anti-TPOn KRYPTOR Assay. Die Bestimmung der Ergebnisse bei TPO-AK zeigte, dass die von KRYPTOR gemessenen Werte im Mittel um 2670,51 U/ml höher lagen als bei VarELISA. Bei TG-AK wurden die Konzentrationen auf der Plattform KRYPTOR allerdings um 325,07 U/ml niedriger gemessen als bei VarELISA; es zeigte sich bei TG-AK somit ein umgekehrtes Verhältnis. Des Weiteren wurde eine relativ gute Übereinstimmung zwischen beiden Assays (Kappa-Koeffizient nach Cohen = 0,63) bei der Bestimmung der TPO-Antikörper festgestellt; 86,8% der Seren wurden als konkordant bewertet. Demgegenüber stehen 65,4% in ihrem subjektiven Urteil übereinstimmende Ergebnisse bei der TG-Antikörper Bestimmung, was für eine schwache Übereinstimmung der TG-AK-Werte spricht (Kappa-Koeffizient nach Cohen = 0,31). Zudem ist die diagnostische Trennschärfe bei TPO-AK höher (Area under Curve = 0,929) als bei TG-AK (Area under Curve = 0,805); somit unterscheidet KRYPTOR bei der Bestimmung der TPO-AK besser zwischen „gesunden“ und „erkrankten“ Patienten als VarELISA. Bei der Messung der TPO-AK auf der Plattform KRYPTOR zeigte sich bei dem dem Cut-Off (vom Hersteller auf 60 U/ml festgelegt) am nächsten liegenden Wert (59,9 U/ml) sowohl eine hohe Sensitivität (81,4%) als auch Spezifität (97,6%). Bei der TG-AK Messung lag bei dem Cut-Off Wert von 59,8 U/ml bei hoher Spezifität (99,5%) die Sensitivität sehr niedrig (43,6%), d.h. viele Patienten wurden als falsch negativ eingestuft. Aus der Auswertung geht ein optimaler Schwellenwert von 67,2 U/ml für TPO-AK und 40,7 U/ml für TG-AK hervor, wobei der vom Hersteller angegebene Cut-Off Wert für beide AK 60 U/ml beträgt. Mittels neu ermitteltem Cut-Off Wert (67,2 U/ml) konnte bei TPO-AK eine Steigerung der Spezifität auf 99,5% bei unveränderter Sensitivität erreicht werden. Dementsprechend erbrachte der Cut-Off Wert von 40,7 U/ml eine Steigerung der Sensitivät auf 50% bei gleich bleibender Spezifität bei TG-AK. Die Bestimmung des Antikörperprofils in den beiden Testsystemen zeigte somit, insbesondere bei TG-AK, häufig diskrepante Ergebnisse. Dies belegt erneut die bekannte Problematik bei der Labordiagnostik der CLT. Ursächlich sind Affinitätsunterschiede und unterschiedliche Kalibrierungen der verwendeten Tests sowie das Fehlen einer Standardisierung zu diskutieren. Darüber hinaus bestätigen die Ergebnisse die Notwendigkeit einer Definition eines institutionellen Cut-Offs. / A comparison of two different immunoassays in the clinical investigation of autoimmune thyroid disease was carried out. The manual Immunoassay VarELISA was compared to the fully automated KRYPTOR system regarding clinical relevance and diagnostic accuracy. On both assays thyroid peroxidase antibodiese (TPO-Ab) and thyroglobulin antibodies (Tg-Ab) were measured. The study was held on two groups: a normal population (n=205) and a group of patients (n=205) who had been diagnosed Hashimoto's thyroiditis. We found out "optimal" cut-offs (despite the manufacturer's data of 60 U/ml) for both antibodies regarding better sensitivity and specificity: these were 67,2 U/ml for TPO-ab and 40,7 U/ml for TG-Ab. Overall there was a benefit in the assessment of TPO-Ab on the fully automated Immunoassay KRYPTOR whereas we often found discrepant results in the measurement of TG-Ab.

Die Neuromyelitis Optica (NMO) ist eine schwerwiegende autoimmune Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die mit rezidivierenden Optikusneuritiden und Querschnittsmyelitiden einhergeht. Als serologischer Biomarker wurden Autoantikörper gegen Aquaporin 4 (anti-AQP4-AK) identifiziert. Mit Hilfe eines passiv-Transfer Rattenmodelles mit implantierten intrathekalen Kathetern wurden aufgereinigte IgG Fraktionen (NMO-IgG) von Plasmapheresematerial anti-AQP4-AK positiver NMO Patienten verabreicht. Zum Nachweis der Antigen-Spezifität wurden in weiteren Versuchsgruppen rekombinante IgG-AK gegen AQP4 appliziert. Die repetitive Injektion von NMO-IgG oder anti-AQP4-AK führte zu einer signifikanten klinischen Verschlechterung und einer reduzierten motorischen Leistungsfähigkeit der Versuchstiere im Vergleich zu Kontrollen. Mittels Magnetresonanztomographie konnten exemplarisch Kontrastmittel-aufnehmende Läsionsareale im Rückenmark der Versuchstiere im Bereich der Katheterspitze detektiert werden. Histopathologisch zeigte sich in diesen Läsionsbereichen eine Anreicherung von intrathekal applizierten humanen IgG, ein Verlust der Expression von AQP4 und des Glutamattransporters EAAT2. Im Gegensatz zu der bisher bekannten, Komplement-induzierten Gewebedestruktion bei NMO-Patienten mit entzündlichen Läsionen wurde hier keine Depletion von Astrozyten oder Komplementaktivierung beobachtet. Stattdessen kam es in den hier beschriebenen Arealen mit IgG-Ablagerung zu einer Hypertrophie und Vermehrung der GFAP-positiven Astrozyten. Die Ergebnisse lassen auf eine pathophysiologisch relevante, intrinsische und komplement-unabhängige Wirkung von anti-AQP4-AK schließen. / Neuromyelitis optica (NMO) is a severe autoimmune disease of the central nervous system (CNS). As a biomarker autoantibodies against AQP4 (anti-AQP4-Abs) have been identified. Via passiv-transfer animal model with intrathecally implanted catheters, purified IgG fractions (NMO-IgG) from anti-AQP4-Abs positive patients have been applicated. Repetitive injection of NMO-IgG led to a significant clinical disease induction along with reduced motor function. Via MRI-scan lesions in the spinal cord could be identified. Histopathological analysis revealed a loss of AQP4 and glutamat transporter EAAT2. Complement induced tissue inflammation hasn't been observed. These results reveal a pathophysiological relevant, intrinsic and complement independent effect of anti-AQP4-Abs.