Résumé : L’IL-7 et l’IL-15 sont des cytokines impliquées dans l’homéostasie des lymphocytes T CD8 naïfs et mémoires respectivement. Lors d’une réponse immunitaire, certaines cytokines pro-inflammatoires, comme l’IL-6 et l’IL-21, sont produites par les cellules du système immunitaire inné. Nous avons observé que certaines cytokines de ces deux groupes (homéostasie et pro-inflammatoires), peuvent avoir un effet synergique sur la fonction des lymphocytes T CD8. Spécifiquement, l’incubation des lymphocytes T CD8 naïfs avec l’IL-6 ou l’IL-21, en présence d’IL-7 ou d’IL-15 cause une forte prolifération qui est indépendante de l’antigène. De plus, la combinaison d’IL-15 avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraîne une prolifération préférentielle des lymphocytes T mémoires, tandis que la combinaison avec l’IL-7 entraîne une prolifération des lymphocytes T naïfs. La stimulation des lymphocytes T CD8 avec l’IL-6 ou l’IL-21, en présence d’IL-7 ou d’IL-15, entraîne une augmentation de la phosphorylation en tyrosine de STAT5 ainsi qu’une augmentation de liaison à l’ADN. Nous avons étudié l’effet d’une pré-stimulation des cellules T CD8 naïves par les cytokines synergiques sur leur réponse subséquente à un antigène. Nous avons observé qu’une pré-stimulation avec l’IL-6 ou l’IL-21, en présence d’IL-7 ou d’IL-15, même pour une courte durée de 24 heures, augmente leur sensibilité aux antigènes, entraînant une robuste prolifération et une forte augmentation de cytotoxité spécifique à l’antigène gp33. Nous avons observé que les cytokines pro-inflammatoires en combinaison avec l’IL-7 induisent une augmentation accrue de la prolifération chez les lymphocytes T CD8 exprimant un TCR transgénique de forte affinité (P14), ainsi que les cellules exprimant un TCR de faible affinité (H-Y). De plus, la combinaison synergique de cytokines entraîne une forte expression du récepteur de l’IL-2R[gamma] (CD132), ainsi qu’une augmentation de la production d’IL-2 après stimulation antigénique. Une forte augmentation de l’expression de CD8 et de CD45, ainsi qu’une diminution drastique de l’expression de CD5 peut expliquer l’augmentation de l’avidité fonctionnelle du TCR suite à une stimulation avec les combinaisons de cytokines synergiques. La stimulation des lymphocytes T CD8 avec les combinaisons de cytokines, induit une augmentation de la phosphorylation de LAT ainsi qu‘AKT. Cependant, la stimulation subséquente du CD3 n’entraîne pas d’augmentation de la phosphorylation de LAT ainsi qu’AKT chez les lymphocytes T CD8 pré-stimulés avec les combinaisons de cytokines. Nous avons aussi observé que les lymphocytes T CD8 stimulés avec les combinaisons de cytokines augmentent l’expression de CD62L, ce qui peut favoriser leur migration vers les ganglions lymphatiques. En conclusion, la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-15, IL-21) par les cellules du système immunitaire inné lors d’une infection ou d’une inflammation, ainsi que la présence constitutive d’IL-7, peuvent stimuler la prolifération et l’activation des lymphocytes T CD8 de façon non spécifique à l’antigène. Cette stimulation entraîne une augmentation de l’avidité fonctionnelle de leur TCR causant ainsi une forte prolifération ainsi que l’acquisition de fonctions effectrices spécifiques. Cette liaison entre le système immunitaire inné et adaptatif, médiée par les cytokines pro-inflammatoires et les cytokines homéostatiques joue un rôle très important dans l’élimination des pathogènes ainsi que dans le développement de maladies auto-immunitaires. / Abstract : Homeostasis of naive and memory CD8[superscript +] T lymphocytes is dependent on two cytokines IL-7 and IL-15, respectively. During an immune response to an infection, cells of the innate immune system produce several pro-inflammatory cytokines. We have observed that these two groups of cytokines, namely proinflammatory and homeostatic, can have a synergistic effect on CD8 T lymphocytes. Specifically, incubation of naive CD8 T cells with IL-6 or IL-21 in the presence of IL-7 or IL-15 induced strong proliferation in an antigen independent manner. While the combination of IL-6 or IL-21 with IL-15 induced strong proliferation of memory CD8 T cells, naïve CD8 T cells responded better to the combination with IL-7. These stimulatory cytokine combinations elicited strong STAT5 phosphorylation and it’s binding to DNA in CD8 T cells. We investigated the effect of priming CD8 T cells with the synergistic combination of IL-6 or IL-21 and IL-7 on their subsequent response to antigen. We observed that cytokine priming for only 24 hours enhanced their sensitivity to antigen, resulting in strong proliferation, effectors functions and cytotoxicity. These effects were observed with CD8 T cells expressing transgenic TCR with strong (P14) or weak (H-Y) affinity towards cognate peptide antigens. Priming CD8 T cells with the synergistic combination of cytokines increased the expression of IL-2 receptor gamma (CD132) and augmented the production of IL-2 when stimulated with antigen. These cells also expressed elevated levels of CD8 and CD45, as well as down modulate CD5, and these events may underlie the increased TCR avidity. Stimulation of CD8 T cells with the synergistic combination of cytokines induced phosphorylation of LAT and AKT. However, subsequent TCR stimulation did not further increase these phosphorylation events. We have observed that C D8 T cells primed with the synergistic combinations of cytokines up regulated CD62L, which could promote their migration through lymph nodes. In conclusion, inflammatory cytokines such as (IL-6, IL-15, IL-21) secreted by cells of the innate immune system during an infection or non-infectious inflammation, and basal levels of the homeostatic cytokine IL-7 can act in synergy with inflammatory cytokines to activate CD8 T lymphocytes in an antigen independent manner. This stimulation also results in an increase in the functional avidity of their TCR, as indicated by strong antigen responsiveness with increased proliferation and display of effectors functions. This connection between the innate and adaptive system mediated by inflammatory cytokines may play an important role in pathogen clearance and possibly in the development of autoimmune diseases.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les lectines de type C (CLRs) sont des récepteurs impliqués dans la reconnaissance d’oligosaccharides et principalement exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigène (APCs) et notamment des cellules dendritiques (DCs), véritable sentinelle de notre système immunitaire. Elles sont impliquées dans la reconnaissance de motifs spécifiques exprimés à la surface d’agents pathogènes et sont capables de stimuler le système immunitaire afin de déclencher une réponse adaptée. Ce rôle crucial joué par les CLRs dans l’équilibre de la réponse immunitaire confère aux interactions CLR/glycane des perspectives d’applications pharmaceutiques. L’objectif à long-terme du projet de recherche dans lequel cette thèse s’intègre consiste à utiliser ces CLRs pour modeler les réponses du système immunitaire. A cette fin, des néoglycoconjugués spécifiques de chaque CLR doivent être développés. Au cours de cette thèse, 9 CLRs ont été produits BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle. Différentes stratégies de production ont été testées en parallèle, incluant des techniques d’adressage au périplasme en vue d’obtenir des protéines solubles et fonctionnelles et de l’expression cytoplasmique, sous forme de corps d’inclusion suivie d’étapes de renaturation qui s’est révélé la plus efficace au final. Une stratégie permettant de construire des tétramères artificiels de CLRs, appelés TETRALEC, a été mise au point. Cet outil permettant le criblage et la caractérisation des lectines a été obtenu avec DC-SIGNR par un marquage spécifique de la lectine. Le complexe TETRALEC a été caractérisé au niveau structural et des tests fonctionnels ont été menés sur des puces à glycanes et des cellules pathogènes. La série de CLRs que nous avons produites a été utilisée pour cribler des puces à glycanes et à glycomimétiques. Ces études nous ont permis de mettre en évidence des interactions dépendantes de l’environnement du glycane et d’identifier de nouveaux glycanes ou glycomimétiques spécifiques de certains CLRs. En effet, de manière étonnante, plusieurs des CLRs testés sont capables, pour un glycane donné, de discriminer des isomères de position ouvrant ainsi de nouveaux questionnements sur la signification biologique de cette sélectivité. De plus des glycomimétiques reconnaissant préférentiellement dectin-2 par rapport à DC-SIGN, DCSIGNR et langerin ont été identifiés. Le choix des glycomimétiques et l’évaluation des étapes de leur optimisation ont été permis par diverses études biophysiques qui ont quantifié la force et la spécificité des interactions. Ceci a permis le développement d’un ligand optimisé sélectif de DC-SIGN. La co-cristallisation de la protéine avec ce ligand a révélé un intéressant mode de liaison qui amène également de nouvelles questions. Simultanément à l’optimisation de ligands monovalents, un premier pas a été réalisé vers la conception d’une molécule pour permettre une vaccination contre le cancer médiée par les CLRs. Les résultats de SPR ont identifié des candidats potentiellement intéressants et des tests biologiques préliminaires ont été réalisés. / C-type Lectin Receptors (CLRs) are carbohydrate-binding proteins mainly expressed on Antigen Presenting Cells (APCs), including dendritic Cells (DCs), the sentinel of the innate immune system. They recognize pathogens or damaged cells by interacting with glycan features and the encounter between the CLR and its ligand constitutes a necessary step for the activation of the adaptive immune system. This crucial role played by CLRs in the balance of immune responses offers to CLR-glycan interactions pharmaceutical applications. The long-term objective of the research project in which this PhD is included is to use these CLRs as modulators in order to tailor the immune system responses. To do so, neoglyco-conjugates selective to each individual CLR have to be developed.Nine different CLRs were produced in this work: BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle.Several approaches have been explored in parallel for CLR production, ranking from bacterial periplasmic targeting, aiming to express soluble and functional protein, to inclusion bodies production into the bacterial cytoplasm, with subsequent protein refolding. Our collection of CLRs were used to screen glycan and glycomimetic arrays, highlighting context-dependent binding and identifying natural ligands or glycomimetics selective to each CLRs. Thus, several CLRs were surprisingly able to differentiate between positional isomers of a given N-Glycan, which opens new questions regarding the biological significance. Moreover, glycomimetics with a selectivity towards dectin-2 over DC-SIGN, DC-SIGNR and langerin CLRs have been identified.To guide the choice of the glycomimetics and estimate their optimisation, diverse biophysical studies were performed to evaluate the strength and specificity of the interaction. This enabled the development of an ultimate ligand selective towards DC-SIGN. A co-crystallised structure of the protein with this ligand revealed an interesting binding mode that also opens new questions.Simultaneously to monovalent ligand optimization, a first step towards the design of a highly defined molecule for cancer vaccination by CLR targeting was made. SPR results revealed potential candidates to exploit and preliminary biological assays were performed. Finally, a strategy for tetrameric lectin engineering as been explored, termed TETRALEC. This tool for screening and lectin characterization, has been obtained with one the lectin of the study, DC-SIGNR, by a site-specific labelling of the lectin. The TETRALEC complex was structurally characterised and functional assays were performed on glycan array and pathogen cells.

Les composantes innée et acquise de l'immunité travaillent ensemble pour assurer une protection efficace de l'organisme. Les cellules dendritiques, cellules sentinelles de l’immunité capturent via des récepteurs de surface les agents pathogènes et les présentent aux lymphocytes T pour stimuler les réponses immunitaires adaptatives spécifiques. Une famille de ces récepteurs, nommée Récepteurs Lectines de type C (CLRs) ont un rôle important dans la reconnaissance de motifs oligosaccharides des pathogènes. Leurs fonctions sont parfois détournées par certains pathogènes à leur avantage et notamment le VIH. La reconnaissance du virus par DC-SIGN, une des CLRs, favorise la dissémination du virus. A l’inverse, la langerine, autre CLR, est considérée comme une barrière naturelle au VIH. Ainsi, DC-SIGN est devenue une cible thérapeutique prometteuse mais sa reconnaissance des ligands osidiques est largement partagée par la langerine.Ce travail vise à développer des antagonistes de DC-SIGN spécifiques et de hautes affinités permettant de rivaliser avec la présentation multivalente des glycosylations de gp120 du VIH avec DC-SIGN. Une approche rationnelle a été employée dans le développement de ligands glycomimétiques hautement sélectifs pour DC-SIGN à partir de l’étude du site de liaison des deux CLRs. Puis, des plates-formes de présentations de ces glycomimétiques, de valences et de géométries différentes, sont comparées par SPR. Les améliorations spectaculaires d'affinités parfois observées sont liées à différents mécanismes d’interactions multivalentes responsables d’un phénomène d’avidité.Sur une des architecture de présentation sélectionnée (RODs), un travail de caractérisation fine des mécanismes responsables de ce gain d’affinité et/ou d’avidité a été conduit par la combinaison de plusieurs techniques biophysiques (SPR, ITC, polarisation de fluorescence et AUC). L’influence de la topologie de cette structure sur les mécanismes d’interactions est ainsi mise en évidence. Par les travaux menés, plusieurs ligands multivalents ont montré des affinités sans précédent pour DC SIGN atteignant des affinités du nanomolaire et représentant les meilleurs inhibiteurs connus à ce jour.Associé au développement d’antagonistes multivalents, une CLR (DCIR) a été identifiée récemment comme impliquée dans la dissémination du VIH, comme DC¬SIGN. Dans une perspective future de développement de glycomimétique, des travaux ont été menés sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de ce nouvel acteur dans la problématique VIH. / The innate and acquired immunity components work together to provide efficient protection of organisms. Dendritic cells, sentinel cells of the immunity, are able to capture pathogens through their receptors on the surface and they can present the antigens to lymphocytes T in order to stimulate specific adaptive immune responses. Among these receptors, there is a family named C-type lectin receptors (CLRs), which has an important role in the recognition of pathogenic oligosaccharide motifs. CLRs can be hijacked by many pathogens including HIV. DC-SIGN, one of the CLRs, interacts with the virus and promotes its dissemination. Unlike DC-SIGN, langerin, another CLR, has a protective role against the HIV infection. In this context, DC-SIGN became a promising therapeutic target but it shares ligand specificities with langerin.This work aims to develop highly specific antagonists against DC-SIGN in order to compete with the multivalent glycosylated gp120 protein of HIV. Using the study of the two lectins binding sites as starting point, a rational approach has been exploited to develop highly selective glycomimetics against DC SIGN. The SPR technique was used to investigate multivalent platforms with different valencies as well as ligand presentation in space. The amazing improvement of the affinity observed in some cases can be linked to different mechanisms of multivalent interactions, leading to an avidity phenomenon. On a selected scaffold (RODs), we characterized the different mechanisms responsible for the affinity and/or avidity gains, using a combination of different biophysical techniques (SPR, ITC, fluorescence polarization, AUC). In this work, we highlighted that the topology of this structure can influence the mechanisms of interactions. Overall, different multivalent ligands showed unique affinities for DC-SIGN, reaching the nanomolar affinity range, and they represent the best inhibitors to date.Finally, another CLR has been recently identified as one of the protein involved in the HIV infection as well as DC-SIGN. In a future perspective of glycomimetic development, structural and functional characterization has been done on this new actor involved in the HIV issue.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Les romans de l'auteure autrichienne Elfriede Jelinek sont souvent le lieu d'une présence énonciative très marquée. L'instance narrative, dont la présence devient un des principes mêmes de l'économie du texte, se manifeste constamment par des commentaires, des réflexions et des jugements sur l'histoire qu'elle raconte. Prenant appui sur deux romans de Jelinek (Lust et Avidité. Roman de divertissement), ce mémoire a pour objectif d'étudier les effets de cette forte présence subjective sur l'instauration et la problématisation de l'autorité de la voix narrative. Cette étude montre également dans quelle mesure le concept d'autorité narrative peut être intéressant pour analyser une oeuvre comme celle de Jelinek, où l'instance narrative qui s'avère très autoritaire serait, sur le plan discursif, le corollaire de tous ces personnages dominateurs qui peuplent l'univers de la récipiendaire du prix Nobel de littérature de 2004.

Cette thèse propose une modélisation de la dynamique psychique à l’œuvre dans les contextes d’anorexie. A partir d’une approche processuelle, elle explore la continuité psychodynamique entre les anorexies du bébé-dans-sa-famille et les anorexies mentales de l’adulte. La première partie est consacrée à une revue de la littérature psychanalytique considérant les travaux portant sur l’anorexie mentale de l’adolescente et de l’adulte, les travaux consacrés aux anorexies du bébé et les travaux traitant des anorexies aux différents âges de la vie. La seconde partie présente les fondements épistémologiques de cette recherche. Elle ouvre une réflexion sur la recherche en psychologie clinique et sur ses liens avec la pratique et l’enseignement. Elle précise ma filiation théorique et praticienne. La troisième partie est consacrée à la méthodologie de la recherche clinique, et principalement aux spécificités de l’observation clinique psychanalytique. Elle présente la méthode E. Bick d’observation du bébé dans sa famille, ses apports à la recherche et à la pratique cliniques ainsi que l’adaptation réalisée auprès des patients souffrant d’anorexies. La quatrième partie propose une réflexion sur les enjeux psychiques de la « relation de nourrissage ». Cette relation est envisagée comme une relation commensale (W.R. Bion, 1962), paradigme de la rencontre intersubjective, de la croissance psychique de la subjectivité du bébé et de l’essor de la parentalité, mais aussi terrain privilégié de la transmission psychique inconsciente. La cinquième partie est consacrée à la mise en dialogue entre le bébé-dans-sa-famille et les aspects bébés du self de l’adulte dans les contextes d’anorexie. Les anorexies sont envisagées en terme de refus-impossibilité alimentaire témoignant d’une tentative d’organisation de modalités de survie psychique. Deux angoisses communes apparaissent au centre de la dynamique psychique : une angoisse catastrophique et une angoisse de persécution. L’angoisse catastrophique prend la forme d’une « chute sans fin désintégrante », signe d’une dépression primaire. Elle est surchargée par une angoisse de vampirisation-dévoration qui est notamment envisagée comme une forme d’objectalisation de l’angoisse de « chute sans fin désintégrante ». Les modalités de défenses adhésives ont pour fonction de lutter contre la chute sans fin désintégrante. Elles sont accompagnées d’une inhibition de la vie pulsionnelle —plus particulièrement de l’avidité secondaire— ainsi que de son clivage, son déni et sa projection. Le contact avec la vie émotionnelle du bébé réactive la dépression primaire contre laquelle les aspects bébés du self parental se sont organisés dans une économie de survie psychique. Le refus-impossibilité alimentaire du bébé apparaît en miroir d’un refus-impossibilité d’accueil et de mise en sens de la vie émotionnelle qui caractérise la parentalité anorexique. Le lien entre le bébé et la parentalité, mais aussi entre les aspects bébés du self et la parentalité interne, est caractérisé par une réflexivité opaque et persécutoire intériorisée par le bébé —et les aspects bébés du self— sous la forme d’un cercle pernicieux et involutif. Ce travail se conclut sur la proposition d’un gradient du lien de nourrissage structuré par deux pôles. Le plus intégré, celui de la relation de nourrissage, est caractérisé par une relation d’intimité entre le bébé et la parentalité et l’introjection d’une relation de réflexivité commensale, mutuelle et asymétrique, soutenant l’intégration pulsionnelle, le développement des bases d’un surmoi protecteur et la croissance psychique. Le second est défini comme un lien d’anourrissage, caractérisé par une relation d’ex-timité entre le bébé et la parentalité, l’intériorisation d’un réflexivité opaque et persécutoire sous la forme d’un cercle involutif entraînant la désintrication pulsionnelle et le développement d’un « surmoi sévère et destructeur du moi » (W.R. Bion, 1959). / This dissertation offers a modelisation of the psychological dynamics which are at work in the contexts of anorexia. Process is the cornerstone to the exploration of the ongoing psychodynamic that is at work with the anorexia of the baby-in-its-family and the anorexia nervosa of the adult. The first part reviews the existing psychoanalytical literature and considers the works dealing with the anorexia nervosa of the teenager and of the adult, then the works dedicated to the anorexias of the baby; last but not least, the works offering an approach that considers the anorexias at the different stages of life. The second part deals with the epistemological basis of this work. It explores the research in clinical psychology and the way it is linked to practice and teaching. It looks into the theoretical and practical filiation that operates in our approach to the mental life and to the care relationship. The third part is dedicated to the methodology of the clinical research – mainly the specificities of psychoanalytical observation. It presents E. Bick’s method of infant observation and how this method was adapted for the clinical work with anorexic patients. The fourth part ponders on what is psychologically at stake in the ‘feeding relation’. This relation is seen as commensal (W.R. Bion, 1962), the paradigm of the intersubjective encounter, of the psychological development of the baby’s subjectivity and the emerging parentality, but also the most favored ground of the unconscious psychological transmission. The fifth part creates a dialogue between the baby-in-its-family and the babies aspects of the adult self in the contexts of anorexia. Anorexias are considered in terms of food refusal-impossibility demonstrating an attempt to organise psychological survival. Two common anxieties are at the center of the psychological dynamic : a catastrophic anxiety and a persecution anxiety. The catastrophic anxiety appears as an « endless and disintegrative fall », a sign of a primary depression, which is overloaded with a vampirising and devouring anxiety. The persecution anxiety is also thought as a form of objectalisation of the anxiety of « endless and disintegrative fall ». The adhesive defenses, which are organised to fight against the « endless and disintegrative fall », are accompagnied by an inhibition of the instinctual drives —especially of secondary greed— as well as their splitting, denial and projection. The contact with the baby’s emotional life reactivates the primary depression against which the babies aspects of the parental self are organised in an economy of psychological survival. The food refusal-impossibility of the baby appears as a mirror to the refusal-impossibility to receive and give meaning to the emotionnal life that characterises anorexic parentality. The link between the baby and its parentality, but also between the babies aspects of the self and the internal parentality, presents an opaque and persecutory reflexivity that is interiorized by the baby and the babies aspects of the self, with the form of a pernicious and involutive circle. Finally, this dissertation concludes with the proposition of a range of the feeding relation that is structured by two poles. The first pole is the more integrated one : that of the feeding relation. It is marked by a relation of intimacy between the baby and its parentality and by the introjection of a commensal reflexivity which is both mutual and asymmetrical, and which sustains the integration of instinctual drives, the development of the bases of a protective superego and of the mental growth. The second pole, the un-linked one, is that of the relation of un-feeding characterized by a relation of ex-timity between the baby and its parentality, and the interiorization of a persecutory and opaque reflexivity in the form of a involutive circle leading to the desintegration of the drive and the development of an ego destructive superego (W.R.Bion, 1959).