Eine langdauernde Vorinkubation des GPI bzw. des MVD mit Morphin-haltiger Nährlösung (unter in vitro-Bedingungen wird anstelle von Morphin häufig Normorphin verwendet) führte zur Entwicklung von Toleranz und im Falle des GPI zu einer zusätzlichen Abhängigkeits-ähnlichen Reaktion. Die Toleranz manifestierte sich als verminderte Ansprechbarkeit gegenüber dem in Anwesenheit des Morphins akut applizierten Normorphin, während die Gewebeabhängigkeit sich als starke Naloxon-induzierte Kontraktion bemerkbar machte. Diese Kontraktion beruhte auf einer massiven Ausschüttung von Acetylcholin aus den postganglionär parasympathischen Nervenendigungen. Als Erklärung wurde hinzugezogen, dass Naloxon das Morphin von seinen Rezeptoren verdrängt und eine entzugsähnliche Reaktion auslöst. Da nicht nur eine in vitro-Vorinkubation mit Morphin in den beiden Präparaten zur Empfindlichkeitsabnahme gegenüber Morphin/Normorphin führte sondern auch die mehrtägige, subkutane Implantation eines Morphin-Pellets oder einer Opioid-Lösung enthaltenden osmotischen Minipumpe, haben wir über den letzteren Weg selektive Toleranz gegenüber μ- (Morphin, Fentanyl), δ- (DADLE) und κ-Agonisten (Ethylketocyclazocin, MR 2034, MRZ) hervorgerufen. Nach in vivo-Behandlung mit den genannten Substanzen wurde das GPI präpariert, in einer Nährlösung, die den jeweiligen Agonisten in der ungefähr 80-fachen Toleranz-induzierenden Kon-zentration enthielt, aufgehängt und mit Feldelektroden elektrisch stimuliert. Die Reizparameter wurden so gewählt (supramaximale Spannung, 0.5 ms Reizbreite, 0.1 Hz Frequenz), dass ausschließlich das neuronale Gewebe stimuliert wurde, nicht aber der Glattmuskel. In vorhergehenden Experimenten konnte die Rezeptorausstattung des GPI nicht eindeutig identifiziert werden. Mit der Erzeugung der selektiven Toleranz an µ-Rezeptoren wurde die akute Wirkung von sowohl μ- als auch δ-Rezeptor-Agonisten wesentlich vermindert. Demgegenüber, übten κ-Rezeptor-Agonisten ihre Wirkung in unveränderter Intensität aus. Die vollständige Kreuz-Toleranz zwischen Morphin und DADLE schloss das Vorhandensein eines δ-Rezeptors aus, während die fehlende Kreuz-Toleranz zwischen Normorphin/DADLE einerseits und Ethylketocyclazocin andererseits das Vorhandensein eines κ-Rezeptors belegte. Es bedarf einer Erklärung, weshalb die in vivo-Behandlung mit Fentanyl nur geringe Toleranz gegenüber Normorphin auslöste und vice versa (wenig Kreuz-Toleranz), obwohl sich eine hochgradige Toleranz gegenüber derselben Substanz entwickelte. Es wurde geschlussfolgert, dass es verschiedene Subtypen von μ-Rezeptoren gibt, eines mit Empfindlichkeit gegenüber Morphin/Normorphin und ein anderes gegenüber Fentanyl.

Eine langdauernde Vorinkubation des GPI bzw. des MVD mit Morphin-haltiger Nährlösung (unter in vitro-Bedingungen wird anstelle von Morphin häufig Normorphin verwendet) führte zur Entwicklung von Toleranz und im Falle des GPI zu einer zusätzlichen Abhängigkeits-ähnlichen Reaktion. Die Toleranz manifestierte sich als verminderte Ansprechbarkeit gegenüber dem in Anwesenheit des Morphins akut applizierten Normorphin, während die Gewebeabhängigkeit sich als starke Naloxon-induzierte Kontraktion bemerkbar machte. Diese Kontraktion beruhte auf einer massiven Ausschüttung von Acetylcholin aus den postganglionär parasympathischen Nervenendigungen. Als Erklärung wurde hinzugezogen, dass Naloxon das Morphin von seinen Rezeptoren verdrängt und eine entzugsähnliche Reaktion auslöst. Da nicht nur eine in vitro-Vorinkubation mit Morphin in den beiden Präparaten zur Empfindlichkeitsabnahme gegenüber Morphin/Normorphin führte sondern auch die mehrtägige, subkutane Implantation eines Morphin-Pellets oder einer Opioid-Lösung enthaltenden osmotischen Minipumpe, haben wir über den letzteren Weg selektive Toleranz gegenüber μ- (Morphin, Fentanyl), δ- (DADLE) und κ-Agonisten (Ethylketocyclazocin, MR 2034, MRZ) hervorgerufen. Nach in vivo-Behandlung mit den genannten Substanzen wurde das GPI präpariert, in einer Nährlösung, die den jeweiligen Agonisten in der ungefähr 80-fachen Toleranz-induzierenden Kon-zentration enthielt, aufgehängt und mit Feldelektroden elektrisch stimuliert. Die Reizparameter wurden so gewählt (supramaximale Spannung, 0.5 ms Reizbreite, 0.1 Hz Frequenz), dass ausschließlich das neuronale Gewebe stimuliert wurde, nicht aber der Glattmuskel. In vorhergehenden Experimenten konnte die Rezeptorausstattung des GPI nicht eindeutig identifiziert werden. Mit der Erzeugung der selektiven Toleranz an µ-Rezeptoren wurde die akute Wirkung von sowohl μ- als auch δ-Rezeptor-Agonisten wesentlich vermindert. Demgegenüber, übten κ-Rezeptor-Agonisten ihre Wirkung in unveränderter Intensität aus. Die vollständige Kreuz-Toleranz zwischen Morphin und DADLE schloss das Vorhandensein eines δ-Rezeptors aus, während die fehlende Kreuz-Toleranz zwischen Normorphin/DADLE einerseits und Ethylketocyclazocin andererseits das Vorhandensein eines κ-Rezeptors belegte. Es bedarf einer Erklärung, weshalb die in vivo-Behandlung mit Fentanyl nur geringe Toleranz gegenüber Normorphin auslöste und vice versa (wenig Kreuz-Toleranz), obwohl sich eine hochgradige Toleranz gegenüber derselben Substanz entwickelte. Es wurde geschlussfolgert, dass es verschiedene Subtypen von μ-Rezeptoren gibt, eines mit Empfindlichkeit gegenüber Morphin/Normorphin und ein anderes gegenüber Fentanyl.:Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis…………………………………………………………………………… 2 Wissenschaftlicher Anteil der Promovendin an der Publikation……………………….. 3 Bibliographische Beschreibung……………………………………………………………. 4 I. Einleitung………………………………………………………………………………… 5 Grundlegende Erklärungen……………………………………………………………. 5 Multiple Opioidrezeptoren……………………………………………………………… 5 II. Wissenschaftlicher Hintergrund………………………………………………………..8 Eigene Publikationen…………………………………………………………………… 8 Fragestellungen der Dissertation………………………………………………………8 III. Zusammenfassung der Arbeit…………………………………………………………. 9 IV. Originalmitteilungen…………………………………………………………………... 3 V. Derzeitiger Stand der Opioidforschung……………………………………………31 Opioidrezeptortypen…………………………………………………………………… 31 Transduktionsmechanismen der Opioidrezeptoren; Toleranz und Abhängigkeit…………….. 32 Zentrale und periphere Opioidanalgesie…………………………………………….. 38 Schlussfolgerungen……………………………………………………………………. 39 VI. Literaturverzeichnis……………………………………………………………………. 40 Eigenständigkeitserklärung……………………………………………………………….. 44 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis…………………………………………… 45 Danksagung………………………………………………………………………………… 49

Influenza A Viren (IAV) infizieren die Epithelzellen unserer Atemwege und stellen ein weltweites Gesundheitsproblem dar. Die Infektion beginnt mit der Bindung an Sialinsäure (SA) auf der Wirtszelloberfläche. Zwischen einem SA-Molekül und dem viralen Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) kommt es dabei zur Interaktion durch nicht kovalente Bindung. Die Inhibierung dieses entscheidenden Schrittes des Infektionszyklus durch Präsentation eines kompetitiven Binders ist ein möglicher Ansatz für ein antiviral wirkendes Mittel. Das Prinzip, mit dem IAV an Zellen binden, ist die Multivalenz. Detailliertes Wissen zur Multivalenz, speziell zur HA-SA-Interaktion, ist für eine effektive IAV-Inhibition von Nöten. Diese Arbeit untersucht und charakterisiert die HA-SA-Interaktion auf zwei unterschiedlichen Wegen. Wird SA auf einer ausgewählten Gerüststruktur funktionalisiert, kann es zu einer multivalenten Anordnung des IAV-Rezeptors kommen. Derartige multivalente Nanopartikel (NP) wurden in Bindungsstudien hinsichtlich ihres Potenzials charakterisiert IAV effektiv zu binden und zu inhibieren. Die Effektivität und die damit einhergehende Stabilität der HA-SA-Interaktionen der getesteten NP, die auf drei verschiedenen Gerüststrukturen basieren (Coiled-Coil-Peptid, PNA-DNA-Strang, Polyglycerolkomplex), hängt von der Verteilung elektrostatischer Oberflächenladungen und der Flexibilität der Gerüststruktur ab. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Veränderungen auf Seiten des HAs analysiert. Zwei IAV mit Mutationen in der HA-Bindetasche, sowie das Wildtypvirus wurden in Messungen mittels Einzel-Virus-Kraft-Spektroskopie hinsichtlich ihres Bindungsverhaltens an SA charakterisiert. Die Daten belegen, dass die Verteilung elektrostatischer Oberflächenladungen im HA Einfluss auf die HA-SA-Interkation hat. Alle Ergebnisse zusammengenommen liefern neue Erkenntnisse über die Einflussnahme der HA-SA-Interaktion und wie daraus abgeleitet multivalente Nanopartikel weiter optimiert werden können. / The Influenza A virus (IAV) infects epithelial cells of the human respiratory tract and represents a global health problem. Every infection starts with virus binding on sialic acid (SA) displayed on the host cell surface. This step is characterized by interaction between the viral surface protein hemagglutinin (HA) and sialic acid (SA) that leads to a non-covalent binding. Inhibition of this crucial step of viral infection cycle by presenting a competitive binder to IAV is one approach utilized during the design of antiviral compounds. IAV binds specifically to cells by using the principle of multivalency. Targeting an effective virus inhibition requires detailed knowledge about the binding mechanism, especially about the HA-SA-interaction. This work focuses on the evaluation and characterization of the HA-SA-interaction following two different approaches. In case SA is functionalized on an appropriate scaffold structure, the IAV receptor can arrange in a multivalent fashion. These multivalent nanoparticles (NP) have been studied regarding their potential to effectively bind and inhibit IAV. This potential is directly linked to the stability of the HA-SA-interactions of the tested NPs, which are based on three different scaffold structures (coiled-coil peptide, PNA-DNA-strand, a complex of polyglycerols) and depends on the distribution of electrostatic surface charges and the flexibility of the scaffold structure. The second part of this thesis analyzed changes at HA. The wildtype virus and two IAVs comprising each a mutation in the binding pocket of HA were characterized regarding their binding behavior by single-virus-force-spectroscopy. Results revealed that the arrangement of electrostatic surface charges on HA affecting the HA-SA-interaction. Taken together, all results provide new and important insights into the dependence of the HA-SA-interaction and how this knowledge can be used to further optimize multivalent NPs.