La prévalence de l’allergie alimentaire est en constante augmentation. Parallèlement les consommations alimentaires et les aliments eux même évoluent. L’aliment, de plus en plus soumis aux traitements industriels, peut présenter une allergénicité modifiée. L’objet de cette thèse sera d’évaluer l’influence des différents procédés industriels sur l’immunoréactivité des protéines alimentaires modifiées. Les différentes études présentées dans l’ouvrage aborderont l’effet de la texturation sur les protéines de soja ou de l’extrusion sur les protéines de lin (traitement thermique), l’effet de l’incorporation de nouveaux ingrédients dans l’alimentation moderne (inuline, lin). L’allergénicité des protéines recombinantes (process biotechnologique) sera abordée au travers de deux études : l’une proposera les protéines recombinantes de l’arachide comme outil diagnostique, en particulier pour le test d’activation des basophiles ; L’autre cherchera à démontrer l’innocuité allergénique d’un lysozymes recombinant humain, qui sera utilisé en alimentation humaine. L’étude de ces propriétés allergéniques sera réalisée par les tests in vitro (prick tests et test de provocation orale) et par les tests in vitro (IgEs). Des études par immuno-empreinte (immunoblot et dot blot) et par spectrométrie infrarouge permettront d’identifier les protéines modifiées. Enfin des tests cellulaires (test d’activation des basophiles) seront également réalisés. / The prevalence of the food allergy is in constant increase. At the same time food consumptions and food they even evolve. The food, more and more subjected to the industrial treatments, can present a modified allergenicity. The aim of this thesis will be to estimate the influence of the various industrial processes on the immunoreactivity of modified food proteins. The various studies presented in the work will approach the effect of the texturisation on proteins of soy or the extrusion on flaxseed proteins (heat treatment), the effect of the incorporation of new ingredients in the modern food (inuline, flaxseed). The allergenicity of recombinant proteins (biotechnological process) will be approached through two studies: the one will propose peanut recombinant proteins as a diagnostic tool, in particular for the basophil activation test (BAT); other one will try to demonstrate the allergenic harmlessness of a recombinant human lysozyme, which will be used in human food. The study of these allergenic properties will be realized by the in vivo tests (prick tests) and by the in vitro tests (IgEs). Studies by immunoblot and by infrared spectrometry will allow identifying modified proteins. Finally cellular tests (BAT) will be also performed.

L'inflammation allergique de la peau est un état dans lequel l'hôte réagit de manière excessive à des allergènes en induisant une inflammation de type Th2. Un certain nombre d’acteurs cellulaires et moléculaires ont été impliqués dans cette pathologie, mais la façon dont ils agissent dans le réseau inflammatoire demeure largement inconnue. Les basophiles ont été reconnus pour leurs fonctions effectrices en allergie, cependant, comment ils sont recrutés et activés, ainsi que comment ils interagissent avec d'autres cellules dans l’inflammation allergique cutanée demeurent mal caractérisés. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans le réseau inflammatoire de la peau allergique. En employant un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique, combiné à des outils génétique de souris, d’immunologie et d’approches biologiques cellulaires/moléculaires, l’étude de ma thèse a démontré que l’IL-3 joue un rôle crucial dans l’extravasation des basophiles dans la peau allergique des souris (Partie I), et que l’invalidation des basophiles chez les souris Mcpt8DTR entraîne une réduction systémique des éosinophiles et des neutrophiles (Partie II). Ces études fournissent ainsi de nouvelles connaissances sur le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans l'inflammation allergique de la peau. / Allergic skin inflammation is a state in which the host overreacts to otherwise innocuous allergens by inducing T helper type 2 inflammation. A number of cellular and molecular players have been implicated in the generation of allergic skin inflammation, but how they act and crosstalk in the inflammatory network remains largely unknown. Basophils have been recognized for their effector functions in allergy, however, how they are recruited to the inflamed tissue, get activated and crosstalk with other cells in inflammatory skin remain still incompletely understood. The objective of this PhD study is to investigate the recruitment, activation and function of basophils in the inflammatory network of allergic skin. Using experimental mouse model for allergic contact dermatitis, combined with mouse genetic tools, immunology and cellular/molecular biology approaches, the study of my thesis discovered that IL-3 plays a crucial role in basophil extravasation to mouse allergic skin (Part I), and that the depletion of basophils in Mcpt8DTR mice leads to a systemic reduction of eosinophils and neutrophils (Part II). These studies provide novel insights into the recruitment, activation and function of basophils in allergic skin inflammation.

Le paludisme, responsable du décès d’un million de personnes chaque année, reste un problème majeur de santé publique. Des études récentes ont évoqué des mécanismes immunopathologiques communs entre les manifestations allergiques et le paludisme, soutenus par l’existence d’un homologue parasitaire du facteur de relargage d’histamine humain (PfTCTP). Notre objectif était de déterminer l’implication des acteurs de la réponse allergique dans la gravité de l’accès palustre, et la capacité de la PfTCTP à moduler ces réponses.Trois groupes de sujets ont été recrutés dans des structures de santé à Dakar. Les patients infectés présentaient des taux élevés d’IgE totales et spécifiques, par rapport aux sujets sains, mais sans corrélation avec la gravité. A l’aide d’un test d’activation des basophiles basé sur l’expression du CD203c, nous avons montré que les basophiles de patients en accès simple présentaient un niveau d’activation basal significativement réduit. Ces mêmes patients présentaient des concentrations plasmatiques élevées en IL-10, suggérant un meilleur contrôle de leur réponse inflammatoire. Les basophiles de patients en accès grave présentaient une hyperréactivité à l’hémozoïne, ainsi qu’à des stimulations IgE-dépendantes (anti-IgE). Enfin, la présence de PfTCTP circulante a été associée à une plus grande réactivité des basophiles, tandis que l’acquisition d’anticorps contre cette protéine est associée à une protection envers une trop grande réactivité cellulaire.En conclusion, nos travaux soutiennent l’hypothèse d’une activation allergique excessive au cours du paludisme grave. Ce travail ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. / Malaria is responsible of the death of a million person each year and remains a major public health problem. Recent studies have suggested the existence of common immunopathologic mechanisms between allergic manifestations and malaria, supported by the existence of a parasite homolog of the human histamine releasing factor (PfTCTP). Our objective was to determine i) the implication of allergic response actors in the severity of malaria, and ii) the ability of PfTCTP to modulate these responses.Three groups of subjects were recruited in health structures in Dakar. Infected patients presented high levels of total and specific IgE, compared to healthy controls, although not correlated with severity. With a basophil activation test based on CD203c expression, we demonstrated that basophils from mild malaria patients presented a significantly reduced basal level of activation which paralleled higher levels of IL-10, thus suggesting a better control of their inflammatory responses. Basophils from severe malaria patients showed an hyperreactivity to haemozoin and to IgE-dependent stimulations (anti-IgE). Finally, presence of circulating PfTCTP was associated with a higher basophil reactivity, whereas acquisition of anti-PfTCTP antibodies was associated with protection towards excessive cellular reactivity.In conclusion, our results support the hypothesis of an excessive allergic activation during severe malaria. This work might open the way to new therapeutic approaches.

La leucémie aiguë à basophile du Nourrisson est un sous-type rare de leucémie aiguë myéloïde.Notre équipe avait précédemment participé à la caractérisation moléculaire de la translocationrécurrente t(X;6)(p11;q23) générant un gène de fusion MYB-GATA1 chez les nourrissons desexe masculin. Pour mieux comprendre son rôle, le facteur de transcription MYB-GATA1résultant de cette fusion a été exprimé dans des cellules progénitrices de l’hématopoïèsehumaine, CD34+ avant xénogreffe chez des souris immunodéficientes. Les cellules exprimantMYB-GATA1 présentaient une augmentation de l’expression des marqueurs d’immaturité(CD34), des marqueurs de la lignée granuleuse (CD33, CD117) et des signes de différenciationbasophile (CD203c, FcƐRI). Des cellules de lignée UT-7 ont également montré descaractéristiques de différenciation basophile après transduction par MYB-GATA1. Une analysetranscriptomique a permis de mettre en évidence 9 gènes dérégulés à la fois par la présence deMYB-GATA1 et par la différenciation basophile. L’augmentation de l’expression de 3 de cesgènes (CCL23, IL1RL1 et NTRK1) a été confirmée en RT-PCRq dans des cellules CD34+transduites avec MYB-GATA1. L’IL-33 (Interleukine 33) et le NGF (Nerve Growth Factor),les ligands respectifs de IL1RL1 et NTRK1, augmentent la différenciation basophile de cellulesUT-7 exprimant MYB-GATA1, démontrant l’importance de ces voies de signalisation dans ladifférenciation basophiles de cellules leucémiques et de cellules primaires de l’hématopoïèsehumaine CD34+. Enfin une expérience utilisant la luciférase a confirmé que MYB et MYBGATA1augmentaient l’activité des facteurs de transcription NTRK1 et IL1RL1 conduisant àl’acquisition de caractéristiques basophiles. Nos résultats soulignent ainsi l’importance desrécepteurs à l’IL-33 et au NGF dans la différenciation basophile des cellules normales etleucémiques. / Acute basophilic leukaemia (ABL) is a rare subtype of acute myeloblastic leukaemia. Wepreviously described a recurrent t(X;6)(p11;q23) translocation generating a MYB-GATA1fusion gene in male infants with ABL. To better understand its role, the chimeric MYB-GATA1transcription factor was expressed in CD34-positive hematopoietic progenitors which weretransplanted into immunodeficient mice. Cells expressing MYB-GATA1 showed increasedexpression of markers of immaturity (CD34), of granulocytic lineage (CD33, CD117) and ofbasophilic differentiation (CD203c, FcƐRI). UT-7 cells also showed basophilic differentiationafter MYB-GATA1 transfection. A transcriptomic study identified 9 genes deregulated by bothMYB-GATA1 and by basophilic differentiation. Induction of three of these genes (CCL23,IL1RL1 and NTRK1) was confirmed in MYB-GATA1-expressing CD34-positive cells byRTqPCR. IL-33 and NGF (Nerve Growth Factor), the ligands of IL1RL1 and NTRK1,respectively, enhanced the basophilic differentiation of MYB-GATA1-expressing UT-7 cells,thus demonstrating the importance of this pathway in basophilic differentiation of leukemiccells and CD34 positive primary cells. Finally, gene reporter assays confirmed that MYB andMYB-GATA1 activated NTRK1 and IL1RL1 transcription leading to basophilic skewing ofthe blasts. Our results highlight the role of IL-33 and NGF receptors in basophilic differentiationof normal and leukemic cells.

En 1985 Kroto décrit le troisième allotrope du carbone, le fullerène, une sphère de 60 carbones d’1nm de diamètre aux caractéristiques physico-chimiques particulières. La réactivité chimique du C₆₀ est dominée par les réactions d’addition et sa grande affinité pour les radicaux libres grâce à ses 30 double-liaisons. Cette propriété a été explorée dans le stress oxydant, tant in vitro qu’in vivo, où l’équilibre redox est impliqué, comme dans les situations pathophysiologiques impliquant l’inflammation et la dégénérescence cellulaire. En particulier, un traitement au C₆₀ solubilisé dans de l’huile a permis de prolonger l’espérance de vie chez le rat. Le produit, commercialisé à travers le monde, n’a pas encore fait l’objet d’essai clinique. D’autre part certaines préparations peuvent contenir des impuretés. Il est donc important d’établir des critères de pureté et d’intégrité des préparations de C₆₀. Ce travail de thèse comporte deux parties. La première, physicochimique, nous a permis d’évaluer la pureté de préparations commerciales de C₆₀ de différentes origines faisant appel à différentes techniques d’analyse: microscopie électronique à balayage, diffraction aux rayons X, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), analyse thermogravimétrique, chromatographie liquide (CLHP) ou en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM), ainsi que la spectroscopie ultraviolet-visible ou infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). La DSC est la technique de choix pour établir le critère de pureté et la FTIR la plus rapide. La CG-SM est nécessaire à l’identification des impuretés volatiles, tandis que la CLHP permet de détecter les fullerènes lourds et les dérivés du C₆₀. La deuxième partie a porté sur des aspects fonctionnels des fullerènes et nous avons, pour cela, utilisé des préparations pures selon les critères définis précédemment. Dans un premier temps, nous avons cherché à préciser le sous-compartiment cellulaire ciblé par le C₆₀ injecté in vivo chez la souris. Après administration d’une solution huileuse, les molécules de C₆₀ sont retrouvées dans le foie et la rate, à l’intérieur des cellules, parfois au niveau des mitochondries et du réticulum endoplasmique. La présence des molécules de C₆₀, au niveau des mitochondries a été corroborée par la mise en évidence de modifications spécifiques d’activité des enzymes de la mitochondrie (malate déshydrogénase et complexe I de la chaîne respiratoire). Dans un deuxième temps, nous avons abordé l’effet des fullerènes sur des cellules intervenant dans une dysrégulation immunologique où l’inflammation joue un rôle important : l’allergie. L’évènement cellulaire à l’origine des symptômes allergiques est la libération de médiateurs de l’inflammation et de la réponse immunitaire lors de l’activation dépendante des IgE des basophiles et des mastocytes. L’effet régulateur de C₆₀ et de quatre dérivés hydrosolubles, le fullérol, la β-cyclodextrine C₆₀, le dendro C₆₀ et le C₆₀ serinol-malonate, a été testé. L’innocuité des dérivés à des concentrations nanomolaires et leur pouvoir inhibiteur sur la dégranulation IgE et non IgE dépendante des lignées mastocytaires de rat a été vérifié in vitro. Dans un test d’activation cellulaire mesurant l’expression des marqueurs CD63 et CD203c par cytométrie de flux, nous montrons que les différents dérivés sont capables d’interférer ex vivo avec l’activation de basophiles de patients allergiques dans des conditions naturelles de sang total. Les taux d’inhibition dépendent des dérivés et des patients avec un maximum observé à 35% en présence de C₆₀ serinol-malonate. Ces inhibitions ont été reproduites sur des basophiles humains purifiés en étudiant des marqueurs d’activation supplémentaires CD107a et CD69. Les perspectives de ce travail portent sur la spécificité et les mécanismes d’inhibitions observés au niveau intracellulaire. Elles incluent, par exemple, l’étude des flux de calcium ou des protéines de fusion, ou des facteurs de transcription. / In 1985 Kroto discovered the third allotrope of carbon, fullerene, spherical molecule consists of 60 carbons with 1 nm in diameter with a specific physico-chemical characteristic. The chemical reactivity of C₆₀ is governed by addition reactions and its high affinity for scavenging free radicals thanks to its 30 double bonds. This property has been widely explored in the field of oxidative stress, in vitro and in vivo, where redox balance is involved, as physio-pathological situations involving inflammation and cellular degeneration. In particular, treatment with C₆₀ solubilized in olive oil extended life span in a rat experimental model. The product, marketed worldwide, has not yet been clinically tested. On the other hand, some preparations may contain impurities. It is therefore important to establish criteria for the purity and integrity of C₆₀ preparations. This thesis work consists of two parts. In the first physico-chemical part, a criterion of C₆₀ purity was established for evaluating the purity of several commercial preparations of C₆₀ with different origins using the following techniques: scanning electron microscopy, X-ray diffraction, Differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), liquid chromatography and gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), as well as ultraviolet-visible and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. The results show that FTIR is the easiest way to control the quality of C₆₀ and GC-MS is necessary for identifying volatile impurities, while HPLC remains essential for detecting other fullerenes and C₆₀ derivatives. The second part of the thesis deals with functional aspect of fullerenes and for this purpose we used the pure preparation of C₆₀ evaluated according to the previously defined criteria. In a first chapter, to precise the sub-cellular compartment targeted, the C₆₀ dissolved in olive oil were in vivo injected in mice. After administration, C₆₀ molecules were visualized in the liver and in the spleen, inside the cells and sometimes in mitochondria and endoplasmic reticulum. The targeting of [60]fullerene to the mitochondria was confirmed by a specific modification of the activities of mitochondrial enzymes (malate dehydrogenase and complex I of respiratory chain). In a second chapter we studied the effect of fullerenes on cells involved in an immune dysregulation where inflammation plays a role: allergy. The cellular mechanism at the basis of allergic symptoms is the release in circulation and tissues of mediators of inflammation and immune response from IgE-dependent activation of basophiles and mast cells. The regulatory effects of [60]fullerene and 4 hydrosoluble derivatives, fullerol, β-cyclodextrin [60]fullerene, dendro [60]fullerene and [60]fullerene serinol-malonate, were tested. In vitro experiments showed an absence of toxicity at nanomolar concentrations and inhibitory abilities on the IgE-dependent and -independent activation of the rat mast cell line (RBL). In a cellular activation test monitoring the expression of the degranulation and activation markers CD63 and CD203c on basophiles, by flow cytometry, we show that the various fullerenes are able also to inhibit the ex vivo activation of basophiles from peanut allergic patients in a natural physiological environment: in whole blood. Inhibition rates depend on patients and derivatives with a maximum inhibition observed at 35% in presence of [60]fullerene serinol-malonate. These inhibitions were reproduced on purified human basophiles by studying further activation markers CD107a and CD69. Working perspectives will be on the specificity and the mechanisms of inhibition by studying intracellularly calcium influx or the expression of fusion proteins and transcription factors.

L’allergie de type I, une réaction de type hypersensibilité immédiate (HIS), a considérablement augmenté au cours des dernières décades dans les pays industrialisés. Le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans le contrôle des maladies allergiques a été récemment apprécié. Cependant, il n’existe actuellement aucune connaissance précise si et comment les CD4+ Treg peuvent réguler l’allergie de type I. Le but du projet était d’étudier la contribution de cellules Treg dans le contrôle de l’allergie de type I chez la souris et chez l’homme. En utilisant un modèle murin d’HSI aux protéines de lait de vache, ß-lactoglobuline(BLG), nous avons montré que l’absence de Treg augmentait les réponses des cytokines Th1et Th2 et des anticorps IgE, IgG1 et IgG2a spécifique de la BLG. De plus, l’absence de Treg a augmenté la sévérité de l’anaphylaxie chez les souris sensibilisées lors de l’épreuve orale avec la BLG, avec une augmentation concomitante de la protéase des mastocytes muqueux 1(mMCP-1) dans le sérum. La contribution des cellules Treg dans un modèle murin d’anaphylaxie systémique passive (PSA) a été également étudiée. Une anaphylaxie plus sévère a été observée chez les souris déficientes en CHM de classe II ainsi que chez des souris B6 traitées avec un anti-CD4. En revanche, la déplétion sélective des Foxp3+ Treg chez des souris Tg DEREG n’a pas d’effet sur l’anaphylaxie.La capacité des Treg à contrôler la dégranulation des basophiles a été étudiée chez l’homme. Les données préliminaires ont montré que les Treg ont été incapables de contrôler la dégranulation des basophiles chez les donneurs sains. En revanche, une légère mais reproductible down-regulation de la dégranulation/activation des basophiles a été observée dans l’allergie induite par les médicaments chez l’homme. Dans l’ensemble, notre travail met en évidence un nouveau rôle encore non identifié des Treg dans le contrôle de l’HSI et souligne que chez la souris et l’homme, les Treg peuvent dans certaines conditions, limiter la sévérité de l’HSI en agissant sur les mastocytes et/ou basophiles effecteurs / Type I allergy, an immediate type hypersensitivity reaction (ITH), has dramatically increased during the past decades affecting up to 30% of the population in industrialized countries. The role of regulatory T cells (Treg) in the control of allergic diseases has been recently appreciated. However, there is currently no precise knowledge of whether and howCD4+ Treg can regulate type I allergy. The aim of this project was to investigate the contribution of Treg in the control of type I allergy. Using a murine model of ITH to cow’s milk protein the ß-lactoglobulin (BLG), we showed that lack of Treg increased BLG-specific Th2 and Th1 cytokine response and BLG-specific IgE, IgG1 and IgG2a antibodies.Furthermore, absence of Treg enhanced the severity of the anaphylaxis with concomitant increase in serum mucosal mast cell protease 1 (mMCP-1) in sensitized mice upon oral challenge with BLG. Furthermore, we investigated the contribution of Treg in a murine model of passive systemic anaphylaxis (PSA). More sever anaphylaxis was observed in both MHCclass II KO mice and after anti-CD4 mAb treatment. Alternatively, selective depletion of Foxp3+ Treg in DEREG Tg mice did not show changes in anaphylaxis.The capacity of Treg to control basophils degranulation was investigated in humans. Preliminary data showed that Treg were unable to control basophils degranulation in healthy donors. In contrast, a slight butreproducible downregulation of basophils activation/ degranulation was observed in allergic individuals. Taken together, our work points out to a novel as yet unidentified role of Treg in the control of ITH and emphasizes that both mouse and human Treg can, in certain conditions, limit the severity of ITH by acting on mast cells and/or basophils effectors of ITH

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal