Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2001. / Bibliogr.: f. 40-47. Publié aussi en version électronique.

Th. doct.-ing.--Nancy, I.N.P.L., 1977.

Les plantes de la forêt boréale ont été longtemps utilisées par les Amérindiens pour traiter diverses infections virales et bactériennes. Cependant, peu d'études ont été réalisées dans le but d'évaluer leur activité biologique, notamment l'activité infectieuse. Le principal objectif de ce projet de recherche était de confirmer l'activité anti virale de plusieurs plantes utilisées par les Amérindiens. Pour atteindre cet objectif, nous avons : (i) développé une méthode pour évaluer l'activité anti virale contre les virus de 1'influenza de type A et l'herpès simplex de type 1, (ii) sélectionné des plantes utilisées en médecine traditionnelle amérindienne, (iii) évalué leur activité in vitro et (iv) déterminé l'effet des extraits à différents stades de l'infection. Nous avons sélectionné cinq plantes utilisées pour traiter des infections potentiellement virales comme le rhume ou la grippe : Achillea millefolium L., Cornus canadensis L., Trillium erectum L., Plantago major L., et Trifolium repens L.. Ces plantes ont été récoltées et extraites selon des méthodes similaires à celles utilisées par les Amérindiens, comme la décoction et l'infusion. L'activité antivirale a été évaluée à différents stades de l'infection soient 1'adsorption des virus par les cellules hôtes et la replication des virus. L'action directe des extraits sur les virus a également été testée. Finalement, la cytotoxicité des extraits a été déterminée sur des fibroblastes de peau humaine en culture. Les résultats ont montré que la plupart des extraits possédaient une activité modérée contre Y influenza. La plante ayant obtenue la meilleure activité est Cornus canadensis avec une inhibition de 16 à 96% (selon le moment de l'infection) à une concentration de 100|Lig/ml. D'autre part, cette plante a également été trouvée fortement active contre le virus de l'herpès simplex de type 1. Les extraits de feuilles ont non seulement une activité antivirale directe sur le virus (IC50 =11 |ig/ml) mais inhibent aussi sa replication (IC50 = 44 |ug/ml). L'ensemble des résultats obtenus in vitro confirme l'activité antivirale contre le virus de 1'influenza de plusieurs plantes utilisées en médecine traditionnelle amérindienne et montre pour la première fois une activité contre le virus de l'herpès simplex type 1.

La forêt boréale est l’une des plus importantes ressources naturelles présentes au Canada. L’exploitation de la biomasse forestière permet la production d’une vaste gamme de produits s’étendant au-delà du bois d’oeuvre et des pâtes et papiers, notamment les PFNL (produits forestiers non ligneux), parmi lesquels on compte les champignons forestiers. Principalement utilisés à des fins culinaires, plusieurs espèces de champignons restent méconnues en ce qui concerne leurs propriétés pharmacologiques et cosmétologiques. Le but de ce projet visait à évaluer le potentiel biologique de plusieurs champignons de la forêt boréale pour des applications pharmaceutiques et cosméceutiques. Pour réaliser ce projet, quinze espèces ont été récoltées, séchées et extraites à l’aide de divers solvants. Les extraits obtenus ont été soumis à une batterie d’essais biologiques pour en évaluer le potentiel. Un extrait hexane/éthanol de Pycnoporus cinnabarinus a présenté la meilleure activité anticancéreuse observée avec des IC50 de 4,1 ± 0,2 et 4,1 ± 0,3 μg/ml contre les lignées cancéreuses du poumon A549 et du colon DLD-1, respectivement. D’après les résultats, plusieurs espèces possèdent des activités anti-inflammatoire et antioxydante. Cet extrait a également inhibé la production de NO avec une IC50 de 1,9 ± 0,4 μg/ml. Les extraits de Boletus edulis, Craterellus fallax et Morchella conica ont stimulé significativement la croissance des fibroblastes. Une activité antibactérienne contre S. aureus a été détectée dans un extrait éthanolique d’Hypomyces lactifluorum avec des CMI de 12,5 et 50 μg/ml. En conclusion, plusieurs champignons possédant des propriétés biologiques intéressantes ont été identifiés. Ce projet a permis d’améliorer nos connaissances sur les propriétés biologiques de plusieurs espèces de champignons présentes au Québec jusqu’alors méconnus, contribuant ainsi à leur valorisation.

Au cours du cycle cellulaire, de nombreux agents génotoxiques conduisent à la formation de cassures double brins (CDB) de d’ADN. Ces lésions extrêmement dangereuses doivent être réparées afin de ne pas altérer l’intégrité du génome et la survie cellulaire. Chez les mammifères, la plupart de ces CDB sont prise en charge par la voie de réparation NHEJ (pour Non Homologous End Joining, recombinaison non homologue en français). La première étape de cette voie, la reconnaissance des extrémités d’ADN, est assurée par l’hétérodimère Ku70-Ku80. Ce complexe protège les extrémités d’ADN des activités de résection et recrute les facteurs impliqués dans la poursuite de la voie de réparation (la DNA-PKcs, XLF et le complexe de ligation XRCC4-LigIV) ainsi que des facteurs accessoires (PAXX, WRN et APLF). De cette observation, une vision plus générale de la fonction de Ku a émergé, une fonction de coordination de la voie NHEJ. La manière dont Ku interagit avec tous les facteurs du NHEJ, pour la réparation de toutes les CDB (propres ou non, accidentelles ou programmées) reste une question ouverte. Notre équipe travaillait précédemment sur l’étude des facteurs XRCC4 et XLF, dont ils ont pu mettre en évidence l’association en filaments dans un cristal.Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé les structures cristallines de complexes comprenant Ku70-Ku80, un ADN et des peptides portant un motif de liaison à Ku (KBM) issus des protéines APLF et XLF. Le motif KBM de APLF se fixe de manière très forte à Ku (avec une affinité de 33 nM) et interagit avec une surface conservée sur Ku80. Cette interaction se déroule loin du site de fixation de Ku à l’ADN, à la périphérie du complexe. La connaissance des détails moléculaires de cette interaction a permis de comprendre et de rationnaliser la présence de résidus très conservés à la surface de Ku80 et dans la séquence d’APLF.Le motif KBM présent chez XLF, présentent une affinité plus modérée (un Kd de quelques μM) malgré une similarité de séquence importante avec le KBM de APLF (une région basique suivi d’une région hydrophobe). La structure du complexe Ku70-Ku80-ADN et du KBM de XLF montre que ce peptide se fixe sur un site différent de celui d’APLF. En effet ce peptide induit un large changement de conformation de Ku80 et vient se loger dans le sillon ainsi découvert. Par la suite, j’ai caractérisé deux mutants du KBM de XLF (L297E et L297W) qui respectivement abroge et renforce l’interaction de ce motif KBM avec Ku.Ensemble ces résultats confortent notre idée que Ku joue le rôle de chef d’orchestre de la voie de réparation NHEJ chez l’humain. / During the cell life many endo or exogenous genotoxic agents lead to the formation of DNA double strand breaks (DSBs). These lesions are extremely toxic and must be repaired in order to maintain the integrity of the genome and the survival of the cell. In mammalian, most DSBs are repaired by the Non Homologous End Joining (NHEJ) pathway. The recognition step of NHEJ is mediated by the ring-shape Ku70-Ku80 (Ku) heterodimer that protects the DNA extremities from resection and can recruit several core NHEJ factors (DNA-PKcs, ligase complex Ligase4-XRCC4 and ligation co-factor XLF) as well as several accessory NHEJ factors (PAXX, APLF and WRN). Beyond its DNA ends binding activity, Ku appears more and more as the central coordinator of the NHEJ pathway. How do all the NHEJ factors interact with Ku and are involved in the repair of all DNA ends (clean or dirty, accidental or programmed) are questions not well elucidated. Our laboratory is interested in the recruitment of XLF and XRCC4 by Ku, either as individual factors or as filaments as the one we described previously1,2.During my thesis, I characterized the crystal structures between Ku70/Ku80/DNA and peptides containing the Ku Binding Motif (KBM) of two NHEJ factors, XLF and APLF (the Aprataxin like-factor nuclease). The KBM of APLF binds to Ku with a tight affinity (Kd of 33nM) and it interacts within a conserved pocket of Ku80. The KBM of APLF is located in a position remote from the DNA binding site, at the periphery of the Ku ring. The crystal structure rationalizes the role of the conserved basic and hydrophobic parts of the APLF KBM motif. The KBM of XLF has a moderate affinity (Kd of 4 µM) and a sequence with a similar basic and hydrophobic parts. Interestingly, the crystal structure of a Ku70/Ku80/ADN complex with a XLF KBM shows that this motif occupies a different site from the KBM of APLF. The XLF motif induces a large conformational change of Ku80 and occupies a cleft that does not exist in the original Ku70/Ku80/DNA complex.I then characterized two mutants of XLF in the KBM motif, (L297E and L297W) that respectively disrupt the binding of the KBM with Ku or redirect the XLF KBM to the APLF site.All together those results help us to better understand the coordination of several NHEJ factors by Ku. This support our idea that Ku acts as a coordinator of the NHEJ pathway.

L'analyse de la structure cristallographique de l'hémoglobine tronquée N de Mycobacterium tuberculosis (trHbN) a mis en évidence deux tunnels hydrophobes reliant le site actif à l'extérieur de la protéine. TrHbN a la capacité de protéger la respiration aérobique en phase stationnaire de Mycobacterium bovis de l'inhibition par le NO, possiblement grâce à son activité NO-dioxygénase. De plus, trHbN présente une des affinités pour l'oxygène les plus élevées observées pour une globine (K<i = 9 nM). Ces caractéristiques pourraient dépendre des tunnels de trHbN qui, par leur topologie, leur taille et leur caractère hydrophobe, pourraient servir à la migration sélective de ligands apolaires. Pour étudier cette hypothèse, des mutants aux entrées des tunnels obstruées ont été conçus in silico dans un premier temps, par une approche rationnelle. L'effet de ces mutations a été étudié par dynamique moléculaire d'une part et par spectroscopie et enzymologie d'autre part. Cette approche a montré que ces mutations n'ont pas perturbé le repliement de la protéine, la dynamique des résidus impliqués dans la stabilisation de ligands exogènes ou les caractéristiques spectrales de trHbN. De plus, la stabilisation d'une molécule d'eau au site distal est demeurée l'étape limitante de l'association de ligands à Thème. L'obstruction partielle à l'addition du NO à trHbNFen02 pour les mutants du tunnel court indique que celui-ci, ainsi que des voies de migration autres que les tunnels cristallographiques sont impliqués dans la migration de substrats apolaires au site distal.

Les récepteurs nucléaires LXRs sont associés aux métabolismes des lipides, du cholestérol et des hydrates de carbone. Ses agonistes naturels seraient des dérivés oxydés du cholestérol connus sous le nom d’oxystérols. Le cholestérol et les oxystérols sont associés au développement de l’athérosclérose une maladie cardiovasculaire qui a des graves conséquences sur les sociétés modernes. L’un des facteurs de risque majeurs de l’athérosclérose est le diabète de type II. Dans cette étude, qui essaye de faire un lien entre athérosclérose et diabètes, nous avons étudié les effets des LXRs sur le transport du glucose en conditions d’hyperglycémie et d’hyperglycémie/hyperinsulinémie qui sont des caractéristiques du diabète de type II. Nous avons mis en évidence que les transporteurs des hydrates de carbone Glut1, Glut3, Glut5 et Glut9 sont exprimés dans le macrophage humain THP1. Glut5 est connu comme étant un transporteur de fructose et Glut9 comme un transporteur d’urée. Nous avons démontré que Glut1 est impliqué dans le transport glucose des macrophages humain THP-1 et que ce transport est sensible à l’insuline. Tant l’activation spécifique que l’activation non spécifique de LXRs augmentent le transport de glucose dans les conditions étudiées, mais d’une manière différente. Cette étude nous a permis de démontrer qu’il pouvait y avoir un lien entre l’activation des récepteurs nucléaires LXRs sensibles aux oxystérols et une amélioration du transport du glucose dans les macrophages humains. / LXRs are nuclear receptors involved in lipids, cholesterol and carbohydrates metabolism. Their natural agonists are believed to be oxidized derivatives of cholesterol known as oxysterols. Cholesterol and oxysterols are associated with the development of atherosclerosis a cardiovascular disease having devastating consequences in modern societies. One of the major risk factors for atherosclerosis is type II diabetes. In this report, trying to make a link between atherosclerosis and diabetes, we attempt to demonstrate that LXRs may have an effect on glucose transport in conditions of hyperglycemia or hyperglycemia/hyperinsulinemia, two specific characteristics of type II diabetes. We found that in the THP1 human macrophage Glut1, Glut3, Glut5 and Glut9 are expressed. Glut5 is known as a fructose transporter and Glut9 as a urea transporter. We unveil that Glut1 was involved in glucose transport in human THP1 macrophages, and it was sensible to induction with insulin. Both specific and less specific activation of LXR increased glucose transport in hyperglycemic and hyperglycemic/hyperinsulinemic conditions but in a different way. This study demonstrated that activation of LXRs nuclear receptors that are sensible to oxysterols have benefic effects on glucose transport in human macrophages.

Problématiques : 1) Mes travaux de maitrise ont démontré qu’il était possible de fusionner des hormones peptidiques avec la protéine fluorescente verte (EGFP) pour obtenir des ligands de haute affinité avec un haut poids moléculaire supportant des expériences d’imagerie. Cela a permis de détecter les deux récepteurs de la bradykinine (BK; B1R et B2R) ainsi que le récepteur PTH1 de la parathormone (PTH, PTH1R), trois récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Malgré la haute affinité de ces sondes, les applications restent limitées à des systèmes surexprimant le récepteur cible recombinant. Cela s’explique par les deux raisons suivantes : a) la faible abondance des récepteurs endogènes et b) le faible rendement de la fluorescence. 2) La génération de ligands de haut poids moléculaire et la démonstration que ceux-ci avaient toujours une activité pharmacologique pourrait permettre de résoudre une problématique majeure reliée à l’administration thérapeutique de BK. Malgré l’accumulation de preuves du rôle protecteur de la BK sur le système vasculaire, les récepteurs de la BK sont des cibles pharmacologiques quasi inexploitées, car les effets délétères causés par les agonistes de la BK, notamment au niveau de l’inflammation et de la génération de douleur, semblent limiter leur développement. Objectifs : 1) Étudier la pharmacologie de la maximakinine (MK), un analogue de la BK, et le potentiel de ce peptide comme module conférant l’affinité au récepteur B2 dans la conception de ligands biotechnologiques. 2) Générer des protéines de fusion ligands des deux principales familles de GPCRs (A : B2R; B : PTH1R). 3) Utiliser ces protéines de fusion pour permettre la détection de faibles niveaux de récepteurs difficilement détectables par les stratégies conventionnelles. 4) Évaluer l’activité pharmacologique de ces protéines de fusion. Résultats : Deux des trois protéines de fusion PTH générées (PTH-myc et PTHHRP) sont capables de détecter de manière spécifique les niveaux endogènes de PTH1R exprimés par les cellules HOS (ostéosarcome humain) grâce à leur domaine peroxydase intrinsèque ou assemblé. La protéine de fusion PTH-HRP est la plus prometteuse, et peut aussi être utilisée comme ligand non-isotopique dans un essai de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du PTH1R humain. La MK est un agoniste direct du récepteur B2 de rat, mais n’a qu’une affinité marginale pour le récepteur B2 humain. L’essai de contractilité de la veine ombilicale humaine a démontré que la MK était une pro-drogue pour le B2R humain, activée par des peptidases présentes dans ce tissu. La MK ne stimule pas la dégranulation des mastocytes via le récepteur MRGPRX2, malgré sa forte charge positive. Chez le rat, la MK est un agoniste persistant, résistant à la dégradation et de haute affinité pour le B2R. La protéine de fusion fluorescente EGFP-MK est un agoniste spécifique du B2R de rat, mais pas du B2R humain. Des études in vitro ont démontré qu’elle était aussi un agoniste persistant de haute affinité pour le B2R de rat. La protéine de fusion avec domaine peroxydase APEX2-(NG)15-MK permet la détection du récepteur B2 de rat recombinant de manière spécifique et efficace. De plus cette protéine de fusion peut être utilisée comme ligand non-isotopique dans des essais de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du B2R de rat. Il est possible de générer des protéines de fusion contenant la MK agoniste du B2R de rat de très haut poids moléculaire (>66 kDa), mais ceux-ci peuvent avoir une activité pharmacologique limitée par l’encombrement stérique entre la protéine de fusion et le récepteur. Conclusions et perspectives : Il est possible de générer des protéines de fusion avec des domaines enzymatiques agonistes des récepteurs B2 et PTH1. Cela permet une amplification significative du signal émis par les iv protéines de fusion comparativement aux protéines de fusion fluorescentes. La détection des niveaux endogènes de GPCRs par des protéines de fusion pourrait permettre de les utiliser dans des tests diagnostiques. Ces travaux, qui ont démontré qu’il était possible de générer des ligands biotechnologiques de haut poids moléculaire agonistes des principales classes de GPCRs (A et B), pourraient être appliqués aux autres ligands membres de ces familles en accord avec les modèles de liaisons de chaque ligand.

D'après l'étude du Crétacé supérieur du NE du bassin-aquitain (Charentes, France) et du Néogène supérieur du bassin de Sorbas (SE Espagne), les huîtres fossiles peuvent être étudiées à plusieurs échelles. (1) Les assemblages d'ostréidés présentent une grande diversité de géométries spatiales. Leurs accumulations peuvent être soit tridimensionnelles (« intérieur » d'un banc) ou bidimensionnelles, avec l'implantation des organismes à la surface du sédiment. Une analyse taphonomique permet alors de discriminer ces différentes structures d'assemblages d'ostréidés en fonction de leur signification paléoécologique. L'organisation de ces assemblages (géométrie, densité des assemblages...) est bien souvent révélatrice de la dynamique sédimentaire, permet d'identifier des surfaces stratigraphiques remarquables et contribue à l'analyse des corps sédimentaires pour des interprétations séquentielles des milieux de dépôts. (2) Les espèces se répartissent sur un large spectre de milieux où chacune d'entre elles et leurs morphotypes sont inféodés à des conditions environnementales précises. Les nombreux paramètres climatiques et édaphiques contrôlant leur distribution ont ainsi pu être appréhendé (salinité, oxygénation, turbidité, nature du substratum, bathymétrie...). (3) Les coquilles enregistrent les fluctuations environnementales saisonnières via leur croissance accrétionaire. Une étude sclérochronologique et l'analyse de la composition en isotopes stables (C&O) de leurs stries de croissance permet de retrouver ce signal saisonnier. L'étude sclérochronologique permet également d'accéder à l'âge absolu des organismes et ainsi de reconstituer la dynamique des populations. Il est alors possible de quantifier le temps que représente une couche sédimentaire d'ordre annuel à pluriséculaire. L'étude isotopique stable a pu démontrer sur une espèce de Neopycnodonte actuelle que l'enregistrement par la coquille du signal isotopique de l'eau de mer n'était affecté que d'un effet biologique mineur. L'analyse de coquilles du Cénomanien supérieur et du Campanien supérieur témoigne de l'enregistrement d'un signal cyclique de la part des isotopes de l'oxygène démontre la présence d'une saisonnalité pour ces deux périodes.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant. Biologie structurale : Strasbourg 1 : 2008. / Extrait en partie de périodique. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 275-292.