Les bactériophages neutralisent les systèmes de défense et détournent les fonctions vitales de leur hôte pour favoriser leur multiplication. Les gènes de phages qui gouvernent cette prise de contrôle de l’hôte restent mal connus, pourtant leur caractérisation présente un intérêt majeur pour mettre à jour des fonctions bactériennes spécifiquement ciblées par les phages et pour concevoir de nouveaux agents antibactériens.Le phage T5 injecte son ADN dans la bactérie Escherichia coli en deux étapes. Seuls les gènes précoces codés par 8% du génome entrent dans la cellule et le transfert s’arrête. Leur expression induit la dégradation du chromosome de l’hôte et l’inactivation de ses systèmes de restriction et de réparation de l’ADN. Après quelques minutes, le reste de la molécule d’ADN est injecté, ce qui permet la production de nouveaux phages. Deux gènes précoces A1 et A2 ont été identifiés comme essentiels pour la reprise du transfert de l’ADN et A1 est également nécessaire pour induire la dégradation de l’ADN de l’hôte. A1 et A2 sont les deux seuls gènes connus pour être impliqués dans la régulation de ce système original d’infection, mais leur fonction n’a jamais été identifiée.Ma thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle et structurale des protéines A1 et A2. J’ai purifié A1 et démontré in vitro qu’elle avait une activité DNase dépendante du manganèse. Sa structure atomique a été résolue par cryomicroscopie électronique à 3.01 Å de résolution, montrant une organisation octamérique de symétrie D4 inédite pour une DNase. Chaque monomère (61kDa) contient un domaine exonuclease dont le site actif lie deux ions Mn2+ et qui s’apparente au site catalytique des domaines exonucléases de la DNA polymerase II et des DNAses associées aux systèmes de recombinaison homologue et de réparation de l’ADN comme Mre11. En construisant différents mutants de A1, j’ai identifié certains acides aminés essentiels pour l’activité catalytique et, par des expériences de complémentation fonctionnelle, j’ai montré que cette activité était indispensable pour l’infection. L’ensemble de ces résultats suggèrent que A1 est la DNase, jusqu’ici inconnue, responsable de la dégradation massive du génome de l’hôte au tout début de l’infection. Enfin, j’ai observé que la production de A1 pendant l’infection induit une forte activité recombinase. De nombreux autres bactériophages qui n’appartiennent pas à la famille des T5virus produisent également une protéine similaire à A1 dont la fonction n’a jamais été identifiée. Ce travail est un premier pas vers la compréhension de son rôle dans le mécanisme général d‘infection par les phages. Une deuxième partie de cette thèse porte sur la caractérisation structurale de A2. Des recherches de similarité indiquent la présence d’un domaine Helix-Turn-Helix typique des régulateurs transcriptionnels. J’ai purifié A2 et montré que cette protéine de 14 kDa est un dimère en solution. La caractérisation des propriétés biochimiques de A2 a permis de débuter l’étude de sa structure par RMN.Les résultats de ma thèse ont révélé la structure originale d’une DNase de bactériophage qui contrôle la dégradation du génome bactérien et la régulation du transport de l’ADN viral au début du cycle infectieux. Ces résultats soulèvent des questions intrigantes : comment l’ADN de T5 est-il protégé de l’activité DNase de A1 ? Comment A1 et A2 interagissent-elles lors des étapes de prise de contrôle de l’hôte ? / Bacteriophages defeat bacterial defences and hijack host cell machineries to establish a favourable environment for their multiplication. Early-expressed viral genes that govern host takeover are highly diverse from one phage to another and most of them have no assigned function. They thus represent a pool of novel genes whose products potentially subvert bacterial cell vital functions and could help in designing new antibacterial strategies.T5 phage uses a unique 2-step mechanism to deliver its DNA into its host Escherichia coli. At the onset of the infection, only 8 % of the genome enter the cell before the transfer temporarily stops. Expression of the genes encoded by this DNA portion leads to host chromosome degradation and inactivation of host restriction and DNA mending systems. After a few minutes, T5 DNA transfer resumes, allowing further phage multiplication. A1 and A2 are early genes required for DNA transfer completion and A1 is also necessary to trigger host DNA degradation. A1 and A2 are the only two genes known to be involved in the regulation of this original infection system, but their function yet remains to be characterized.The objectives of this work were to characterize the function and structure of A1 and A2 proteins. I have purified the A1 protein and shown that it has a manganese-dependent DNase activity in vitro. Cryo Electron Microscopy at 3.01 Å resolution unravelled its structure, showing an octameric organization with a D4 symmetry, which is unprecedented for a DNase. Each monomer (61 kDa) carries an exonuclease domain harbouring an active site with two Mn2+ ions. This site is similar to those from the exonuclease domain of the DNA polymerase II and from DNases involved in DNA mending and recombination events like Mre11. I identified essential catalytic residues for the DNase activity and demonstrated that this activity is crucial for infection by engineering A1 mutant proteins and by doing functional complementation assays. Taken together, my results suggest that A1 could then be the elusive DNase responsible for the massive host genome degradation observed during T5 phage infection. Eventually, I uncovered a recombinase activity associated to A1 production during infection. Similar proteins to A1 with unknown functions are produced in several other bacteriophages outside of the T5virus family. This work is a first step towards understanding the role of this protein in the general mechanism of infection by bacteriophages. In a second part, I worked on the structural characterisation of A2 protein. Similarity searches revealed a helix-turn-helix domain typically found in transcriptional regulators. I purified and demonstrated the dimeric organisation of this 14-kDa protein in solution. This initial characterization of A2 has opened avenues for further NMR studies.During my Ph.D., I uncovered the structure of an original bacteriophage DNase that controls bacterial genome degradation and that regulates viral DNA transport at the beginning of the infectious cycle. These results open the intriguing question about the mechanism for T5 DNA protection from A1 DNase activity as well as about the interplay between A1 and A2 during the host takeover.

Ce travail porte sur l'étude expérimentale de deux mécanismes de translocations d'acides nucléiques au travers d'une membrane lipidique : la translocation, forcée électrophorétiquement, d'oligomères au travers d'un pore d'alpha-hémolysine et la translocation passive d'un ADN génomique hors de la capside du bactériophage T5. La première partie de la thèse porte sur l'ouverture de molécules d'ADN double brin à travers le nanopore d'alpha hémolysine. Les temps de passage individuels de molécules d'ADN à travers le pore sont mesurés expérimentalement en fonction de la séquence, de la longueur et de la force appliquée sur l'ADN. Les distributions obtenues sont confrontées à un modèle décrivant le passage de l'ADN par la diffusion d'une fourche d'ouverture dans un paysage énergétique unidimensionnel, déterminé par la séquence de la molécule. La deuxième partie porte sur un système in vitro reconstituant les étapes initiales d'infection du bactériophage T5. L'interaction de T5 avec son récepteur membranaire FhuA purifié en détergent, génère une séquence d'événements qui conduit à l'éjection du génome viral hors de la capside : (i) fixation du récepteur ; (ii) activation conduisant à l'ouverture d'un canal d'ADN ; (iii) éjection de l'ADN. La dynamique des trois étapes est mesurée à l'aide d'expériences en population et en virus unique. La dernière étape est comparée à un modèle physique qui révèle une dynamique fortement hors d'équilibre à l'initiation de l'éjection. Enfin, FhuA est reconstitué dans des vésicules lipidiques géantes afin de suivre l'éjection par microscopie de fluorescence et par électrophysiologie à travers une membrane lipidique.

Le travail décrit dans cette thèse a été mené à l'interface entre trois disciplines: l'électrochimie, la science des matériaux et la microbiologie. L'objectif de cette recherche était tout d'abord d'étudier l'activité de bactéries immobilisées dans un film de silice déposé par le procédé sol-gel à la surface d'électrodes. Les applications potentielles de ce travail fondamental sont les biocapteurs, les bioréacteurs ou biopiles. L'encapsulation bactérienne assistée par électrochimie a été développée en utilisant l'électrolyse du sol de départ pour immobiliser la bactérie Escherichia Coli dans une couche mince sol-gel hybride. La combinaison de précurseurs de silice, de chitosan, de poly(ehtylène glycol) et de tréhalose permet de préserver l'intégrité membranaire et l'activité métabolique. L'électrochimie a ensuite été utilisée comme moyen analytique. Shewanella putrefaciens et Pseudomonas fluorescens ont été encapsulées dans un film à base de silice et les réactions de transfert d'électron de la bactérie à différent médiateurs rédox ont été analysées. Des nanotubes de carbone fonctionnalisés par des espèces ferrocène et la protéine rédox cytochrome c ont été utilisés pour faciliter ce transfert électronique au sein de cette matrice de silice isolante, permettant l'obtention d'un biofilm artificiel. Ces deux types de médiateurs, chimique ou biologique, ont conduit à des sensibilités différentes de la bioélectrode à l'ajout du substrat pourvoyeur d'électron en raison des mécanismes différents impliqués pour transférer ces électrons. L'immobilisation de protéines rédox membranaires a également été considérée dans ces couches minces inorganiques pour favoriser la stabilité de la réponse électrocatalytique. Les protéines considérées impliquent des mécanismes de transfert électronique différents, soit direct pour le cytochrome P450 (CYP1A2), soit médié pour la mandélate déshydrogénase. Finalement, l'influence de l'encapsulation dans une matrice sol-gel hybride sur l'infectivité du bactériophage [phi]X174 a été étudiée, montrant l'effet protecteur de la polyéthylènenimine ou du glycérol / The work reported in this thesis has been developed at the interface between three disciplines, i.e., electrochemistry, material science and microbiology. The purpose of this research was first to study the activity of bacteria immobilized in silica-based films prepared by the sol-gel process on electrode surfaces. Potential applications concern biosensors, bioreactors and biofuel cells. Electrochemically assisted bacterial encapsulation has been developed, using sol electrolysis to immobilize Escherichia coli in a hybrid sol-gel layer. The combination of silica precursors, chitosan, poly(ethylene glycol) and trehalose allowed preservation of cell membrane integrity and metabolic activity. Electrochemistry was then considered as an analytical method. Shewanella putrefaciens and Pseudomonas fluorescens have been encapsulated in silica-based films and the electron transfer reactions from bacteria to different redox mediators have been monitored. Single-walled carbon nanotubes functionalized with ferrocene moieties and bovine heart cytochrome c have been considered as redox shuttles to facilitate the electron transfer in the non-conducting silica matrix, leading to the elaboration of artificial biofilms. Interestingly, these two classes of mediator, i.e. chemical and biological, led to different substrate sensitivity because of their different mechanism of interaction with the bacteria. Immobilization of membrane associated redox proteins in sol-gel films have been then considered and applied for electrocatalysis. Direct and mediated electrochemical communication has been investigated between the electrode surface and cytochrome P450 (CYP1A2) or mandelate dehydrogenase, respectively, showing the interest of sol-gel to stabilize the bioelectrocatalytic reaction. Finally, the influence of encapsulation in a hybrid sol-gel matrix on the infectivity of bacteriophage [phi]X174 has been studied and the protective effect of polyethyleneimine or glycerol was shown