Os fungos são decompositores primários e, portanto, ocupam uma posição estratégica na base da cadeia alimentar em diversos ecossistemas, incluindo os terrestres. Por tais características, estes organismos são de especial interesse na aplicação em bioensaios de toxicidade. As metodologias com espécies bioluminescentes são geralmente práticas, economicamente viáveis e de fácil aplicação. Ainda assim, os fungos naturalmente bioluminescentes são ainda pouco estudados para este propósito, em comparação com os organismos aquáticos, como as bactérias. Neste cenário, o presente trabalho apresenta os efeitos de diferentes condições de cultivo sobre o perfil de bioluminescência do fungo Neonothopanus gardneri, buscando o desenvolvimento de um bioensaio de toxicidade utilizando esta espécie. Estudos preliminares foram destinados à redução da variação experimental, à identificação de algumas das características intrínsecas do organismo em cultura e, ainda, à definição de procedimentos de análise e de inoculação do micélio. Em seguida, a emissão de luz foi monitorada variando as temperaturas de incubação, o pH dos meios de cultura e as concentrações das fontes de carbono e de nitrogênio, adotadas como nutrientes. Identificou-se que a incubação a 30ºC em meios com 2% de ágar, 1% de melaço de cana de açúcar, 0,02% de extrato de levedura e pH 6 resultou em um perfil de bioluminescência mais adequado ao propósito de interesse, apesar de não ter resultado na maior emissão de luz possível. Nestas condições de cultivo, foi possível desenvolver um bioensaio de toxicidade. Para isso, foi necessário avaliar o comportamento da luz emitida pelo micélio em contato tanto com ar atmosférico quanto com alguns potenciais diluentes, estabelecendo-se também o tempo de exposição necessário para uma resposta máxima do fungo N. gardneri em contato com soluções de Cu+2 (50 mM) e fenol (10 mM). Neste caso, uma solução aquosa de Triton X-100 na concentração de 0,01% (m:v) tamponada com ácido 2-(N-morfolino)etano sulfônico (MES, 50 mM, pH 5,7) foi adotada para diluir os agentes tóxicos, aos quais o micélio foi exposto durante 24 horas. Posteriormente, a metodologia foi aplicada para testar a toxicidade de dois metais e dois fenóis (Cu+2, Cd+2, fenol e 4-nitrofenol), obtendo-se respectivos valores de EC50 (concentração mediana efetiva) iguais a (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Entretanto, em experimentos paralelos, a quantificação espectrofotométrica de fenóis nos meios de cultura indicou que os mesmos são difundidos homogeneamente pelo ágar. Neste caso, os valores de EC50 seriam divididos por 6, para considerar a diluição dos compostos pelos meios. O bioensaio com a espécie N. gardneri possui vantagens, principalmente em relação ao comportamento reprodutível da emissão de luz, à alta intensidade da bioluminescência, ao crescimento rápido do micélio e à sensibilidade aos agentes tóxicos testados. Considerando tais características, a metodologia desenvolvida representa um procedimento viável em bioensaios de toxicidade. Assim, a mesma pode ser aperfeiçoada em trabalhos futuros e aplicada em complemento com outros métodos já desenvolvidos para outros organismos terrestres ou aquáticos. / Fungi are primary decomposers, thus occupying a strategic position at the base of the food chain in many ecosystems, including terrestrial ones. Due to such characteristics, these organisms are of special interest to toxicity bioassays. Bioluminescent-based methods are usually practical, economically viable and easy to perform. Nevertheless, naturally bioluminscent fungi are still poorly studied in this respect, compared to aquatic organisms like bacteria. In the above mentioned scenario, this work presents the effects of different culture conditions on the bioluminescence profile of the fungus Neonothopanus gardneri, aiming at the development of a toxicity bioassay using this species. Preliminary studies were intended to reduce experimental variation, identify some of the intrinsic characteristics of the organism in culture, and also to define the procedures for analysis and mycelium inoculation. Following this, light emission was monitored varying the incubation temperatures; the culture media pH and the concentrations of carbon and nitrogen nutrient sources. It was identified that the incubation at 30ºC in culture media containing 2% agar, 1% sugar cane molasses, 0.02% yeast extract and pH 6 resulted in the most appropriate bioluminescence profile for the purpose of interest, although it has not resulted in the higher light emission. Under these culturing conditions, it was possible to develop a toxicity bioassay. To this end, it was necessary to assess the behavior of light emission from the mycelium in contact with both atmospheric air and some potential diluents, also establishing the exposure time required for a maximum response of N. gardneri in contact with Cu+2 (50 mM) and phenol (10 mM) solutions. In this case, an aqueous solution of Triton X-100 in the concentration of 0.01% (w:v) buffered with 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES, 50 mM) was chosen to dilute the toxic agents, to which the mycelium was exposed for 24 hours. Thereafter, the methodology was applied to test the toxicity of two metals and two phenols (Cu+2, Cd+2, phenol and 4-nitrophenol), obtaining respective EC50 values (median effective concentration) equal to (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Meanwhile, in parallel experiments, the spectrophotometric quantification of phenols in culture media indicated that they are evenly diffused through agar. In this case, the EC50 values would be divided by 6, in order to consider the dilution of compounds by the media. The toxicity bioassay with N. gardneri species has advantages, manly in relation to the reproducible behavior of light emission, high intensity of bioluminescence, rapid growth of mycelium and sensitivity to the tested toxic agents. Considering these characteristics, the developed methodology represents a viable procedure for a toxicological bioassay. Accordingly, it can be improved in future work and performed in addition to other methods already developed for other terrestrial or aquatic organisms.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / O estudo quÃmico do basidiomiceto Lentinus strigellus foi realizado atravÃs da investigaÃÃo da produÃÃo de metabÃlitos secundÃrios em diferentes meios de culturas, alÃm da sua utilizaÃÃo em processos de biorreduÃÃo de compostos carbonÃlicos prÃquirais (cetona e -cetoÃster). A partir de L. strigellus cultivado em meio de peptona foi possÃvel isolar os benzopiranos 2,2-dimetil-6-metoxicroman-4-ona, 4-hidroxi-2,2-dimetil-6-metoxicromano e (3R,4S)-3,4-dihidroxi-2,2-dimetil-6-metoxicromano do meio lÃquido. Do micÃlio, foram isolados o alcalÃide indÃlico echinulina e a antraquinona fisciona, ambos inÃditos para o gÃnero Lentinus. Do microrganismo cultivado em Czapek, enriquecido com caldo de batata, foram isolados do meio lÃquido os mesmos benzopiranos produzidos em peptona, alÃm de (3S,4S)-3,4-dihidroxi-2,2-dimetil-6-metoxicromano. Quando Czapek foi utilizado como meio de cultivo, foram isoladas a panepoxidona e a isopanepoxidona. CÃlulas em crescimento de L. strigellus em meio de batata-dextrose foram investigadas, pela primeira vez, na biorreduÃÃo estereoseletiva da acetofenona e nove derivados aromÃticos, alÃm das cetonas alifÃticas ciclo-hexilmetilcetona, octan-2-ona, undecan-2-ona e do -cetoÃster 4-cloroacetoacetato de metila. A maioria das cetonas aromÃticas foi convertida ao respectivo Ãlcool de configuraÃÃo S, em excessos enantiomÃricos superiores a 99%. Exceto para a undecan-2-ona, as cetonas alifÃticas foram reduzidas enzimaticamente ao Ãlcool de configuraÃÃo S em elevadas taxas de conversÃo e excessos enantiomÃricos. O -cetoÃster 4- cloroacetoacetato de metila foi quimiosseletivamente reduzido ao Ãlcool correspondente de configuraÃÃo R, mas com excesso enantiomÃrico moderado. / The chemical study of the basidiomicete Lentinus strigellus was done by the investigation of its secondary metabolites production in varied culture media, besides its utilization in the bioreduction of prochiral carbonyl compounds (ketone and - ketoester). From the liquid medium of L. strigellus grown in peptone broth, it was isolated the benzopyranes 2,2-dimethyl-6-methoxycroman-4-one, 4-hydroxy-2,2-dimethyl-6-methoxycromane and (3R,4S)-3,4-dihydroxy-2,2-dimethyl-6-methoxycromane . From the mycelium, the indol alkaloid echinuline and the antraquinone fiscione were isolated, both compounds reported for the first time in Lentinus. The same benzopyranes isolated from L. strigellus grown in peptone, besides (3S,4S)-3,4-dihydroxy-2,2-dimethyl-6-methoxycromane were isolated from the liquid medium of the microorganism grown in Czapek medium enriched with potato broth. When only Czapek was used as culture medium, panepoxidone and isopanepoxidone were isolated. Growing cells of L. strigellus in potato-dextrose medium were investigated, for the first time, in the stereoselective reduction of acetophenone and nine aromatic derivatives, besides the aliphatic ketones cyclohexylmethylketone, octan-2-one and undecan-2-one, and the -ketoester methyl 4-chloroacetoacetate. Most of the aromatic ketones were converted into the respective alcohols with S configuration in high enantiomeric excesses (> 99%). Except for undecan-2-one, the aliphatic ketones were enzimatically reduced to the alcohols with S configurations in high conversion ratios and enantiomeric excesses. -ketoester methyl 4-chloroacetoacetate was chemoselectivelly reduced to its corresponding alcohol with R configuration but with moderate ee.

Os fungos são decompositores primários e, portanto, ocupam uma posição estratégica na base da cadeia alimentar em diversos ecossistemas, incluindo os terrestres. Por tais características, estes organismos são de especial interesse na aplicação em bioensaios de toxicidade. As metodologias com espécies bioluminescentes são geralmente práticas, economicamente viáveis e de fácil aplicação. Ainda assim, os fungos naturalmente bioluminescentes são ainda pouco estudados para este propósito, em comparação com os organismos aquáticos, como as bactérias. Neste cenário, o presente trabalho apresenta os efeitos de diferentes condições de cultivo sobre o perfil de bioluminescência do fungo Neonothopanus gardneri, buscando o desenvolvimento de um bioensaio de toxicidade utilizando esta espécie. Estudos preliminares foram destinados à redução da variação experimental, à identificação de algumas das características intrínsecas do organismo em cultura e, ainda, à definição de procedimentos de análise e de inoculação do micélio. Em seguida, a emissão de luz foi monitorada variando as temperaturas de incubação, o pH dos meios de cultura e as concentrações das fontes de carbono e de nitrogênio, adotadas como nutrientes. Identificou-se que a incubação a 30ºC em meios com 2% de ágar, 1% de melaço de cana de açúcar, 0,02% de extrato de levedura e pH 6 resultou em um perfil de bioluminescência mais adequado ao propósito de interesse, apesar de não ter resultado na maior emissão de luz possível. Nestas condições de cultivo, foi possível desenvolver um bioensaio de toxicidade. Para isso, foi necessário avaliar o comportamento da luz emitida pelo micélio em contato tanto com ar atmosférico quanto com alguns potenciais diluentes, estabelecendo-se também o tempo de exposição necessário para uma resposta máxima do fungo N. gardneri em contato com soluções de Cu+2 (50 mM) e fenol (10 mM). Neste caso, uma solução aquosa de Triton X-100 na concentração de 0,01% (m:v) tamponada com ácido 2-(N-morfolino)etano sulfônico (MES, 50 mM, pH 5,7) foi adotada para diluir os agentes tóxicos, aos quais o micélio foi exposto durante 24 horas. Posteriormente, a metodologia foi aplicada para testar a toxicidade de dois metais e dois fenóis (Cu+2, Cd+2, fenol e 4-nitrofenol), obtendo-se respectivos valores de EC50 (concentração mediana efetiva) iguais a (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Entretanto, em experimentos paralelos, a quantificação espectrofotométrica de fenóis nos meios de cultura indicou que os mesmos são difundidos homogeneamente pelo ágar. Neste caso, os valores de EC50 seriam divididos por 6, para considerar a diluição dos compostos pelos meios. O bioensaio com a espécie N. gardneri possui vantagens, principalmente em relação ao comportamento reprodutível da emissão de luz, à alta intensidade da bioluminescência, ao crescimento rápido do micélio e à sensibilidade aos agentes tóxicos testados. Considerando tais características, a metodologia desenvolvida representa um procedimento viável em bioensaios de toxicidade. Assim, a mesma pode ser aperfeiçoada em trabalhos futuros e aplicada em complemento com outros métodos já desenvolvidos para outros organismos terrestres ou aquáticos. / Fungi are primary decomposers, thus occupying a strategic position at the base of the food chain in many ecosystems, including terrestrial ones. Due to such characteristics, these organisms are of special interest to toxicity bioassays. Bioluminescent-based methods are usually practical, economically viable and easy to perform. Nevertheless, naturally bioluminscent fungi are still poorly studied in this respect, compared to aquatic organisms like bacteria. In the above mentioned scenario, this work presents the effects of different culture conditions on the bioluminescence profile of the fungus Neonothopanus gardneri, aiming at the development of a toxicity bioassay using this species. Preliminary studies were intended to reduce experimental variation, identify some of the intrinsic characteristics of the organism in culture, and also to define the procedures for analysis and mycelium inoculation. Following this, light emission was monitored varying the incubation temperatures; the culture media pH and the concentrations of carbon and nitrogen nutrient sources. It was identified that the incubation at 30ºC in culture media containing 2% agar, 1% sugar cane molasses, 0.02% yeast extract and pH 6 resulted in the most appropriate bioluminescence profile for the purpose of interest, although it has not resulted in the higher light emission. Under these culturing conditions, it was possible to develop a toxicity bioassay. To this end, it was necessary to assess the behavior of light emission from the mycelium in contact with both atmospheric air and some potential diluents, also establishing the exposure time required for a maximum response of N. gardneri in contact with Cu+2 (50 mM) and phenol (10 mM) solutions. In this case, an aqueous solution of Triton X-100 in the concentration of 0.01% (w:v) buffered with 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES, 50 mM) was chosen to dilute the toxic agents, to which the mycelium was exposed for 24 hours. Thereafter, the methodology was applied to test the toxicity of two metals and two phenols (Cu+2, Cd+2, phenol and 4-nitrophenol), obtaining respective EC50 values (median effective concentration) equal to (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Meanwhile, in parallel experiments, the spectrophotometric quantification of phenols in culture media indicated that they are evenly diffused through agar. In this case, the EC50 values would be divided by 6, in order to consider the dilution of compounds by the media. The toxicity bioassay with N. gardneri species has advantages, manly in relation to the reproducible behavior of light emission, high intensity of bioluminescence, rapid growth of mycelium and sensitivity to the tested toxic agents. Considering these characteristics, the developed methodology represents a viable procedure for a toxicological bioassay. Accordingly, it can be improved in future work and performed in addition to other methods already developed for other terrestrial or aquatic organisms.

A perda de eficiência do inóculo fúngico na incorporação ao solo devido ao atrito indica a necessidade de desenvolvimento de um inóculo efetivo, viável, que mantenha a atividade biológica durante transporte e aplicação no solo, e proporcione melhora da remediação do solo contaminado. O projeto visou determinar a melhor formulação de inóculo peletizado de P. castanella afim de melhorar a resistência mecânica do inóculo e garantir as taxas de atividade enzimática e degradação de poluentes em solo. Avaliou-se o uso de agar-agar, fécula de mandioca e carragena na agregação do bagaço de cana-de-açúcar do inóculo por meio de ensaio enzimático, resistência mecânica, biomassa, colonização e degradação de pentaclorofenol (PCF). Fécula de mandioca foi capaz de melhorar a resistência do inóculo, não alterou significativamente o perfil fisiológico do fungo e proporcionou ótima taxa de degradação de PCF em relação aos demais agregantes. Este processo de imobilização mostra-se promissor em relação a outros processos por ser de simples formulação e requerer menos constituintes. / The loss of efficiency of fungal inocula during soil incorporation due to friction indicates the need to develop an effective and viable inoculum, capable to maintain its biological activity during transportation and land application, and improve the remediation of contaminated soil. The project aimed to determine the best formulation of pelleted inoculum of P. castanella in order to improve its mechanical strength and guarantee enzyme activity and degradation of pollutants in soil. We evaluated the use of agar-agar, cassava starch and carrageenan on the aggregation of sugarcane bagasse by carrying enzymatic and mechanical strength assays, biomass quantification, analysis of colonization and pentachlorophenol (PCP) degradation. Cassava starch improved the inoculums mechanical strength, did not significantly alter the physiological profile of the fungus and provided a great rate of PCP degradation when compared to the other compounds. This immobilization process is promising compared to other existing due to its simple formula and for requiring fewer components.

A perda de eficiência do inóculo fúngico na incorporação ao solo devido ao atrito indica a necessidade de desenvolvimento de um inóculo efetivo, viável, que mantenha a atividade biológica durante transporte e aplicação no solo, e proporcione melhora da remediação do solo contaminado. O projeto visou determinar a melhor formulação de inóculo peletizado de P. castanella afim de melhorar a resistência mecânica do inóculo e garantir as taxas de atividade enzimática e degradação de poluentes em solo. Avaliou-se o uso de agar-agar, fécula de mandioca e carragena na agregação do bagaço de cana-de-açúcar do inóculo por meio de ensaio enzimático, resistência mecânica, biomassa, colonização e degradação de pentaclorofenol (PCF). Fécula de mandioca foi capaz de melhorar a resistência do inóculo, não alterou significativamente o perfil fisiológico do fungo e proporcionou ótima taxa de degradação de PCF em relação aos demais agregantes. Este processo de imobilização mostra-se promissor em relação a outros processos por ser de simples formulação e requerer menos constituintes. / The loss of efficiency of fungal inocula during soil incorporation due to friction indicates the need to develop an effective and viable inoculum, capable to maintain its biological activity during transportation and land application, and improve the remediation of contaminated soil. The project aimed to determine the best formulation of pelleted inoculum of P. castanella in order to improve its mechanical strength and guarantee enzyme activity and degradation of pollutants in soil. We evaluated the use of agar-agar, cassava starch and carrageenan on the aggregation of sugarcane bagasse by carrying enzymatic and mechanical strength assays, biomass quantification, analysis of colonization and pentachlorophenol (PCP) degradation. Cassava starch improved the inoculums mechanical strength, did not significantly alter the physiological profile of the fungus and provided a great rate of PCP degradation when compared to the other compounds. This immobilization process is promising compared to other existing due to its simple formula and for requiring fewer components.