Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

Le microbiote intestinal comprend l’ensemble des micro-organismes présents dans le tractus digestif. Cette flore et sa variabilité est unique et spécifique à chaque individu. L’équilibre microbien, état critique pour la santé, se développe progressivement à partir de la naissance. En complément de la fonction connue du microbiote dans la digestion, son rôle est maintenant avéré comme central dans le métabolisme humain. Dans cet écosystème complexe dans lequel cohabitent et interagissent 10¹³ bactéries, les Bacteroides, genre majoritaire au sein du microbiote, prennent en charge les fibres non digestibles de l’alimentation. Ces bactéries, anaérobies à Gram négatif, sont particulièrement bien adaptées à l’environnement intestinal tout particulièrement dans le domaine de la prise en charge des polysaccharides complexes et celui de la résistance à l’oxygène. Etonnamment, bien que l’hème soit un métabolite requis pour la croissance des Bacteroides, ces bactéries sont incapables de le synthétiser. L’hème, constitué d’un atome de fer fixé sur une porphyrie, est un cofacteur impliqué dans de nombreuses réactions enzymatiques essentielles au métabolisme central. Sa réactivité biochimique le rend responsable d’une induction de phénomènes inflammatoire de l’intestin. Nous avons étudié les interactions entre la bactérie Bacteroides thetaiotaomicron et l’hème environnemental. Nous avons d’abord développé un test permettant la détection de quantités d’hème de l’ordre du nanogramme dans des milieux complexes tels que le contenu intestinal. Nous avons ensuite montré que la bactérie commensale E. coli n’est pas la principale source d’hème lors de la colonisation du tractus digestif par Bacteroides dans un modèle de souris axénique et que l’hôte rempli ce rôle. Nous avons mis en place un système permettant de moduler la quantité d’hème présente dans le tractus digestif en piégeant la molécule sur l’hémophore HasA de Serratia marcescens. Nous avons confirmé que le système HasA était actif in vitro. Les résultats préliminaires montrent que d’une part il réduit la quantité d’hème intestinal disponible et d’autre part cela entraine un retard lors de la colonisation du tractus digestif par Bacteroides. Ce travail fournit des outils permettant de mieux comprendre les facteurs influant sur l’implantation des Bacteroides et souligne l’importance de l’hème dans le processus crucial de la primo-colonisation. Mais cela autorise également à plus long terme d’envisager l’utilisation de ce système pour diminuer la quantité d’hème disponible dans l’intestin et donc son effet pro-inflammatoire, dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. / The intestinal microbiota comprises the numerous microorganisms colonizing the digestive tract. This flora, and the variations it undergoes are unique and specific to each individual. The microbial balance, which is a determinant of our state of health, develops gradually from birth. In addition to the known roles of the microbiote in digestion, it is now recognized as an important contributor to human metabolism. Among the 10¹³ bacteria inhabiting the human gut, the genus Bacteroides comprises the dominant genus, and is needed to digest complex dietary polysaccharide fibers. This feature, and the resistance to trace oxygen of these Gram-negative anaerobes make them particularly well adapted to the intestinal environment. Remarkably, although heme is a required metabolite for Bacteroides growth, these bacteria are incapable of heme synthesis. Heme, which comprises an iron atom trapped within a porphyrin ring, is a cofactor involved in numerous enzymatic reactions essential to central metabolism. Its bioactivity may also provoke intestinal inflammatory phenomena. We investigated the interactions between the bacterium Bacteroides thetaiotaomicron and environmental heme. We first developed a test to detect nanogram amounts of heme in complex media such as intestinal contents. We then showed that the commensal bacterium Escherichia coli donates heme to B. thetaiotaomicron in vitro. Nevertheless, we found that E. coli is not the major heme source for Bacteroides colonization, as tested in a germfree mouse model. This study led us to conclude that the host must be the major heme donor. We then set up a system to modulate heme availability in the digestive tract by capturing free heme on a hemophore HasA, from Serratia marcescens. We confirmed the HasA system was active in vitro. Preliminary experiments indicate that it 1- reduces levels of intestinal heme, and 2- delays B. thetaiotaomicron colonization. The present work provides tools for better understanding the factors needed for Bacteroides implantation in the gut and underlines the importance of heme in this crucial process of primocolonization. In the longer term, the bacterial heme-capture system may be considered as a means of decreasing free intestinal pools of heme and thereby its pro-inflammatory effect, in chronic inflammatory bowel diseases.

B. fragilis wird mit klinischen Bildern mit wie Abdominal- und Weichgewebs-Infektionen sowie Sepsis-Geschehen assoziiert, weitere Krankheitsbilder sind noch in der Erforschung. In der Vergangenheit gaben Virulenzfaktoren wie die komplexe Kohlehydrat-Kapsel, das Endotoxin sowie die Produktion von Katalase und Hämagglutinin nur eine unzureichende Erklärung für die Entstehung schwerer Infektionen, die der Keim auch als Einzelerreger verursachte. In den 1980er Jahren wurden Enterotoxigene B. fragilis Stämme als Erreger akuter Diarrhoe bei Kindern festgestellt; nachfolgend wurden Stämme mit diesem Virulenzfaktor in den unterschiedlichsten Infektions-geschehen nachgewiesen. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Enterotoxin-Bildung von Bacteroides fragilis Stämmen eine Rolle bei der Pathogenese von systemischen Infektionen sowie möglicherweise bei der Entstehung von Darmkrebs spielt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde/n 1. Eine umfangreiche Stammsammlung von 271 Bacteroides fragilis Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft aus den USA (Stammsammlungen) und aus Deutschland sowie verschiedener klinischer Herkunft (insbesondere n=70 Blutkulturisolate) zusammengestellt. 2. Die Überprüfung der Spezies-Identifizierung mittels phänotypischer Reaktionen (Koloniemorphologie, biochemische Methoden) sowie nachfolgender molekularer Tests (PCR-Fingerprinting) führte zum Ausschluss eines Isolates. 3. Mit molekularen Methoden die PCR-Gruppen I und II charakterisiert, wobei die meisten Stämme der Gruppe I angehörten. 4. Der molekulare Nachweis von Enterotoxin-Genabschnitten mit Rückschluss auf das Vorhandensein der BfPAI bei 32 von 260 Stämmen (12.3%) geführt. Diese Stämme waren immer Teil der PCR Gruppe I. Die 260 untersuchten Stämme konnten in Pattern I, II oder III eingeteilt werden. 5. Blutkultur-Stämme und Stämme aus anderen Quellen (Nicht-Blutkulturen) verglichen. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Vorkommens von ETBF sowie NTBF Pattern III dargestellt werden. 6. In den US-amerikanischen Stämmen prozentual mehr ETBF und Gruppe II Stämme als in deutschen Isolaten nachgewiesen. 7. Beim Vergleich der Sequenzen die BfPAI flankierender Elemente sechs ausgewählter Stämme, einschließlich der Referenzstämme (ATCC 25285, NTBF Pattern II; ATCC 43859, ETBF Pattern I) verschiedene Punktmutationen gefunden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 1 Einleitung 4 1.1 Historische Beschreibung des Genus Bacteroides mit der Typ-Spezies Bacteroides fragilis 4 1.1.1 Phänotypische Charakteristika des Genus Bacteroides 4 1.1.2 Molekulare Charakteristika und Taxonomie 5 1.1.3 Die Spezies Bacteroides fragilis 8 1.1.4 Antibiotika-Resistenzen bei der Spezies Bacteroides fragilis 9 1.1.5 Bacteroides fragilis: Zwei DNA-Homologie-Gruppen / zwei PCR Fingerprint-Gruppen 10 1.1.6 Natürliche Habitate obligater Anaerobier 11 1.1.7 Klinische Bedeutung der Spezies Bacteroides fragilis 11 1.2 Enterotoxin positive Bacteroides fragilis 13 1.2.1 Bacteroides fragilis Enterotoxin (BFT) - Fragilysin 14 1.2.2 Bacteroides fragilis Pathogenitätsinsel (BfPAI) 15 1.3 Weitere Krankheitsbilder 19 1.3.1 Infektionen/Sepsis 19 1.3.2 Chronisch-entzündliche Darmerkrankung und kolorektale Tumorbildung 20 2 Aufgabenstellung 21 3 Material und Methoden 22 3.1 Stämme 22 3.1.1 Referenzstämme 22 3.1.2 Auswahl der Klinischen Stämme 22 3.1.2.1 Vergleichsstämme der Spezies Bacteroides vulgatus und ovatus 23 3.1.2.2 Blutkulturen – Invasive Stämme 23 3.1.2.3 Nicht-Blutkulturen – Nicht-invasive Stämme 23 3.2 Kulturtechnik 24 3.2.1 Nährmedien 24 3.2.1.1 Columbia-Blut-Agar 24 3.2.2 Inkubation der anaeroben Kulturen 25 3.3 Gruppendifferenzierung der Isolate 25 3.3.1 Koloniemorphologie 25 3.3.2 Zellmorphologie - Gramfärbung 25 3.3.3 Differenzierung mittels Blättchentest 26 3.3.4 Biochemische Leistungsprüfung 26 3.4 Molekularbiologische Analysen 26 3.4.1 DNA-Extraktion 26 3.4.2 PCR-Reaktionsansätze 28 3.4.2.1 Optimierung der PCR-Ansätze nach Taguchi 29 3.4.3 PCR-Bedingungen 29 3.4.4 PCR-Fingerprint-Technik 30 3.4.4.1 Primer 30 3.4.4.2 PCR-Protokoll für T3B 31 3.4.4.3 Cycler-Profil 31 3.4.5 Spezifische PCR zum Nachweis von Teilen der BfPAI 32 3.4.5.1 Primer 32 3.4.5.2 PCR-Protokolle 32 3.4.5.3 Cycler-Profile 34 3.4.6 Agarose-Gel-Elektrophorese 35 3.4.7 Auswertung der Ergebnisse 36 3.5 Sequenzierung von DNA-Fragmenten 36 4 Ergebnisse 39 4.1 Identifizierung mittels phänotypischer Eigenschaften der Spezies Bacteroides fragilis Zell- und Koloniemorphologie 39 4.2 Biochemische Identifizierung 41 4.3 Molekulare Untersuchungen 42 4.3.1 Bestätigung der Spezies-Identifizierung mittels der PCR-Fingerprint-Technik 42 4.3.2 Unterteilung der Spezies in zwei PCR-Fingerprint-Gruppen 42 4.4 Nachweis von Enterotoxin und der BfPAI 44 4.4.1 Ergebnisse der PCR-Optimierung nach Cobb BD & Clarkson JM, 1994 44 4.4.2 Nachweis von Enterotoxin codierenden–Genabschnitten als Teile der BfPAI mittels dreier Primerpaare 45 4.4.3 PCR-Analyse der Schnittstellen der BfPAI unter Verwendung von zwei Primerpaaren 47 4.4.4 Auswertung der Blutkulturisolate 50 4.4.5 Nicht-Blutkulturen 53 4.4.6 Statistik zum Vergleich des Vorkommens der ETBF-Gen-Sequenzen und flankierenden Regionen (flanking regions) bei Blutkultur-Isolaten gegenüber Nicht- Blutkulturisolaten 61 4.4.7 Ausschluß von Enterotoxin-Genen bei Bacteroides vulgatus und Bacteroides ovatus 62 4.4.8 Vergleich der Bacteroides fragilis Stämme nach geographischer Herkunft 63 4.5 Sequenzierung der BfPAI-flankierenden Regionen in ausgewählten Stämmen 64 4.5.1 Sequenzierung der flankierenden Regionen 64 5 Diskussion 68 6 Zusammenfassung der Arbeit 79 7 Literaturverzeichnis 81 8 Anlagen 94 9 Danksagung 102 10 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 103 11 Publikationsliste 104

Excessive bacterial levels are a major water quality concern. Better methods are needed to quantify the proportion of bacterial loading contributed by various sources, and best management practices are needed to restore water quality. This study assessed the ability of alternative water supplies and grazing management to reduce E. coli loading from cattle and evaluated the ability of quantitative polymerase chain reaction analysis of total and bovine-associated Bacteroides markers (AllBac and BoBac, respectively) to determine the percentage of bovine-associated fecal contamination. Runoff from seven small watersheds, representing ungrazed, properly stocked, and overstocked conditions, was analyzed for E. coli, AllBac, and BoBac to assess grazing management impacts on E. coli runoff and the effectiveness of Bacteroides markers. To determine the effectiveness of alternative water, instream E. coli levels and cattle movement were evaluated before and after alternative water was provided. The study found that when alternative off-stream water was provided, the amount of time cattle spent in the creek was reduced 43 percent and the direct deposition of E. coli into Clear Fork of Plum Creek was estimated to be reduced from 1.11E 07 to 6.34E 06 colony forming units per animal unit per day. Observed pre- and post-treatment E. coli loads suggested similar reductions; however, this study could not conclusively attribute observed E. coli loading reductions to providing alternative water because of the lack of statistical significance of these observations, possibly due to decreased streamflow during Year 2 (due to drought) and a corresponding increase in E. coli levels. The study found that rotational stocking, if timed appropriately, was very effective at reducing E. coli runoff. The impact of grazing timing in relation to runoff events was more significant than the impact of grazing management (i.e. ungrazed properly stocked or overstocked) or stocking rate. When runoff occurred more than two weeks following grazing, E. coli levels in runoff were decreased more than 88 percent. Finally, data suggest that AllBac and BoBac markers are good indicators of recent fecal contamination from cattle. However, although elevated BoBac/AllBac ratios generally aligned well with cattle presence, this ratio appeared to underestimate the percentage of bovine-associated fecal contamination.

The human gut is host to a vast consortium of microorganisms, collectively referred to as the microbiota or microflora, which play important roles in health and disease. Current applications focus only on a single type of bacteria, which are not the most dominant numerically, and without detailed knowledge of the specific functions of these bacteria. A good indicator of the function of a bacterial species involves detailed analysis of its enzymes. Bacteroides thetaiotaomicron is one of the predominant bacterial species with a great representation of the carbohydrate processing enzymes, glycoside hydrolases in its proteome. This thesis reports the production and purification of one such enzyme, BT3299, suitable for kinetic and structural studies. The enzyme displayed a broad substrate specificity with a slight preference for 1-->3 and 1-->6 glycosidic linkages and longer chain saccharides. Future work will focus on structural analysis as an aid to the understanding of the enzyme function.

The human gut is host to a vast consortium of microorganisms, collectively referred to as the microbiota or microflora, which play important roles in health and disease. Current applications focus only on a single type of bacteria, which are not the most dominant numerically, and without detailed knowledge of the specific functions of these bacteria. A good indicator of the function of a bacterial species involves detailed analysis of its enzymes. Bacteroides thetaiotaomicron is one of the predominant bacterial species with a great representation of the carbohydrate processing enzymes, glycoside hydrolases in its proteome. This thesis reports the production and purification of one such enzyme, BT3299, suitable for kinetic and structural studies. The enzyme displayed a broad substrate specificity with a slight preference for 1-->3 and 1-->6 glycosidic linkages and longer chain saccharides. Future work will focus on structural analysis as an aid to the understanding of the enzyme function.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Bacteroides melaninogenicus strains 2D and K110 were characterized with regard to their pathogenic, collagenolytic, proteolytic, hemagglutinating and metabolic activities. Both strains were members of the subspecies 13. melaninogenicus ss. asaccharolyticus. They possessed a cell-bound oxygen-sensitive collagenase, a cell-bound and a soluble oxygen-sensitive hemagglutinin (HA), and a protease. Both strains produced butyric and phenylacetic acids and were infective in guinea pigs as characterized by their ability to produce necrotic lesions and to be transferred from one animal to another. Strain 2D required hemin for growth and its growth rate was influenced by the addition of free amino acids to the medium. The hemagglutinating and proteolytic activities of strain 2D were investigated further to determine their relationship to infection. The soluble HA was reversibly inhibited by Hg and activity was restored in the presence of reducing agents. Iodoacetic acid caused irreversible inhibition. The HA was sensitive to heat and pronase treatment. Treatment of the red blood cells (RBC) with neuraminidase enhanced HA activity while the presence of galactose in the reaction mixture inhibited it, suggesting the involvement of galactose residues on the RBCs in the reaction.. Adsorption of the HA to RBC followed by elution and gel filtration resulted in the recovery of 50% of the HA activity and a 52-fold purification. Protease production by _B. melaninogenicus strain 2D was dependent on the growth rate of the organism. The protease was reversibly inhibited by HgCl₂ and irreversibly inhibited by iodoacetamide and iodoacetic acid. The enzyme was insensitive to serine protease inhibitors and EDTA. The pH optimum for proteolytic activity was 7.0, which correlates with the pH of its natural environment, the gingival crevice. It is thus classified as a neutral sulfhydryl enzyme. A 774-fold purification of the cellular protease of 2D, with a 160% recovery of activity, was accomplished by precipitation with 60% ethanol, ultracentrifugation and gel filtration through Sephadex G-100 and Sepharose 2B in the presence of urea. Electrophoretic analysis of the protease on SDS-polyacrylamide gels revealed four distinct bands, each of which was shown to be associated with carbohydrate. In the absence of SDS only one band, which did not migrate into the gel, was obtained. Any attempts to further dissociate the protease resulted in the loss of activity. The protease was active against azocoll, azocasein, casein and N,N-dimethylcasein. No glycosidase, lipase, collagenase or HA activities were detected. Protein, carbohydrate and lipid were detected in the preparation. The soluble protease which amounted to 20% of the cellular protease of strain 2D was subjected to gel filtration on Sephadex G-100 and eluted in a single peak at the void volume. The properties of the soluble protease were identical to those of the cell associated enzyme, suggesting the presence of a single proteolytic enzyme which was released into the culture medium with cell lysis or due to shedding of outer membrane fragments. / Science, Faculty of / Microbiology and Immunology, Department of / Graduate

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