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L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

Chronic inflammation in response to Aß peptide deposits is a pathological hallmark of Alzheimer's disease (AD). The inflammatory environment includes populations of reactive and proliferating microglia and astrocytes and perturbed vasculature. However, the association between activated glial cells and cerebrovascular dysfunction remain largely unknown. This study has used Aß1-42 intrahippocampal injection as an animal model of inflamed AD brain to characterize mechanisms of glial-vasculature responses as a basis for chronic inflammation. Preliminary findings suggested Aß1-42-injected brain demonstrated vascular remodeling including evidence for formation of new blood vessels (angiogenesis). This result led to study of the effects of the anti-angiogenic/anti-inflammatory compound, thalidomide on activated glial cells and perturbations in the vasculature in an Aß1-42 peptide-injected rat model. First, Aß1-42 injection was found to cause perturbations in vasculature including new blood vessel formation and increased BBB leakiness. Second, thalidomide decreased the vascular perturbations and the glial reactivity and conferred neuroprotection. Overall, these results suggest that altered cerebral vasculature is integral to the overall inflammatory response induced by peptide. Experiments then examined the level of parenchymal plasma proteins in brain tissue from AD and nondemented (ND) individuals. AD, but not ND, brain tissue demonstrated high levels of fibrinogen immunoreactivity (ir). Aß1_42 injection into the rat hippocampus increased the level of parenchymal fibrinogen, which was reduced by treatment with the defibrinogenating agent, ancrod. In addition, ancrod also attenuated microglial activation and prevented neuronal injury. Overall, these results demonstrate that extravasation of blood protein and a leaky BBB are important in promoting and amplifying inflammatory responses and causing neuronal damage in inflamed AD brain. Microglial chemotactic responses to VEGF (vascular endothelial growth factor) receptor Flt-1 were next studied. Treatment with a monoclonal antibody to Flt-1 (anti-Flt-1 Ab) in the peptide-injected hippocampus diminished microglial reactivity and provided neuroprotection. Secondly, anti-Flt-1 Ab inhibited the AI3142-induced migration of human microglia. These results suggest critical functional roles for Flt-1 in mediating microglial chemotaxis and inflammatory responses in AD brain. The overall conclusion from my work is that AP deposits induce microglial reactivity which subsequently causes vascular remodeling resulting in an amplified inflammatory microenvironment which is damaging to bystander neurons.

Tester av CAPM och Beta av bland andra Eugene Fama och Kenneth French (1992) har visat att det inte existerar något samband mellan systematisk risk (beta) och avkastning för aktier på den amerikanska aktiemarknaden. Andra forskare hävdar att det kan finnas ett samband mellan beta och avkastning om den studerade tiden fokuserar på isolerade perioder med antingen positiva eller negativa marknader. Kritik har även riktats av bland annat Richard Roll för att olika index som approximation för aktiemarknaden vid beräkningen av beta kan generera helt skilda värden och således betyda att investerare kan ha olika förväntade avkastningar för samma aktie. I denna studie försöker författarna besvara frågan om det existerar ett signifikant samband mellan beta och avkastning på den svenska aktiemarknaden. I studien undersöks sambandet på en aggregerad nivå under den totala studieperioden mellan 2003-2011 och även under isolerade positiva samt negativa marknader under samma period. Författarna använder sig av två olika index som approximation för den svenska aktiemarknaden, OMX Stockholm PI och OMX Stockholm 30, vid beräkningen av beta. För att kunna undersöka sambandet delas aktierna in i portföljer där snittvärden på beta och avkastning beräknas och studeras sedan i regressionsberäkningar. Resultatet av studien visar att det existerar ett signifikant samband mellan risk, symboliserat av beta, och avkastning på den svenska aktiemarknaden vid positiva marknader under den studerade tidsperioden. På en aggregerad nivå och även vid negativa marknader visar resultatet inte på några signifikanta samband mellan risk, symboliserat av beta, och avkastning på den svenska aktiemarknaden. I studien framkommer även att kritiken från Richard Roll varit befogad då beta blev olika beroende på vilket index som användes som approximation för den totala marknaden. / Empirical tests of CAPM and Beta by Eugene Fama and Kenneth French (1992) and others have shown that a significant correlation doesn’t exist between systematic risk (beta) and yearly returns on common stocks traded in the American stock market. Other researchers have shown that a relationship between beta and returns might exist if the studied time period is focused on isolated positive or negative markets. Richard Roll has criticized beta for the fact that by using different indices, as an approximation for the total market in the beta calculation, investors can get completely different beta values and thereby have different expected returns for the same stock. In this research the writers are trying to answer the question if a significant relationship exists between systematic risk, symbolized by beta, and returns on the Swedish stock market. During 2003-2011 the risk-return relationship is being examined at an aggregated level, and in isolated positive and negative markets. The writers are using two different indices as approximations for the Swedish stock market, OMX Stockholm PI and OMX Stockholm 30, when calculating betas. To be able to study the relationship between beta and returns common stocks have been divided up into portfolios where average betas and average returns have been calculated in order to perform a linear regression analysis. The results show that a significant relationship exists between systematic risk, symbolized by beta, and returns on the Swedish stock market during positive markets between 2003 and 2011. At an aggregated level and during negative markets in the same time period the results show no significant relationship between systematic risk, symbolized by beta, and returns on the Swedish stock market. The research confirms the criticism from Richard Roll in that the beta values turned out different depending on which index was used as an approximation for the total market when calculating beta.

Motivated by existing nuclear astrophysics problems, the B-decay of the proton rich nucleus 23Al was studied for the first time with pure samples which were obtained by using the 1H(24Mg,23Al)2n reaction and the MARS recoil separator at Texas A&M University. B and B-y coincidence measurements were made with a fast tape-transport system, scintillator, BGO and HPGe y detectors. The experiment allowed us to measure absolute B branching ratios and to determine logft values for transitions to final states in 23Mg, including the isobaric analog state (IAS), and, therefore, to determine unambiguously the spin and parity of the 23Al ground state to be J^Pi = 5/2+. This work excludes the large increases in the radiative proton capture cross section for the reaction 22Mg(p, )23Al at astrophysical energies, which were implied by claims that the spin and parity of the 23Al ground state were J^Pi = 1/2+. More precise half life and mass determinations of 23Al were obtained from the experimental data. The logft for the Fermi transition to its isobaric analog state in 23Mg was also determined for the first time. This IAS and a state 16 keV below it were observed, well separated in the same experiment for the first time. The B-decay scheme of the proton rich nucleus 23Al was established. We can now solve a number of inconsistencies in the literature, exclude strong isospin mixing claimed before, and obtain a new determination of the resonance strength. The IAS and the state 16 keV below it are resonances in the 22Na(p, )23 Mg reaction at energies that are important in novae. This second state turns out to be the resonance that gives the most important contribution in the depletion of 22Na from novae. Both of the reactions of 22Mg(p, )23Al and 22Na(p, )23Mg have been suggested as possible candidates for diverting some of the flux in oxygen-neon novae explosions from the A=22 into the A=23 mass chain.

A major limiting factor for long-term, deep-space missions is the radiation dose to astronauts. Because the dose to the astronauts is a mixed field of low- and high-LET radiation, there is a need to understand the effects of both radiation types on whole tissue; however, there are limited published data on the effects of high-LET (linearenergy- transfer) radiation on tissue. Thus, we designed a perfusion chamber system for rat trachea in order to mimic in vivo respiratory tissue. We successfully maintained the perfused tracheal tissue ex vivo in a healthy and viable condition for up to three days. In addition, this project studied the effects of high-LET Fe particles on the overall transformation growth factor (TGF)-beta response after TGF-beta inactivation and compared the results to the TGF-beta response post x-ray irradiation. It was found that a TGF-beta response could be measured in the perfused tracheal tissue, for x-ray and Fe particle irradiations, despite the high autofluorescent background intrinsic to tissue. However, after comparing the TGF-beta response of x-ray irradiation to High-Z-Highenergy (HZE) irradiation, there was not a significant difference in radiation types. The TGF-beta response in x-ray and HZE irradiated perfusion chambers was also measured over time post irradiation. It was found that for 6 hour and 8 hour post irradiation, the TGF-beta response was higher for lower doses of radiation than for higher doses. This is in contrast to the 0 hour fixation which found the TGF-beta response to increase with increased dose. The inverse relationship found for 6 hour and 8 hour fixation times may indicate a threshold response for TGF-beta response; i.e., for low doses, a threshold of dose must be reached for an immediate TGF-beta response, otherwise the tissue responds more slowly to the irradiation damage. This result was unexpected and will require further investigation to determine if the threshold can be determined for the 250 kVp x-rays and 1 Gev Fe particles.

Abstract Our previous study showed that KChIP3 (Kv Channel Interacting Protein 3) probably was a physiological targete protein of beta-bungarotoxin (beta-Bgt) as evidenced by yeast two-hybrid system. Thus, extensive efforts are carried out to explore the molecular interaction between KChIP3 and beta-Bgt in the present study. KChIPs are potassium (Kv) channel-interacting proteins that bind to the 1~90 amino acid of N-terminus of Kv4 alpha-subunits and regulate the ion current density, shift the voltage dependence of activation and speed their recovery from inactivation. beta-Bgt, a presynaptic neurotoxin purified from Bungarus multicinctus venom, consists of A chain and B chain which cross-linked by an interchain disulfide bond. The results of pull-down assay revealed that, in contrast to other KChIP proteins, KChIP3 bound with beta-Bgt. Moreover, it was found that the B chain of beta-Bgt was a functional subunit in the binding with KChIP3, and the binding of KChIP3 to beta-Bgt showed a Ca2+-dependent manner. Removal of the third and the fourth EF-hand regions of KChIP3 abolished its interaction with beta-Bgt. Noticeably, the binding of beta-Bgt with KChIP3 did not influence the interaction between KChIP3 and Kv4. In the meantime, rat brain KChIP3 could be isolated using a beta-Bgt-Sepharose column. These observations suggest that KChIP3 is an intra-cellular target recognized by beta-Bgt. Accidently, it was found that direct protein-protein interaction between Taiwan cobra cardiotoxin3 (CTX3) and potassium channel-interacting proteins (KChIPs) was investigated. It was found that KChIPs bound with CTX3, in which KChIP1 and CTX3 formed a 1:1 complex as evidenced by the results of chemical crosslinking. Pull-down assay revealed that the intact EF-hand 3 and 4 of KChIP1 was critical for CTX3-binding. Whereas, all mutated KChIP3 were able to bind with CTX3. In contrast to the interaction between KChIP1 and KvN, the binding of CTX3 to KChIP1 showed a Ca2+-independent manner. Fluorescence measurement revealed that CTX3 affected the binding of ANS to Ca2+-bound KChIP1, but not Ca2+-free KChIP1. Alternatively, KChIP1 simultaneously bound with KvN and CTX3, and the interaction between KChIP1 and KvN was enhanced by CTX3. In terms of the fact that KChIPs regulate the electrophysiological properties of Kv K+ channel, the potentiality of beta-bgt and CTX for this biomedical application could be considered.

Brachytherapy refers to the therapeutic use of encapsulated radionuclides within or close to a tumor. Today brachytherapy is used as an alternative to surgery or beam therapy to treat different kinds of cancers such as breast, lung, prostate, ovarian and pancreatic, primary and metastatic hepatic tumors and rheumatoid arthritis. Microspheres are one therapy utilized in brachytherapy procedures. Despite the development of advanced equipment and methods, there is still a limited knowledge of radiation dose distribution when utilizing this technique. This study focuses on random packing of microspheres and seeks to determine dose distributions for specific cases. The Monte Carlo Neutral Particle code (MCNP) developed by Los Alamos National Laboratory is used to simulate beta particle transport. Pr-142 is the beta source utilized for all calculations. The cylinder radii are 0.1, 0.15 and 0.3 cm and sphere radii are 0.03, 0.05 and 0.07 cm. The results are verified by examining limiting cases: uniformly distributed source and line of microspheres. Based on the data collected, the correlations between the average dose, its related variance, and distance from the cylinder were determined. An approach for estimating the surface average dose was developed and suggestions regarding an approach to assess surface variance estimation were presented.

Del mes de enero al mes de octubre del año 2008 en el Servicio de Microbiología del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyn – ESSALUD, se colectaron 186 cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes al Imipenem (IMP) y al Meropenem (MEM) o con resistencia Intermedia a los dos antibióticos o a uno de ellos. Utilizando el Método Fenotípico de Doble Difusión en Disco con Monodiscos de EDTA; se llegó a detectar 13 cepas de P. aeruginosa positivas para MBLs, correspondiente al 6.99 % de las cepas testadas; de las cuales, el 53.84 % de la sinergia (efecto de la metaloenzima) se manifestó en el disco de Meropenem, el 30.75 % se manifestó en ambos discos (Imipenem y Meropenem) y solo el 15.38 % se manifestó en el disco de Imipenem. El 100 % de cepas de P. aeruginosa en las que se detectó las metaloenzimas provinieron de pacientes hospitalizados, de estos aislados el 69.76 % correspondieron al sexo masculino; el 61. 53 % de casos corresponden a pacientes cuyas edades están entre 70 a 90 años, y sólo el 14.14% de casos fueron en menores de 1 año y jóvenes. Las muestras biológicas en las que aisló a P. aeruginosa productora de MBLs fueron: orina, aspirado bronquial, BAL, herida no operatoria, secreción otica, líquido de diálisis peritoneal y sangre; fue orina en la que se aisló el mayor número de casos: 46. 15 %; en el Servicio de Medicina‐1, se detecto más casos 30.76 %, seguido de Cardiología y UCI con 23.07 %. Se detectó la enzima MBLs en cepas peruanas de Pseudomonas aeruginosa y se estableció la incidencia en 6.99 %, la cual es inferior a las reportadas por otros países, por lo cual se debe hacer estudios multicentricos para establecer la incidencia real. / In the study, 186 samples of Pseudomonas aeruginosa strains resistant to the Imipenem (IMP) and the Meropenem (MEM) or with Intermediate resistance to both antibiotic and one of them were collected in the Service of Microbiology of the Guillemo Almenara Irigoyen National Hospital ‐ ESSALUD from the month of January to the month of October of the year 2008. Using the Phenotypical Method of Double Disc Diffusion with Monodiscs of EDTA; 13 positive strains of Pseudomonas aeruginosas for MBLS were detected (6.99 % of the sampled strains): of them, the 53.85% of the synergy (effect of metal‐enzyme) was present in the disc of Meropenem, the 30.75% was present in both discs (Imipenem and Meropenem) and only the 15.38% was present in the disc of Imipenem. The 100% of the P. aeruginosa strains in which metal‐enzyme was detected belonged to hospitalized patients and the 69.76% of them belonged to masculine sex. The 61.54 % of cases correspond to patients whose ages are between 70 to 90 years, and only the 15.38% of the cases were in minors of 1 year and young people. The biological samples, in which the producing P. aeruginosa of MBLs was isolated, were: urine, inhaled bronchial, BAL, non operating wound, ear secretion, liquid of dialysis peritoneal and blood; but it was in the urine in that the greater number of cases was isolated the 46. 15 %. In the Service of Medicine‐1 were detected mayor number of cases (23.07%) followed for Cardiology and UCI (23.07%). The MBLs enzyme was detected in Pseudomonas aeruginosa peruvian strains. The incident was of 6.99% that is lower tanning the incident reported in other countries. For which Multicentral studies must be done for establish the real incident.