Im Rahmen der RELAZA-Studie sollte die Wirksamkeit sowie die Sicherheit von AZA in der Verzögerung bzw. Vermeidung eines hämatologischen Rezidivs bei Patienten mit CD34+ MDS oder AML bei fallendem CD34-Spenderchimärismus nach allogener SZT untersucht werden. Als primäre Zielparameter galten hierbei die Ansprechrate im Sinne eines CD34-Spenderchimärismusanstiegs auf ≥ 80% (majores Ansprechen) etwa einen Monat nach Ende des 4. Zyklus AZA sowie die Dauer dieses Ansprechens. Ferner sollte der weitere Krankheitsverlauf, das Gesamt- und auch rezidivfreie Überleben sowie die Verträglichkeit und die Beeinflussung der GvHD untersucht werden. Dazu wurde der Anteil CD34+ Spenderzellen im peripheren Blut von insgesamt 53 Patienten im Abstand von drei bis vier Wochen und ab dem 9.-24. Monat nach allogener SZT alle sieben bis acht Wochen bestimmt. Die 20 Patienten, die während dieser Screeningphase einen CD34-Spenderzellabfall auf < 80% zeigten, aber gleichzeitig kein hämatologisches Rezidiv und transfusionsunabhängig > 3 Gpt/l Leukozyten sowie > 75 Gpt/l Thrombozyten aufwiesen, wurden in die Therapiegruppe aufgenommen. AZA wurde pro Zyklus unter entsprechender antiemetischer Prophylaxe in einer Dosis von 75 mg/m2/Tag über sieben aufeinanderfolgende Tage subkutan verabreicht. Der Abstand zwischen dem jeweiligen Beginn zweier Zyklen betrug circa 28 Tage. Es wurden zunächst nur vier Zyklen AZA in Folge appliziert. Einen Monat nach Ende des 4. Zyklus erfolgte die Bewertung des Ansprechens durch Zuordnung der einzelnen Patienten zu den Gruppen „majores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus ≥ 80%), „minores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus < 80%, aber kein Rezidiv) und „Rezidiv“. Um bei Patienten, die bis dahin nur ein minores Ansprechen erreicht hatten oder deren CD34-Spenderzellchimärismus wieder auf < 80% abgefallen war, ein (erneutes) majores Ansprechen zu induzieren, konnten im Anschluss an Block 1 (Zyklus 1-4) im Rahmen von Block 2 und 3 jeweils weitere vier Zyklen AZA gegeben werden. Vor jedem neuen Zyklus erfolgte die Kontrolle wesentlicher Laborparameter (großes Blutbild, ALAT, ASAT, GGT, Creatinin, Harnstoff, Natrium, Kalium, Bilirubin, CRP) sowie die Bewertung der GvHD. Nach dem 2. und 4. Zyklus jedes Blocks fanden eine erneute Knochenmarkpunktion sowie die Analyse des CD34-Spenderchimärismus statt. Der CD34-Spenderchimärismus der 20 Patienten der Therapiegruppe war im Median 169 Tage nach der letzten SZT auf < 80% abgefallen, sodass die Therapie mit AZA bei diesen Patienten begonnen wurde. Nach nur vier Zyklen AZA konnte bei 16 von 20 (80%) Patienten eine Stabilisierung oder Verminderung der MRD festgestellt werden. Insgesamt zeigten zehn der 20 (50%) Patienten ein majores Ansprechen. Dieses war zum Studienabschluss im Januar 2011 allerdings nur noch bei drei Patienten (medianes follow up von 300 Tagen (Spannweite 181–899 Tage) nach Ende des 1. Blocks) nachweisbar. Sechs (30%) Patienten zeigten nach dem 4. Zyklus ein minores Ansprechen und vier (20%) waren bereits im Rezidiv. Von den 16 Patienten, die entweder ein majores oder minores Ansprechen zeigten, begannen 11 Patienten mit dem zweiten und vier auch noch mit dem dritten Block. Durch diese Wiederbehandlung mit AZA konnte allerdings nur bei einer Patientin ein (erneutes) majores Ansprechen erreicht werden, welches jedoch nur etwa einen Monat anhielt. Zusammenfassend betrachtet haben bis zum Studienabschluss 13 von 20 (65%) Therapiepatienten rezidiviert. Das rezidivfreie Überleben dieser Patienten betrug im Median 231 Tage (Spannweite 56–558 Tage), das Gesamtüberleben lag bei im Median 470 Tagen (Spannweite 182-1440 Tage) nach dem initialen Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%. Neun von ihnen sind im Median 293 Tage (Spannweite 182 – 1159 Tage) nach CD34-Spenderchimärismusabfall verstorben. Vier der 20 Patienten haben bis zum Abschluss der Studie, das heißt im Median 347 Tage (Spannweite 297 – 998 Tage) nach dem ersten Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%, rezidivfrei überlebt. Drei von ihnen zeigten zum Studienabschluss ein bis dahin im Median seit 300 Tagen (Spannweite 181 – 899 Tage) nach Therapieende bestehendes stabiles majores Ansprechen. Die restlichen drei der 20 Therapiepatienten sind nicht Rezidiv-assoziiert verstorben. Das Gesamtüberleben aller Therapiepatienten lag bei im Median 347 Tagen (Spannweite 162–1440 Tage) nach Abfall der CD34+ Zellen unter die 80% Grenze. Die Hauptnebenwirkung von AZA bestand in der Induktion schwerer Zytopenien, die bei sechs von 20 Patienten zu Infektionen führten. Diese konnten jedoch entweder ambulant oder stationär gut beherrscht werden, sodass sie weder zum Abbruch der Studie noch zum Tod eines Patienten führten. Ansonsten konnte durch Dosisanpassungen, Zyklusverschiebungen sowie durch die Gabe von Wachstumsfaktoren (G-CSF) eine Regeneration des Blutbilds erreicht werden. Gravierende Verschlechterungen bestehender GvHD wurden nicht beobachtet. Hingegen konnte die immunsuppressive Medikation unter den ersten vier Zyklen AZA bei vier von sechs Patienten beendet werden. Die RELAZA-Studie hat gezeigt, dass AZA unter akzeptablen Nebenwirkungen in der Lage ist, das Auftreten eines hämatologischen Rezidivs bei Abfall des CD34-Spenderzellchimärimus nach allogener SZT zumindest zu verzögern. Allerdings mussten wir feststellen, dass nur die Hälfte der Patienten ein majores Ansprechen zeigte und dieses bei den meisten Patienten nur von kurzer Dauer war. Deshalb gehen wir davon aus, dass sowohl zur Induktion eines majoren Ansprechens als auch zum Erhalt desselben vier Zyklen AZA in Folge nicht ausreichend sind. Der Effekt eines dahingehend veränderten Applikationsschemas wird bereits im Rahmen der RELAZA-II-Studie untersucht.

Im Rahmen der RELAZA-Studie sollte die Wirksamkeit sowie die Sicherheit von AZA in der Verzögerung bzw. Vermeidung eines hämatologischen Rezidivs bei Patienten mit CD34+ MDS oder AML bei fallendem CD34-Spenderchimärismus nach allogener SZT untersucht werden. Als primäre Zielparameter galten hierbei die Ansprechrate im Sinne eines CD34-Spenderchimärismusanstiegs auf ≥ 80% (majores Ansprechen) etwa einen Monat nach Ende des 4. Zyklus AZA sowie die Dauer dieses Ansprechens. Ferner sollte der weitere Krankheitsverlauf, das Gesamt- und auch rezidivfreie Überleben sowie die Verträglichkeit und die Beeinflussung der GvHD untersucht werden. Dazu wurde der Anteil CD34+ Spenderzellen im peripheren Blut von insgesamt 53 Patienten im Abstand von drei bis vier Wochen und ab dem 9.-24. Monat nach allogener SZT alle sieben bis acht Wochen bestimmt. Die 20 Patienten, die während dieser Screeningphase einen CD34-Spenderzellabfall auf < 80% zeigten, aber gleichzeitig kein hämatologisches Rezidiv und transfusionsunabhängig > 3 Gpt/l Leukozyten sowie > 75 Gpt/l Thrombozyten aufwiesen, wurden in die Therapiegruppe aufgenommen. AZA wurde pro Zyklus unter entsprechender antiemetischer Prophylaxe in einer Dosis von 75 mg/m2/Tag über sieben aufeinanderfolgende Tage subkutan verabreicht. Der Abstand zwischen dem jeweiligen Beginn zweier Zyklen betrug circa 28 Tage. Es wurden zunächst nur vier Zyklen AZA in Folge appliziert. Einen Monat nach Ende des 4. Zyklus erfolgte die Bewertung des Ansprechens durch Zuordnung der einzelnen Patienten zu den Gruppen „majores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus ≥ 80%), „minores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus < 80%, aber kein Rezidiv) und „Rezidiv“. Um bei Patienten, die bis dahin nur ein minores Ansprechen erreicht hatten oder deren CD34-Spenderzellchimärismus wieder auf < 80% abgefallen war, ein (erneutes) majores Ansprechen zu induzieren, konnten im Anschluss an Block 1 (Zyklus 1-4) im Rahmen von Block 2 und 3 jeweils weitere vier Zyklen AZA gegeben werden. Vor jedem neuen Zyklus erfolgte die Kontrolle wesentlicher Laborparameter (großes Blutbild, ALAT, ASAT, GGT, Creatinin, Harnstoff, Natrium, Kalium, Bilirubin, CRP) sowie die Bewertung der GvHD. Nach dem 2. und 4. Zyklus jedes Blocks fanden eine erneute Knochenmarkpunktion sowie die Analyse des CD34-Spenderchimärismus statt. Der CD34-Spenderchimärismus der 20 Patienten der Therapiegruppe war im Median 169 Tage nach der letzten SZT auf < 80% abgefallen, sodass die Therapie mit AZA bei diesen Patienten begonnen wurde. Nach nur vier Zyklen AZA konnte bei 16 von 20 (80%) Patienten eine Stabilisierung oder Verminderung der MRD festgestellt werden. Insgesamt zeigten zehn der 20 (50%) Patienten ein majores Ansprechen. Dieses war zum Studienabschluss im Januar 2011 allerdings nur noch bei drei Patienten (medianes follow up von 300 Tagen (Spannweite 181–899 Tage) nach Ende des 1. Blocks) nachweisbar. Sechs (30%) Patienten zeigten nach dem 4. Zyklus ein minores Ansprechen und vier (20%) waren bereits im Rezidiv. Von den 16 Patienten, die entweder ein majores oder minores Ansprechen zeigten, begannen 11 Patienten mit dem zweiten und vier auch noch mit dem dritten Block. Durch diese Wiederbehandlung mit AZA konnte allerdings nur bei einer Patientin ein (erneutes) majores Ansprechen erreicht werden, welches jedoch nur etwa einen Monat anhielt. Zusammenfassend betrachtet haben bis zum Studienabschluss 13 von 20 (65%) Therapiepatienten rezidiviert. Das rezidivfreie Überleben dieser Patienten betrug im Median 231 Tage (Spannweite 56–558 Tage), das Gesamtüberleben lag bei im Median 470 Tagen (Spannweite 182-1440 Tage) nach dem initialen Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%. Neun von ihnen sind im Median 293 Tage (Spannweite 182 – 1159 Tage) nach CD34-Spenderchimärismusabfall verstorben. Vier der 20 Patienten haben bis zum Abschluss der Studie, das heißt im Median 347 Tage (Spannweite 297 – 998 Tage) nach dem ersten Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%, rezidivfrei überlebt. Drei von ihnen zeigten zum Studienabschluss ein bis dahin im Median seit 300 Tagen (Spannweite 181 – 899 Tage) nach Therapieende bestehendes stabiles majores Ansprechen. Die restlichen drei der 20 Therapiepatienten sind nicht Rezidiv-assoziiert verstorben. Das Gesamtüberleben aller Therapiepatienten lag bei im Median 347 Tagen (Spannweite 162–1440 Tage) nach Abfall der CD34+ Zellen unter die 80% Grenze. Die Hauptnebenwirkung von AZA bestand in der Induktion schwerer Zytopenien, die bei sechs von 20 Patienten zu Infektionen führten. Diese konnten jedoch entweder ambulant oder stationär gut beherrscht werden, sodass sie weder zum Abbruch der Studie noch zum Tod eines Patienten führten. Ansonsten konnte durch Dosisanpassungen, Zyklusverschiebungen sowie durch die Gabe von Wachstumsfaktoren (G-CSF) eine Regeneration des Blutbilds erreicht werden. Gravierende Verschlechterungen bestehender GvHD wurden nicht beobachtet. Hingegen konnte die immunsuppressive Medikation unter den ersten vier Zyklen AZA bei vier von sechs Patienten beendet werden. Die RELAZA-Studie hat gezeigt, dass AZA unter akzeptablen Nebenwirkungen in der Lage ist, das Auftreten eines hämatologischen Rezidivs bei Abfall des CD34-Spenderzellchimärimus nach allogener SZT zumindest zu verzögern. Allerdings mussten wir feststellen, dass nur die Hälfte der Patienten ein majores Ansprechen zeigte und dieses bei den meisten Patienten nur von kurzer Dauer war. Deshalb gehen wir davon aus, dass sowohl zur Induktion eines majoren Ansprechens als auch zum Erhalt desselben vier Zyklen AZA in Folge nicht ausreichend sind. Der Effekt eines dahingehend veränderten Applikationsschemas wird bereits im Rahmen der RELAZA-II-Studie untersucht.

Knowledge of the processes of RNA interference, the regulation of gene expression by small RNAs (sRNAs), has grown at an unprecedented rate over the last 30 years. Some of the findings were literally revolutionary, as they revealed events that overturned many long-held notions. Many phenomena have been shown to be highly conserved and common to organisms of different species, but others are specific to certain lineages or have not yet been fully explored. There is also a lack of knowledge about the interconnection of numerous pathways - for example between silencing at the transcriptional (TGS, leading to the promoter methylation) and post-transcriptional levels (PTGS, affecting mRNA stability or translation). The present work summarizes the findings of two published and two unpublished works and attempts to describe some of the less known sites of RNA interference using various plant model organisms. Research on Solanum tuberosum transgenic lines has revealed the ability of 5-azacytidine to restore the expression of transcriptionally silenced transgenes at the whole plant level. De novo regeneration from leaves of such plants can lead to re-silencing of reactivated transgenes and thus serves as a selection method to exclude lines prone to spontaneous silencing. The nature of changes in the...

The myelodysplastic syndrome (MDS) is a group of hematopoietic clonal disorders resulting in the inefficient production of myeloid lineage blood cells, with the prevalence of patients older than 65 years. One of the possible treatment options for MDS is 5- azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine therapy. These compounds have been shown to cause the induction of cell-cycle arrest, cell differentiation and/or apoptosis. The in vitro experiments with 5-aza-2'-deoxycytidine indicated that this compound causes the premature cellular senescence, a state of the irreversible cell-cycle arrest. We have asked, whether 5-azacytidine, as a molecule with similar structure, is capable of causing the same effect. This treatment strategy could be beneficial in case that the negative pro- inflammatory effect of senescent cells on their surroundings can be nullified. In this thesis we have shown that 5-azacytidine induces DNA damage response, which is described as a fundamental event for the onset of the cell senescence. We tested 5- azacytidine treated HeLa cells for several markers of the cell senescence - the increase of the β-galactosidase activity, the PML and PML nuclear bodies and the formation of persistent DNA damage signaling lesions - albeit all these markers were positive, it was the very low increase in...

CCCTC-binding factor (CTCF) can both activate as well as inhibit transcription by forming chromatin loops between regulatory regions and promoters. In this regard, Ctcf binding on the non-methylated DNA and its interaction with the Cohesin complex results in differential regulation of the H19/Igf2 locus. Similarly, a role for CTCF has been established in normal hematopoietic development; however its involvement, despite mutations in CTCF and Cohesin complex were identified in leukemia, remains elusive. CTCF regulates transcription dependently on DNA methylation status and can if bound block interactions of enhancers and promoters. Here, we show that in hematopietic cells CTCF binds to the imprinting control region of H19/Igf2 and found that chromatin remodeller Smarca5, which also associates with the Cohesin complex, facilitates Ctcf binding and regulatory effects. Furthermore, Smarca5 supports CTCF functionally and is needed for enhancer-blocking effect at imprinting control region. We identified new CTCF-recognized locus near hematopoietic regulator SPI1 (PU.1) in normally differentiating myeloid cells together with members of the Cohesin complex. Due to DNA methylation, CTCF binding to the SPI1 gene is reduced in AML blasts and this effect was reversible by DNA methylation inhibitor 5-azacitidine.

Hematopoiesis is a highly orchestrated process, in which a single hematopoietic stem cell (HSC) gives a rise to all blood cellular components. For myeloid and lymphoid development precise controlled expression of the PU.1 transcription factor is needed. Deletion of PU.1 gene in mouse is lethal and its dysregulation during hematopoietic differentiation is associated with blood malignancies including acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic syndromes (MDS). MDS and AML are serious blood disorders characterized by expansion of immature blood cells and lack of differentiated functional cells. Not only genetic but also epigenetic aberrations represent a very important field for studying pathophysiology of leukemia genesis and dysregulation of the PU.1 gene represents intensively studied candidate mechanism. Modern therapy of selected MDS and subset of AML patients is based on treatment with DNA hypomethylating agent Azacytidine (AZA) interfering in PU.1 gene regulatory mechanism. However, poor response or resistance to this therapy often occurs. In this thesis we present data obtained from AZA-resistant clones of MDS/AML cell line OCI-M2. We analysed DNA methylation and DNA hydroxymethylation at the key regulatory element of the PU.1 gene (URE). We found that these epigenetic modifications at URE...

The MHC class I status of tumour cells during immunotherapy is often underestimated. It represents one of important tumour escape mechanisms and thus can contribute to the failure of most of the cancer clinical trials that are usually based on the induction of cytotoxic T cell responses. Epigenetic changes in the promoters of genes involved in the MHC class I Ag presentation can result in decreased expression of the cell surface MHC molecules on tumour cells. Thus, epigenetic modifiers can restore an expression of the MHC class I molecules and make tumours visible to the CD8+ effector cells. Besides the epigenetic changes on the tumour cells, epigenetic modulators affect cells of the immune system such as dendritic cells (DC). Tumour cells can escape from the immune response not only by changes in the cancer cells, but also by influencing, expanding and/or activating immunoregulatory cell populations, such as regulatory T cells (Treg). This thesis focuses on the potential of the DC-based vaccines against HPV-16-associated tumours with a different MHC class I expression, on the combination of cancer immunotherapy with the treatment using epigenetic modifiers, with special attention paid to their effects on DC, and, finally, on the impacts of the anti-CD25 antibody (used for Treg elimination) on Treg and NKT...