Genomweite Assoziationsstudien haben CLEC16A als ein Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes und weitere Autoimmunerkrankungen identifiziert. Die genaue Funktion von CLEC16A bleibt jedoch ungeklärt. Studien zeigten, dass sowohl das Drosophila Ortholog ema als auch das murine Clec16a eine Rolle in Autophagie spielen. Autophagie trägt zur Beladung der MHC-Klasse-II Moleküle und somit der Antigenpräsentation bei. Darüber hinaus konnten Studien belegen, dass Autophagie zur Antigenpräsentation während der T-Zell Selektion in Thymus-Epithelzellen benötigt wird. Dies schlägt eine mögliche Funktion von CLEC16A in Thymus-Epithelzellen während der T-Zell Selektion vor. Außerdem berichteten Arbeiten, dass CLEC16A als quantitativer Trait Locus für seine Nachbargene fungiert und dass Clec16a KD in Langerhans Inseln im Pankreas die Insulinsekretion und den Glukosestoffwechsel beeinträchtigt. Dieser Arbeit vorausgehend hatten Schuster et al. eine Clec16a KD NOD Maus generiert, welche vor spontanem autoimmunem Diabetes geschützt war. Für diese Arbeit wurde vermutet, dass CLEC16A als Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes den Prozess der Autophagie in Thymus-Epithelzellen beeinträchtigt und somit Antigenpräsentation und das T-Zell Repertoire beeinflusst. Um auf der Vorarbeit von Schuster et al. aufzubauen und diese zu ergänzen, zielte diese Arbeit darauf ab, den Einfluss von CLEC16A auf Thymus-Epithelzellen zu untersuchen. Hierfür wurde ein CLEC16A KD in menschlichen Zellen mittels RNA Interferenz erzeugt und Autophagie durch Immunoblotting untersucht. Zusätzlich wurde die Entzündung im Pankreasgewebe von Clec16a KD NOD Mäusen mittels H.E. Färbung beurteilt und bewertet. Thymus-Transplanationen wurden durchgeführt, um zu sehen, ob der Einfluss von Clec16a KD T-Zell intrinsisch ist. Außerdem wurden intraperitoneale Glukosetoleranztests durchgeführt, um den Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD Mäusen zu beurteilen. Schließlich wurden mittels qPCR Expressionslevel der benachbarten Gene, wie zum Beispiel Dexi und Socs1, erhoben, um die Eigenschaften von CLEC16A als quantitativer Trait Locus einzuordnen. Gemeinsam mit den Ergebnissen von Schuster et al. kann diese Arbeit aufzeigen, dass Clec16a KD die Ausprägung von Insulitis im Pankreas reduziert und Clec16a KD NOD Mäuse vor spontanem Autoimmundiabetes schützt. Dieser Schutz vor Erkrankung wird durch beeinträchtigte Autophagie in Thymus-Epithelzellen hervorgerufen, welche die T-Zell Selektion beeinflusst und die Reaktivität von T-Zellen reduziert. Der Einfluss des Clec16a KD ist innerhalb des Thymus wirksam. Der Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD NOD Mäusen bleibt unverändert und kann deshalb als Ursache für den Schutz vor Type 1 Diabetes ausgeschlossen werden. Clec16a und Dexi zeigen ähnliche Expressionslevel auf, dennoch benötigt es weitere detaillierte Studien, um eine Beziehung zwischen den beiden Genen etablieren zu können. Letztlich konnte die Beeinträchtigung von Autophagie in menschlichen CLEC16A KD Zellen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass die Funktion von CLEC16A evolutionär konserviert ist und ein möglicher Zusammenhang zwischen CLEC16A Polymorphismen und einem erhöhten Risiko für Typ 1 Diabetes im Menschen besteht. / Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes. For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus. In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human.

Die Juvenile Idiopathische Arthritis ist eine der häufigsten Ursachen von Gelenkbeschwerden im Kindesalter. Die Pathogenese der Erkrankung ist bisher wenig verstanden. Da sich jedoch bei einigen Subtypen der JIA Antinukleäre Antikörper (ANA) nachweisen lassen, liegt eine Beteiligung von B-Lymphozyten nahe. Mittels einer Kombination aus phänotypischer Zuordnung bestimmter B-Zell Differenzierungsstadien sowie Einzelzellsortierung, Amplifikation und Sequenzierung des rearrangierten Immunglobulingens individueller B-Zellen wurde der Frage nach klonaler Verwandschaft unterschiedlich differenzierter B-Zell Stadien und Selektion innerhalb des Gelenkes nachgegangen. / Juvenile idiopathic arthritis is one of the most common reasons for joint problems in childhood. Still the pathogenesis is rarely understood. Since antinuclear antibodies can be found in some subtypes of JIA, an involvement of b-cells can be suggested. By combining phenotypical assignment of specific b-cell subsets and single cell sorting, amplification and sequencing of the rearranged immunoglobulin-gene of individual b-cells, indication for clonal relationship of different b-cell subsets and selection in the joints was examined.

Die vorliegenden Ergebnisse belegen eine essentielle Rolle der Beseitigung von intrazellulären DNA-Metaboliten aus der DNA-Reparatur für die Aufrechterhaltung von Immuntoleranz. So führt eine unangemessene Akkumulation körpereigener DNA im Zytosol, über die Erkennung durch Nukleinsäuresensoren, zu einer Aktivierung des angeborenen Immunsystems. Dies weist auf einen bisher unbekannten Zusammenhang zwischen DNA-Schäden, der DNA-Schadensantwort und einer Typ 1-IFN-vermittelten Aktivierung des angeborenen Immunsystems bei der Pathogenese von Autoimmunität hin.

Die vorliegenden Ergebnisse belegen eine essentielle Rolle der Beseitigung von intrazellulären DNA-Metaboliten aus der DNA-Reparatur für die Aufrechterhaltung von Immuntoleranz. So führt eine unangemessene Akkumulation körpereigener DNA im Zytosol, über die Erkennung durch Nukleinsäuresensoren, zu einer Aktivierung des angeborenen Immunsystems. Dies weist auf einen bisher unbekannten Zusammenhang zwischen DNA-Schäden, der DNA-Schadensantwort und einer Typ 1-IFN-vermittelten Aktivierung des angeborenen Immunsystems bei der Pathogenese von Autoimmunität hin.

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Die beständige Autoantikörperproduktion in Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) suggeriert die Existenz eines autoreaktiven humoralen Gedächtnisses; die Häufigkeit selbstreaktiver Gedächtnis-B-Zellen in SLE wurde jedoch noch nicht ermittelt. Unter normalen Umständen exprimieren neu gebildete B-Zellen im Knochenmark Autoantikörper mit hoher Frequenz, darunter auch antinukleäre Antikörper. Diese autoreaktiven B Zellen unterliegen einer strengen Überwachung an zwei Kontrollpunkten für Selbsttoleranz, einer im Knochenmark und einer in der Peripherie. Im Gegensatz dazu steht SLE mit einem Defekt in Zusammenhang, der die Etablierung von B-Zell-Toleranz an diesen beiden Kontrollpunkten verhindert und somit einer hohe Anzahl selbstreaktiver naiver B-Zellen in der Peripherie. Das Ziel dieser Studie war die Bestimmung der molekularen Eigenschaften und Reaktivitäten von IgG Gedächtnis-B-Zell-Antikörpern in SLE. Mittels einer Einzelzell-PCR basierten Methode wurden 200 monoklonale Antikörper von einzelnen IgG+ Gedächtnis-B-Zellen vier unbehandelter SLE Patienten kloniert. Die generelle Häufigkeit an polyreaktiven und HEp-2 selbstreaktiven Antikörpern in dieser Population war vergleichbar mit der in gesunden Vergleichspersonen. 15% der Antikörper aus IgG+ Gedächtnis-B-Zellen eines Patienten mit Serum-Autoantikörpertitern derselben Spezifität waren hochreaktiv und spezifisch gegen die SLE-assoziierten löslichen Kernantigene Ro52 und La; nicht jedoch in den übrigen drei Patienten oder gesunden Vergleichspersonen. Die Keimbahnkonfigurationen dieser Antikörper gegen Kernantigen waren nicht-selbstreaktiv oder polyreaktiv mit schwacher Ro52-Bindung und untermauern die Theorie, dass somatische Mutationen zur Reaktivität und Spezifität von Autoantikörpern beitragen. Die Häufigkeitsvarianz, mit der Gedächtnis-B-Zellen SLE-assoziierte Antikörper exprimieren, legt nahe, dass dies eine wichtig Variable für den Erfolg von Therapien sein kann, die diese Population beseitigen. / Persistent autoantibody production in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) suggests the existence of autoreactive humoral immunological memory, but the frequency of self-reactive memory B cells in SLE has not been determined. Under normal circumstances, autoantibodies including antinuclear antibodies (ANAs) are frequently expressed by newly generated B cells in the bone marrow, but these autoreactive B cells are tightly regulated at two checkpoints for self-tolerance, in the bone marrow and the periphery, before maturation into naïve immunocompetent B cells. In contrast, SLE is associated with a failure to establish B cell tolerance at the two checkpoints leading to high numbers of autoreactive naïve B cells in the periphery. The aim of this study was to determine the molecular features and reactivities of IgG memory B cell antibodies expressed in SLE. A single-cell PCR based strategy was applied that allowed the cloning of the Ig heavy and Ig light chain genes of a single purified B cell and the in vitro expression of 200 recombinant monoclonal antibod-ies from single IgG+ memory B cells of four untreated SLE patients. The overall frequency of polyreactive and HEp-2 self-reactive antibodies in this compartment was similar to healthy controls (HC). 15% of IgG memory B cell antibodies were highly reactive and specific for SLE-associated extractable nuclear antigens (ENAs) Ro52 and La in one patient with serum autoantibody titers of the same specificity but not in the other three patients or healthy individuals. The germline forms of the ENA antibodies were non-self-reactive or polyreactive with low binding to Ro52 supporting the idea that somatic mutations contribute to autoantibody specificity and reactivity. Heterogeneity in the frequency of memory B cells expressing SLE-associated autoantibodies suggests that this variable may be important in the outcome of therapies that ablate this compartment.

Background: CD4+ T cells are central players of the adaptive immune response. They mediate inflammation via clonal expansion, differentiation into specific response subtypes and production of inflammatory signals that promote cytotoxicity and antibody production by other immune cells. CD4+ T cells may also differentiate into regulatory T cells (Treg) that control autoimmune responses and promote tolerance. Loss of CD4+ T cell tolerance to autoantigen leads to unwanted T cell responses and autoimmunity. Immunomodulation therapies that affect CD4+ T cells have become a paradigm to reverse T cell mediated autoimmunity, either by blocking T cell activation signals (Chamian et al., 2007; Keymeulen et al., 2005; Scheinfeld, 2005) or by enhancing tolerogenic function (Hartemann et al., 2013; Marcovecchio et al., 2020). Some of these single drug therapies are now used in trials or in practice to treat patients with autoimmune diseases. However, their true immunomodulating capacity on CD4+ T cell phenotype is unclear. Scientific Question: The aim of my thesis is to identify immunomodulators that modify the transcriptional profile of antigen-responsive human CD4+ T cells toward anergy or tolerance. I selected compounds targeting critical pathways of T cell activation that have relevance to autoimmunity in type 1 diabetes. I examined the in vitro effect of immunomodulation on naïve and memory CD4+ T cell proliferation upon stimulation with model antigens. Responsiveness of immunomodulated cells to subsequent antigen stimulation was also investigated. Single cell transcriptomic analyses were performed on proliferating and non-proliferating CD4+ T cells stimulated with model antigens in the presence of immunomodulation to detect potential alterations in their profile in comparison to untreated cells. Materials and Methods: CD4+ T cell responses to antigen stimulation were assessed using proliferation assays in the presence of absence of immunomodulating drugs. The drugs assessed were the JAK inhibitor Tofacitinib, the natural phenol Resveratrol, an anti-human IFN-αR monoclonal antibody, the anti-IL-6R monoclonal antibody Tocilizumab, the proteasome inhibitor Bortezomib, the IgG1-CTLA-4 fusion protein Abatacept, a DHODH inhibitor (Compound A) and a RORγT inverse agonist (Compound B). The effects on human peripheral blood memory CD4+ T cells were examined using the recall antigens Flu and Tetanus Toxoid and the superantigen SEB at a concentration that stimulated TCRVβ17+ cells. The effects on naïve CD4+ T cells were assessed using SEB. Responses were measured using flow cytometry. Re-stimulation of inhibited cells in the absence of immunomodulator was performed to examine the legacy of immunomodulated CD4+ T cells post-treatment. For the transcriptomic analyses, single cells were sorted with FACS and their transcriptome was sequenced with RNAseq. For memory CD4+ T cells stimulated with recall antigens, the proliferated responsive cells in cultures with and without immunomodulatory drug were examined and compared. For memory and naïve CD4+ T cells stimulated with SEB, the non-proliferated TCRVβ17+ CD4+ T cells in cultures with and without immunomodulatory drug were examined and compared. The differentially expressed genes were examined and further processed using the Ingenuity Pathway Analysis. Results: All the selected compounds consistently reduced the frequencies of proliferating memory CD4+ T cells responding to recall antigens, with the exception of the anti-IFN-αR and Tocilizumab. Re-stimulation in the absence of inhibitor showed a persistent loss of responsive capacity to the recall antigen for cells that had been exposed to Resveratrol and to the RORγT inverse agonist. The transcriptome of isolated single CD4+ CD25+ T cells that proliferated in the presence of these compounds was comparable to that of not treated proliferative cells, showing minor and inconsistent across PBMC samples differences in gene expression. These data suggest that the immunomodulators induced little change in memory CD4+ T cell phenotype. Resveratrol, the DHODH inhibitor and a RORγT inverse agonist, but none of the other compounds successfully inhibited proliferation of responsive to SEB naïve and memory TCRV17+ cells, without affecting their viability. Responsiveness of these inhibited cells to SEB was restored in the absence of immunomodulators. The transcriptome of isolated non-proliferating TCRV17+ cells exposed to SEB in the absence of immunomodulators was characteristic of stimulated T cells with upregulated pathways related to TCR signaling, anabolic biosynthetic processes and chromosomal replication. Non-proliferating cells that were stimulated but inhibited by the three compounds had a transcriptional profile consistent with downregulation of response to SEB. Resveratrol had the strongest downregulating effect in both naïve and memory cells. The inhibited pathways that were commonly affected by all compounds were associated with cell cycle control of chromosomal replication, tRNA charging, spliceosomal cycle and necroptosis, demonstrating the role of these pathways in the CD4+ T cell response to SEB. The transcriptomic data of immunomodulated dividing or not dividing CD4+ T cells did not provide evidence of an induced Treg phenotype. Conclusions: The established in vitro models identified six inhibitors of memory antigen-specific CD4+ T cell response and three that were additionally able to inhibit memory and naïve response to SEB. The transcriptomic data suggest that the primary effect of the tested immunomodulators is on the T cell responsiveness to antigen and not on the T cell phenotype. I conclude that while the majority of immunomodulators can severely inhibit CD4+ T cell response, none of the tested immunomodulators have a combined capacity to inhibit and shift antigen-responsive CD4+ T cells toward tolerogenic phenotypes in vitro. I interpret these data as indicating that successful therapeutic application is likely to require chronic administration. / Hintergrund: CD4+ T-Zellen sind zentrale Koordinatoren der adaptiven Immunantwort. Sie vermitteln Entzündung durch klonale Expansion, durch Ausdifferenzierung in Subtypen der spezifischen Antwort und durch Produktion von Entzündungssignalen, die wiederum die Zytotoxizität und Antikörperproduktion durch andere Immunzellen fördern. CD4+ T-Zellen können sich auch in regulatorische T-Zellen (Treg) differenzieren, die Autoimmunantworten kontrollieren und die Toleranz fördern. Der Verlust der Toleranz von CD4+ T-Zellen gegenüber Autoantigenen führt zu unerwünschten T-Zell-Reaktionen und Autoimmunität. Immunmodulationstherapien, die CD4+ T-Zellen beeinflussen, sind zum Musterbeispiel geworden, um T-Zell-vermittelte Autoimmunität, entweder durch Blockierung von T-Zell-Aktivierungssignalen (Chamian et al., 2007; Keymeulen et al., 2005; Scheinfeld, 2005) oder durch Verbesserung der tolerogenen Funktion (Hartemann et al., 2013; Marcovecchio et al., 2020), umzukehren. Einige dieser auf einzelnen Medikamenten basierenden Therapien werden jetzt in Studien oder in der Praxis zur Behandlung von Patienten mit Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Ihr tatsächlicher immunmodulierender Einfluss auf den CD4+ T-Zell-Phänotyp ist jedoch unklar. Fragestellung/Hypothese: Das Ziel meiner Doktorarbeit ist es, Immunmodulatoren zu identifizieren, die das Transkriptionsprofil humaner Antigen-responsiver CD4+ T-Zellen in Richtung Anergie oder Toleranz verändern. Hierzu wählte ich Substanzen aus, die auf maßgebliche Signalwege der T-Zell-Aktivierung wirken und für die Autoimmunität bei Typ-1-Diabetes von Bedeutung sind. Ich untersuchte den in vitro Effekt der Immunmodulation auf die Proliferation von naiven und CD4+ Gedächtnis-T-Zellen nach Stimulation mit Modellantigenen. Das Ansprechverhalten immunomodulierter Zellen auf nachfolgende Antigenstimulation wurde ebenfalls untersucht. Einzelzell-Transkriptomanalysen wurden an proliferierenden und nicht-proliferierenden CD4+ T-Zellen durchgeführt, die mit Modellantigenen in Gegenwart der Immunmodulation stimuliert wurden, um mögliche Veränderungen in ihrem Profil im Vergleich zu unbehandelten Zellen aufzuspüren. Material und Methoden: Die CD4+ T-Zell-Antworten auf die Antigenstimulation wurden mit Hilfe von Proliferationsassays in An- und Abwesenheit von immunmodulierenden Medikamenten untersucht. Bei den untersuchten Medikamenten handelte es sich um den JAK-Inhibitor Tofacitinib, das natürliche Phenol Resveratrol, einen monoklonalen Anti-IFN-αR-Antikörper, den monoklonalen Anti-IL-6R-Antikörper Tocilizumab, den Proteasominhibitor Bortezomib, das IgG1-CTLA-4-Fusionsprotein Abatacept, einen DHODH-Inhibitor (Substanz A) und einen inversen RORγT-Agonisten (Substanz B). Die Effekte auf CD4+ Gedächtnis-T-Zellen des humanen peripheren Blutes wurden mit den Recall-Antigenen Grippe und Tetanus-Toxoid, sowie mit dem Superantigen SEB in einer Konzentration, die TCRVβ17+ T-Zellen stimuliert, untersucht. Die Auswirkungen auf naive CD4+ T-Zellen wurden mit SEB untersucht. Die Antworten wurden mittels Durchflusszytometrie (FACS) gemessen. Eine Re-Stimulation der gehemmten Zellen in Abwesenheit des Immunmodulators wurde durchgeführt, um die längerfristige Wirkung der immunmodulierten CD4+ T-Zellen nach der Behandlung zu untersuchen. Für die Transkriptom-Analysen wurden einzelne Zellen via FACS sortiert und ihr Transkriptom mit von RNAseq sequenziert. Für CD4+ Gedächtnis-T-Zellen, die mit Recall-Antigenen stimuliert wurden, konnten die proliferierten, Antigen-responsiven T-Zellen in Kulturen mit und ohne Immunmodulator untersucht und verglichen werden. Für CD4+ Gedächtnis-T-Zellen und naive CD4+ T-Zellen, bei den die Stimulation mit SEB erfolgte, wurden nicht-proliferierte TCRVβ17+ CD4+ T-Zellen in Kulturen mit und ohne Immunmodulator analysiert. Die differentiell exprimierten Gene wurden ermittelt und mit Hilfe der Ingenuity Pathway Analyse untersucht. Ergebnisse: Alle ausgewählten Substanzen, mit Ausnahme von Anti-IFN-αR und Tocilizumab, reduzierten durchweg die Häufigkeit der proliferierenden CD4+ Gedächtnis-T-Zellen, die auf Recall-Antigene reagierten. Eine erneute Stimulation in Abwesenheit des Inhibitors zeigte einen anhaltenden Verlust des Ansprechverhaltens auf das Recall-Antigen für Zellen, die mit Resveratrol und dem inversen RORγT-Agonisten inkubiert worden waren. Das Transkriptom isolierter einzelner CD4+ CD25+ T-Zellen, die in Gegenwart dieser Substanzen proliferierten, war mit dem von nicht behandelten, proliferativen Zellen vergleichbar und zeigte geringfügige, und über PBMC-Proben hinweg inkonsistente, Unterschiede in der Genexpression. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Immunmodulatoren nur eine geringe Veränderung des Phänotyps der CD4+ Gedächtnis-T-Zellen induzierten. Resveratrol, der DHODH-Inhibitor und ein inverser RORγT-Agonist, aber keine der anderen Substanzen hemmten erfolgreich die Proliferation von SEB-responsiven naiven und TCRVβ17+CD4+ Gedächtnis- T-Zellen, ohne deren Viabilität zu beeinträchtigen. Das Ansprechverhalten dieser gehemmten Zellen auf SEB wurde in Abwesenheit von Immunmodulatoren wiederhergestellt. Das Transkriptom von isolierten nicht-proliferierenden TCRV17+ T-Zellen, die SEB in Abwesenheit von Immunmodulatoren ausgesetzt wurden, war charakteristisch für stimulierte T-Zellen und zeigte hochregulierte Signalwege, die mit T-Zell-Rezeptor-Signaling, anabolen biosynthetischen Prozessen und chromosomaler Replikation zusammenhängen. Nicht-proliferierende Zellen, die stimuliert, aber durch die drei Substanzen gehemmt wurden, hatten ein Transkriptionsprofil, das mit einem Herunterregulieren der Reaktion auf SEB übereinstimmt. Resveratrol hatte den stärksten herunterregulierenden Effekt sowohl in naiven als auch in Gedächtnis-T-Zellen. Die gehemmten Signalwege, die von allen Substanzen gemeinsam beeinflusst wurden, waren mit der Zellzykluskontrolle der chromosomalen Replikation, der tRNA-Ladung, dem Spliceprozess und der Nekroptose assoziiert, was die Rolle dieser Signalwege bei der Reaktion der CD4+ T-Zellen auf SEB zeigt. Die Transkriptionsdaten von immunomodulierten, proliferierenden oder nicht-proliferierenden CD4+ T-Zellen lieferten keine Hinweise auf einen induzierten regulatorischen T-Zell-Phänotyp. Schlussfolgerung: Die etablierten in vitro-Modelle identifizierten sechs Inhibitoren der Antigen-spezifischen CD4+ Gedächtnis-T-Zell-Antwort und drei, die zusätzlich die Gedächtnis- und naive T-Zell-Antwort auf SEB hemmen konnten. Die Transkriptom-Daten legen nahe, dass der primäre Effekt der getesteten Immunmodulatoren auf dem T-Zell-Ansprechverhalten auf das jeweilige Antigen beruht und nicht auf Änderungen des T-Zell-Phänotyps zurückzuführen ist. Ich folgere daraus, dass die meisten Immunmodulatoren zwar die CD4+ T-Zell-Antwort stark hemmen können, aber keiner der getesteten Immunmodulatoren in vitro eine kombinierte Fähigkeit zur Hemmung der Antigen-responsiven CD4+ T-Zellen bei gleichzeitiger Verschiebung in Richtung tolerogener Phänotypen hat. Ich interpretiere diese Daten als Hinweis darauf, dass eine erfolgreiche therapeutische Anwendung dieser Substanzen voraussichtlich einer chronischen Verabreichung bedarf.

Einleitung: Jeder sechste Mann und jede siebte Frau in der westlichen Welt werden am Myokardinfarkt und seinen Folgepathologien sterben. Nach einem Infarkt ist das Herz nicht fähig die nekrotisierten Kardiomyozyten zu regenerieren, es findet lediglich eine Defektheilung statt. Das entstehende Platzhaltergewebe besteht aus Bindegewebe und ist Ziel fortlaufender Heilungs- und Umbauprozesse. Ob diese in einer stabilen funktionalen Narbe oder in einem Herzwandaneurysma mit sich verschlechternder Herzfunktion enden, hängt im Wesentlichen von dem physiologischen Abschluss des Entzündungsprozesses ab. Den ersten Schritt der Heilung stellt die sterile Entzündung dar, welche durch Proteolyse und Phagozytose die strukturelle Grundlage für die Proliferation des Narbengewebes schafft. Doch auch in späteren Heilungsphasen steuern immunologische Prozesse den regenerativen Ablauf und kommen im besten Fall mit der Ausheilung der Narbe zum Erliegen. Es kann allerdings auch zu einem pathologischen Persistieren dieser Entzündungsantwort kommen, was meist zu einer chronischen Verschlechterung der Organfunktion führt. In welche Richtung sich diese Entzündungsantwort entwickelt, scheint maßgeblich von der Art der Reaktivität des adaptiven Immunsystems auf das ausheilende Gewebe abzuhängen. Nachdem Autoimmunität lange Zeit nur in ihrem pathologischen Kontext untersucht wurde, zeigten mehrere Wundheilungsmodelle die notwendige Beteiligung des adaptiven Immunsystems für eine physiologische Regeneration. Dabei reagieren heilungsförderliche Lymphozyten auf gewebespezifische Autoantigene. Dies zeigte sich auch durch die Aktivierung regulatorischer T-Helfer-Zellen nach einem experimentellen Myokardinfarkt (EMI) in Mäusen, die ihrerseits myokardiale Entzündungsprozesse, Heilung und Remodeling positiv modulieren. Ein Autoantigen, welches in diesem Kontext diskutiert wird, ist das Kardiomyosin. Es wird ausschließlich herzrestriktiv exprimiert und ist in der Lage immunstimulierend zu wirken. Ziele der Untersuchung: In der vorliegenden Arbeit wurde die Relevanz der Antigenspezifität bezüglich Kardiomyosin in immunologischen Heilungsprozessen untersucht. Dabei wurde im Speziellen auf die Beeinflussung der T-Zell-Reaktivität durch das Milieu des infarzierten Herzens eingegangen. Tiere, Material und Methoden: Es wurden Kardiomyosin-spezifische Thy1.1+ CD4+ T- Helfer-Zellen (TCR-M) in gesunde Thy1.2+ Wildtyp-BALB/c- und transgene Do11.10- Empfängermäuse transferiert. Einen Tag später wurde durch die Ligatur eines Herzkranzgefäßes ein permanenter Infarkt ausgelöst. An Tag 7 post operationem wurden die Qualität des Heilungsvorganges und die Herzfunktion mittels Echokardiographie beurteilt. An Tag 7 und 49 post operationem wurden die Organe (Herz, Mediastinallymphknoten, Kniefaltenlymphknoten und Milz) entnommen und das T-Zellkompartiment, sowie dessen organspezifische Abundanz mittels Durchflusszytometrie und Light-Sheet Flourescence Microscopy (LSFM) charakterisiert. Die Experimente wurden mit 3-23 Mäusen pro Gruppe jeweils 2-5 Mal unabhängig voneinander durchgeführt. Für die statischen Analysen wurden die Mittelwerte der Variablen mittels ungepaarter t-Tests (Vergleich zweier Mittelwerte) oder two-way ANOVA gefolgt durch die Šidák Korrektur (Vergleich von mehr als zwei Mittelwerten) verglichen. Wahrscheinlichkeitswerte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Ergebnisse: Durchflusszytometrie und LSFM Analysen stellten eine erhöhte Akkumulation und Aktivierung der TCR-M in Herzen infarzierter Mäuse zur Hochphase des Heilungsprozesses (Tag 7) im Vergleich zur Sham-Gruppe (Kontroll-operierte Mäusen ohne Infarkt) dar. Dieses Phänomen konnte nicht an anderen untersuchten Orten im Körper (Milz, Kniefaltenlymphknoten) festgestellt werden. In den Mediastinallymphknoten kam es sowohl unter Kontroll-, als auch Infarktbedingungen zu einer Akkumulation und Aktivierung der TCR-M, was auf konstitutiv ablaufende autoimmune Prozesse hindeutet. In der chronischen Heilungsphase (Tag 49) verteilte sich diese Zellpopulation gleichmäßig auf die untersuchten Organe, was für eine selbstlimitierende Autoreaktivität post-EMI der T-Zellen spricht. Bemerkenswerterweise differenzierten transferierte TCR-M, die in ihren Spendertieren pathogen wirken und eine letale Autoimmunmyokarditis auslösen, in infarzierten Mäusen zu regulatorischen T-Zellen. Dort agieren sie kardioprotektiv, was letztendlich zum Erhalt der echokardiographisch erhobenen Herzfunktionsparameter führte. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern Evidenz für die ursächliche Rolle des herzspezifischen Antigens Kardiomyosin in der postinfarziellen T-Zell-Reaktivität. Weiterhin wird der determinierende Einfluss des Infarktkontextes unabhängig von Antigenspezifität demonstriert. Dieser polarisiert T-Helfer-Zellen in ihrer Funktion zu regulatorischen T-Zellen und führt zu einer protektiven und heilungsförderlichen Autoimmunantwort.
:1. Einleitung - 1 2. Literaturübersicht und Zielstellung - 3 2.1. Der Myokardinfarkt - 3 2.2. Pathophysiologie des Myokardinfarktes - 4 2.3. T-Zellen - 10 2.3.1. Die funktionelle Rolle der T-Zellen - 10 2.3.2. Konventionelle T-Zellen - 11 2.3.3. Regulatorische T-Zellen - 14 2.3.4. Der T-Zell-Rezeptorkomplex - 16 2.3.5. Genesis und Toleranz des T-Zell Kompartiments - 19 2.3.6. T-Zellen im Myokardinfarkt - 22 2.4. Antigenspezifität und Autoimmunität im Myokardinfarkt - 23 2.5. Zielstellung der Studie - 24 3. Material und Methoden - 25 3.1. Versuchsaufbau - 25 3.2. Versuchstiere - 25 3.3. Organentnahmen - 26 3.4. Adoptiver CD4+ T-Zell Transfer - 26 3.5. Fluorescence-Activated Cell Sorting - 27 3.6. Experimenteller Herzinfarkt - 31 3.7. Echokardiographie - 33 3.8. Light-Sheet Fluorescence Microscopy - 35 3.9. Statistische Analysen - 35 4. Ergebnisse - 36 4.1. TCR-M Akkumulation post-EMI in med-LN und Herz - 36 4.2. TCR-M Aktivierung und Differenzierung zu Tregs post-EMI - 40 4.3. Kardioprotektion post-EMI durch TCR-M in DO11.10-Empfängertieren - 43 5. Diskussion - 46 5.1. Wahl des Kandidatenantigens - 46 5.2. Kritische Betrachtung der Analysemethoden - 47 5.3. Interpretation der Daten - 48 5.4. Vergleich der Tiermodelle - 52 5.5. Vergleich der chirurgischen Modelle - 53 5.6. Belastungseinschätzung - 54 6. Zusammenfassung - 56 7. Summary - 58 8. Literaturverzeichnis - 60 9. Danksagung - 74

The second meeting for the International Consensus on Antinuclear antibody (ANA) Pattern (ICAP) was held on 22 September 2015, one day prior to the opening of the 12th Dresden Symposium on Autoantibodies in Dresden, Germany. The ultimate goal of ICAP is to promote harmonization and understanding of autoantibody nomenclature, and thereby optimizing ANA usage in patient care. The newly developed ICAP website www.ANApatterns.org was introduced to the more than 50 participants. This was followed by several presentations and discussions focusing on key issues including the two-tier classification of ANA patterns into competent-level versus expert-level, the consideration of how to report composite versus mixed ANA patterns, and the necessity for developing a consensus on how ANA results should be reported. The need to establish on-line training modules to help users gain competency in identifying ANA patterns was discussed as a future addition to the website. To advance the ICAP goal of promoting wider international participation, it was agreed that there should be a consolidated plan to translate consensus documents into other languages by recruiting help from members of the respective communities.

Testing for autoantibodies (AABs) is becoming more and more relevant, not only for diagnosing autoimmune diseases (AIDs) but also for the differentiation of defined AID subtypes with different clinical manifestations, course and prognosis as well as the very early diagnosis for adequate management in the context of personalized medicine. A major challenge to improve diagnostic accuracy is to harmonize or even standardize AAB analyses. This review presents the results of the 12th Dresden Symposium on Autoantibodies that focused on several aspects of improving autoimmune diagnostics. Topics that are addressed include the International Consensus on ANA Patterns (ICAP) and the International Autoantibody Standardization (IAS) initiatives, the optimization of diagnostic algorithms, the description and evaluation of novel disease-specific AABs as well as the development and introduction of novel assays into routine diagnostics. This review also highlights important developments of recent years, most notably the improvement in diagnosing and predicting the course of rheumatoid arthritis, systemic sclerosis, idiopathic inflammatory myopathies, and of autoimmune neurological, gastrointestinal and liver diseases; the potential diagnostic role of anti-DFS70 antibodies and tumor-associated AABs. Furthermore, some hot topics in autoimmunity regarding disease pathogenesis and management are described.