Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 98-115. Publié aussi en version électronique.

L'exploration récente des fonds marins a révélé l'existence d'une vie microbienne abyssale bien plus diverse et abondante que l'état de nos connaissances sur les limites du vivant ne le laissait penser. Ainsi on estime que plus de 60 % de la biosphère subit des conditions de pression jugées a priori défavorable au fonctionnement de la machinerie cellulaire. Ces pressions peuvent atteindre 1000 bars dans les fosses sous-marines les plus profondes. La découverte récente de Pyrococcus yayanosii CH1, premier organisme hyperthermophile et piézophile strict, a relancé la question de l'adaptation aux fortes pressions.Au cours de cette thèse cette question de l'adaptation à la haute pression a été abordée à travers les protéines par l'étude de deux familles enzymatiques, les malate déshydrogénases et les glyoxylate hydroxypyruvate réductases, provenant d'organismes piézophiles et non piézophiles.Les études comparatives associant enzymologie, biophysique et cristallographie des protéines présentées dans cette thèse révèlent des différences de comportements significatives vis à vis de la pression, chez des protéines d'une même famille enzymatique. Nos analyses montrent que ces différences portent sur différents aspects de la dynamique fonctionnelle des protéines. Nous montrons donc ainsi que la pression peut "potentiellement" représenter un paramètre discriminant susceptible de faire l'objet d'une adaptation.Le travail réalisé a permis de poser les bases d'une méthode de comparaison exhaustive des propriétés des protéines vis à vis de la pression afin de détecter les traces d'une adaptation piézophile sur d'autres systèmes protéiques. / The recent discovery of marine biodiversity shows that a large part of the biosphere is a high-pressure environment. The existence of a specific pressure adaptation is still an open question. Recently, the first obligate piezophilic hyperthermophilic microorganism was isolated from hydrothermal vent. This finding suggests the existence of a specific enzyme adaptation with respect to high pressure.To deeper understanding protein adaptation with respect to high pressure, we examine the enzymatic properties of two family enzymes, malate deshydrogenases and glyoxylate hydroxypyruvate reductases arising from piezophilic and non-piezophilic organisms.Using an integrated approach combining enzymology, biophysics and X-ray crystallography, we reveal significantly different behaviors with respect to high pressure. Our analysis show that these differences involved the dynamic component of the enzyme. These results suggest that pressure could be a discriminating parameter susceptible to induce an adaptative response.This thesis work allows to set the foundations of a protein-properties comparative method with respect to high pressure to reveal piezophilic adaptation in other protein systems.

Le laboratoire de Chimie Organique et Photochimie de l’Université Libre de Bruxelles possède une expertise de longue date dans le développement et l’étude de complexes photo réactifs de ruthénium (II) à base de ligands polyazaaromatiques. Il a été démontré au cours des précédentes décennies que leur intéressante photo-réactivité est engendrée par la présence de ligands polyazaaromatiques fortement π-déficients tels que le 1,4,5,8 tétraazaphénanthrène (TAP). Ceux-ci induisent en effet des propriétés d’oxydo réduction singulières à l’état excité du complexe. Un transfert d’électron photo induit est alors rendu possible, lequel peut conduire à la formation de photo adduit avec la biomolécule.Aujourd’hui, de multiples applications utilisant la formation de ces photo-adduits ont d’ores et déjà été développées dans le cadre de stratégies thérapeutiques visant la guanine composant l’ADN. Au cours du présent travail, nous avons contribué à l’expansion du domaine d’application de tels composés photo-réactifs aux peptides et aux protéines, ces derniers constituant des cibles primordiales dans le cadre des stratégies thérapeutiques actuelles.Les deux premiers chapitres de ce travail sont consacrés à l’étude fondamentale de la photo réaction entre le complexe photo-réactif [Ru(TAP)2phen]2+ et certains acides aminés, jugés comme potentiellement réducteurs, à savoir, le tryptophane, la tyrosine et la cystéine. La démonstration d’un transfert d’électron photo-induit ainsi que la formation de photo-adduit sur base de résultats précédemment obtenus au sein de notre laboratoire seront détaillés, et ce pour les acides aminés seuls en solution mais également lorsqu’ils sont inclus au sein d’une chaine peptidique.Le troisième volet de ce projet reprend les premiers résultats de la photo-réaction potentielle entre le complexe [Ru(TAP)2phen]2+ et une protéine. En effet, pour la première fois, une analyse poussée du milieu photo-réactionnel comprenant un complexe photo-oxydant de RuII ainsi qu’une protéine contenant plusieurs résidus tryptophane est décrite. Cette étude préliminaire a permis de démontrer la nécessité d’un vecteur de reconnaissant pour espérer observer la formation de photo-adduit entre complexe photo-oxydant et protéine.Le dernier chapitre se base sur cette observation pour développer de nouvelles stratégies visant à réguler l’activité enzymatique de protéines kinases grâce à l’illumination de complexes photo-oxydants de RuII. Deux méthodologies ont alors été mises en place. La première utilise un ligand mimétique de la staurosporine, inhibiteur naturel de protéines kinases, afin de permettre une reconnaissance directe de celles-ci par le complexe photo réactif. La seconde consiste à fonctionnaliser le complexe [Ru(TAP)2phen]2+ afin de l’ancrer chimiquement sur un peptide inhibiteur de protéine kinase. La combinaison de ces deux entités, à savoir un centre photo-réactif et un peptide vecteur, a permis l’observation d’une inhibition contrôlée par la lumière de protéines kinases. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Depuis que les radicaux libres ont été découverts, leur implication dans certains processus physiologiques, de même que dans une multitude de pathologies, a été mise en évidence. Aussi, plusieurs méthodes ont été mises au point pour mesurer le potentiel antioxydant de molécules d'origine alimentaire, mais aussi pour en découvrir de nouvelles provenant de diverses sources. L'oxydation et la protection contre l'oxydation impliquant plusieurs modes d'action, aussi la qualification du potentiel antioxydant d'une nouvelle molécule demeure problématique. À ce jour, aucune méthode d'évaluation n'est totalement représentative du potentiel antioxydant global d'une molécule donnée; la plupart des méthodes in vitro ne tiennent pas compte du contexte biologique dans lequel les antioxydants seront ultimement utilisés. Aussi, ce document présente une nouvelle méthode originale, à large spectre de sensibilité, réalisé sur des cellules en culture pour détecter et mesurer le potentiel antioxydant de molécules pures ou de mélanges complexes. Cette méthode a été validée dans le cadre de ce projet de maîtrise en l'utilisant conjointement à un autre test couramment cité dans la littérature, à savoir le test ORAC. La méthode a ensuite été utilisée pour mettre en évidence le potentiel antioxydant d'extraits végétaux, plus spécifiquement des extraits de conifères de la forêt boréale. Parmi tous les extraits testés, les extraits de conifères se sont démarqués des extraits d'origine alimentaire (fruits et légumes). De plus, cette méthode originale s'est avérée adéquate pour comparer l'impact de diverses méthodes d'extraction sur le potentiel antioxydant mesuré.

Le récepteur au goût sucré est un hétérodimère composé de 2 sous-unités appelées T1R2 et T1R3. Chaque sous-unité appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G de la classe C. Les membres de cette famille de récepteurs partagent une architecture commune, constituée d’un domaine N-terminal (DNT) de grande taille lié au domaine transmembranaire par une région riche en cystéine. Il a été montré que les DNT de T1R2 et T1R3 de souris étaient capables de lier des sucres naturels (saccharose et glucose) et le sucralose, avec des affinités distinctes et avec différents changements de conformation du domaine induits la fixation du ligand (Nie et al., Curr Biol, 2005). Cependant, les propriétés de liaison du DNT de T1R3 humain, ainsi que la contribution respective des 2 sous-unités dans la fonctionnalité du récepteur restent encore largement méconnues. Lors de cette étude, nous avons exprimé les DNT de T1R3 humain (DNT-hT1R3) et de souris à l’aide de la bactérie Escherichia coli, sous forme de protéines insolubles, appelés corps d’inclusion (CI). Les CI ont été purifiés puis solubilisés en utilisant un agent chaotrope. Le transfert des DNT dans leur état natif par un repliement in vitro, nécessite un criblage des conditions de repliement. Pour cela nous avons utilisé une approche factorielle en faisant varier des facteurs tels que le tampon, le pH ou la présence d’additifs. Les protéines repliées ont ensuite été caractérisées par différentes approches parmi lesquelles l’électrophorèse, la filtration sur gel, la fluorescence et le dichroïsme circulaire. Leur fonctionnalité a ensuite été vérifiée en mesurant les variations de l’intensité de fluorescence intrinsèque des protéines engendrées par l’ajout de sucralose. Le dosage d’Ellman a permis de déterminer la présence d’une seule cystéine libre dans DNT-hT1R3, qui a été confirmée, par purification, puis analyse des peptides trypsiques de la protéine. La présence de structures secondaires a été montrée par dichroïsme circulaire. Afin de caractériser les propriétés de liaison de DNT-hT1R3, un marquage fluorescent a été réalisé en utilisant une sonde sensible à l’environnement greffée de manière covalente à la protéine. Nous avons montré que la fixation d’un ligand sur la protéine marquée provoque des modifications conformationnelles qui ont permis de mesurer l’affinité du DNT de T1R3 pour diverses molécules sapides, avec des affinités en accord avec les données sensorielles. Cette étude a également permis de montrer que le calcium et le magnésium étaient capables de se lier à la protéine. Enfin, les propriétés de liaison de certains ligands ont été validées par microcalorimétrie. Ces résultats montrent que le DNT de T1R3 joue un rôle important, jusqu’à présent insoupçonné dans la reconnaissance des composés sucrés. / The sweet taste receptor is a heterodimer composed of two subunits called T1R2 and T1R3. Each subunit belongs to the class C of G protein-coupled receptors and is constituted by a large extracellular N-terminal domain (NTD) linked to the transmembrane domain by a cysteine-rich region. It has been shown that T1R2 and T1R3 NTDs are both able to bind natural sugars and sucralose with distinct affinities and undergo ligand-dependent conformational change (Nie et al., Curr Biol, 2005). However, the binding properties of T1R3 NTD and the relative contribution of the two subunits to the heterodimeric receptor function remained largely unknown. To characterize the binding properties of each subunit in greater depth a large quantity of proteins is required to use biochemical, biophysical and structural approaches. To accomplish this goal, we took advantage of bacterial expression strategy, which has been successfully used to produce functional mouse T1R2 and T1R3 NTDs (Nie et al., Curr Biol, 2005). Human T1R3 NTD was expressed in high level in Escherichia coli as insoluble aggregated protein (inclusion bodies). Transferring this protein into its native state by in vitro refolding requires screening to find buffer conditions and suitable additives. We established a factorial screen to detect folded functional T1R3 NTD based on intrinsic tryptophan fluorescence quenching by sucralose (known to bind mT1R3 NTD) and identified positive synergistic interactions between additives on refolding of T1R3 NTD. The soluble T1R3 NTD protein was then purified and characterized using electrophoresis, gel filtration, fluorescence and circular dichroism spectroscopy. T1R3 NTD is properly refolded and able to bind saccharide compounds with physiological relevant affinities. As expected, one free thiol could be measured in T1R3 NTD using Ellman’s assay suggesting that except one, all the cysteines are involved in disulfide linkages. This presence of this free cystein was also confirmed by mass spectrometry identification of the fluorescent peptide resulting from trypsin digestion. This free cysteine was used to covalently attach an environmentally sensitive fluorophore. This study also revealed that calcium and magnesium was able to bind T1R3 NTD. Due to the high quantities of functional NTD T1R3, the interactions with some sweeteners were characterized using microcalorimetry. Interestingly, we confirmed that T1R3 NTD is also able to bind numerous sweeteners with physiological affinities, suggesting that T1R3 NTD plays an important role in sweetener recognition.

Le COP9 (Constitutive photomorphogenesis 9) signalosome (CSN) est un complexe multiprotéique contenant huit sous-unités (320 kDa), impliqué dans des processus cellulaires divers allant de la progression du cycle cellulaire, à l'expression des gènes et la réparation de l'ADN, à travers sa fonction au sein du système ubiquitine-protéasome. Il s'agit d'un complexe fortement conservé au cours de l'évolution chez les eucaryotes supérieurs chez qui son activité catalytique est essentielle. Au cours des années d'études biologiques et biochimiques qui ont permis d'élucider le rôle du CSN, sa fonction la mieux étudiée et la mieux comprise est celle liée au contrôle de l'ubiquitylation des protéines (une modification post-traductionnelle qui implique la liaison covalente d'une protéine cible par une molécule d'ubiquitine) par une classe d'E3 ubiquitine ligases. L'activité catalytique du CSN régule spécifiquement les E3 cullin RING ubiquitin ligases (CRLs) via la suppression d'une molécule ressemblant à l'ubiquitine, Nedd8 (cullin-neural precursor cell expressed developmentally downregulated gene 8) des CRLs au cours d'une réaction de déneddylation. Les cycles de neddylation/déneddylation sont essentiels au fonctionnement correct des CRLs et le CSN joue un rôle central dans ce processus à travers sa fonction de déneddylase. Une similarité globale lie le CSN, le chapeau du protéasome (19S) et le complexe elF3 (eukaryotic initiation factor-3). Ces assemblages multi-protéiques comprennent tous six sous-unités contenant un domaine PCI (proteasome COP9 eIF3) et deux sous-unités contenant un domaine MPN (Mpr1–Pad1–N-terminal). L'activité catalytique du CSN est portée par la sous-unité 5, CSN5 qui hydrolyse la liaison isopeptidique entre Nedd8 et la CRL. CSN5 contient un cœur catalytique dépendent d'un zinc et comprenant un motif JAMM (Jab1/MPN/Mov34).L'incorporation de CSN5 dans le CSN révèle son activité isopeptidasique, alors qu'à l'état isolé, CSN5 n'est pas actif. Le travail réalisé au cours de ces trois ans a abouti à cinq aspects principaux qui ont contribué à une meilleure compréhension globale du système CSN. (i) S'appuyant sur la structure du domaine catalytique de CSN5, des études in vitro et in silico ont abouti à l'identification d'un élément moléculaire permettant à CSN5 de passer de la forme inactive à la forme active. Ceci a débouché sur la conception et validation d'un variant constitutivement actif de CSN5. (ii) La capacité de CSN5 à homodimériser a été étudié en solution, in silico et dans des extraits cellulaires et a apporté des perspectives potentiellement intéressantes concernant la fonction de CSN5. (iii) Au-delà de ce travail et pour aborder la question de la régulation de l'activité de CSN5 dans le CSN, la contribution de la sous-unité 6, CSN6 qui interagit directement avec CSN5 a été évaluée et ceci a abouti à l'identification de CSN6 comme sous-unité activatrice de CSN5. (iv) La caractérisation biochimique et biophysique du complexe CSN5-CSN6 a été utilisée pour explorer les bases moléculaires de cette association, non seulement, dans le contexte de son interaction avec Nedd8, mais aussi, de son intégration au sein du CSN, à travers une approche intégrée alliant des techniques biochimiques, structurales, biophysiques et computationnelles. (v) La dernière partie de ce travail est focalisée sur l'activité de maturation du précurseur de Nedd8 par le complexe CSN5-CSN6 mise en évidence in vitro et une exploration préliminaire de cette activité décrite pour la première fois est présentée. En résumé, ce travail a permis d'améliorer la compréhension des déterminants de l'activité et des mécanismes de régulation auxquels la sous-unité catalytique du CSN, CSN5 est soumise. / The COP9 (Constitutive photomorphogenesis 9) signalosome (CSN) is an eight-subunit-containing multiprotein complex (320 kDa) implicated in diverse cellular processes including cell cycle progression, gene expression and DNA repair via its function in the ubiquitin-proteasome pathway. It is a highly evolutionary conserved protein complex in higher eukaryotes for which its activity is essential. Over years of biochemical and biological studies to elucidate the role of the CSN, its most studied and best understood function is linked to the control of protein ubiquitylation (post-translational modification corresponding to the covalent conjugation of an ubiquitin molecule) by a class of E3 ubiquitin ligases. The CSN exhibits catalytic activity to regulate E3-cullin RING ubiquitin ligases (CRLs) by the removal of an ubiquitin-like protein, Nedd8 (cullin-neural precursor cell expressed developmentally downregulated gene 8), from CRLs. Cycles of neddylation/deneddylation are essential for CRL function and the CSN is central in this process through its activity as a CRL deneddylase.Structural and functional similarities link the CSN, the 19S lid of the 26S proteasome and the eukaryotic initiation factor-3 (elF3). These multi-subunit assemblies comprise six PCI (proteasome COP9 eIF3) domain subunits and two MPN (Mpr1–Pad1–N-terminal) domain-containing subunits. The catalytic activity of the CSN is centred on its subunit 5 (CSN5/Jab1), which hydrolyses the Nedd8-CRL isopeptide bond. CSN5 contains a zinc-dependent isopeptidase catalytic centre constituted of a JAMM (Jab1/MPN/Mov34) motif. CSN5 incorporation within the CSN complex unleashes its isopeptidase activity, whereas it remains inactive in isolation. The work presented in this manuscript led to five main findings. (i) Having elucidated the crystal structure of CSN5 catalytic domain, biochemical and in silico investigations that furthered the understanding of CSN5 molecular regulation, led to the identification of a potential molecular trigger enabling CSN5 to be active and the design of a constitutively active CSN5 variant form. (ii) The ability of CSN5 to homodimerise was investigated in solution, in silico and in cellular extracts and brought information that could be important for its function. (iii) Further to that work, to address CSN5 activity within the CSN, the contribution of another CSN subunit, mainly CSN6, shown to interact directly with CSN5 was evaluated and this led to the identification of CSN6 as the CSN5 activating subunit. (iv) The biochemical and biophysical characterisation of the CSN5-CSN6 complex was exploited to explore at the molecular level this complex in the context of its binding to Nedd8 and of its integration within the holo-CSN assembly through an integrated approach that includes biochemical, structural, biophysical and computational techniques. (v) Finally the CSN5-CSN6 complex was shown to be able in vitro to pursue peptidase activity on the Nedd8 precursor protein, pro-Nedd8 by cleaving its C-terminal extension (-G75G76GGLRQ) and preliminary results relating to the exploration of this new activity are presented.Overall this work allowed to gain an in-depth understanding of the activity determinants and of the regulatory mechanisms that the CSN catalytic subunit CSN5 is subjected to.

Les petites GTPases de la famille Arf sont des régulateurs majeurs du trafic cellulaire. Ils participent à presque tous les aspects de ce processus. Il existe cinq familles d'ArfGEFs chez les eucaryotes, responsables de l'activation des Arfs au sein des membranes. Ces Arfs GEFs partagent un domaine Sec7 catalytique conservé mais aussi des domaines de régulation qui interviennent soit dans des interactions avec des protéines ou des interactions avec des membranes. L'un des moyens d'étudier la fonction des Arfs et leur régulation par les ArfGEFs repose sur l'utilisation de l'inhibition par de petiotes molécules chimiques. La BFA est le premier inhibiteur d'ArfGEF à avoir été identifié et a permis d'identifier de nombreuses fonctions du trafic. D'autres composés ont été identifiés par différentes méthodes de criblage mais leur spécificité in vitro reste peu caractérisée, ce qui peut être un obstacle à une bonne interprétation des observations que l'on en fait en Biologie cellulaire. L'objectif de ce travail a été d'évaluer in vitro la spécificité de chaque petite molécule sur un ensemble de famille d'ArfGEFs en solution et pour la première en présence de membranes artificielles. / Small GTPases of the Arf family are major regulators of almost every aspect of membrane traffic in cells. In eukaryotes, five subfamilies of guanine nucleotide exchange factors (ArfGEFs) activate them on different membranes by combining a conserved Sec7 domain, which stimulate the GDP/GTP exchange, and distinct regulatory and membrane binding domains (reviewed in [1]). The identification of the natural compound Brefeldin A as the first known GEF inhibitor, which inhibits Arf functions at the Golgi, established the Arf machinery as model systems to investigate the druggability of small GTPases and their GEFs in diseases. Chemical compounds of unrelated structure have been reported by us and others to inhibit ArfGEF subfamilies. Some of them, recently discovered, remain poorly characterized in vitro, which hampers their use as relevant biological tools. Here, we compared the efficiency and specificity of these inhibitors towards representative members of the major ArfGEF subfamilies using highly purified recombinant proteins reconstituted in artificial membranes.

RésuméLes biosenseurs sont fort utilisés dans beaucoup de domaines, notamment dans celui du diagnostic médical. Ils permettent de détecter, de quantifier et de caractériser des biomarqueurs souvent protéiques. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourrier (FTIR) est un transducteur optique particulièrement bien adapté, par exemple pour la détection des amyloses. Celles-ci sont des maladies (comme la maladie d’Alzheimer, le prion et la maladie de Parkinson) caractériséespar l’agrégation et l’accumulation de protéines qui changent de conformation. Dans ce contexte, l’étude des conformations, grâce à la spectroscopie FTIR qui distingue les structures secondaires des protéines investiguées, est importante pour suivre l’évolution de ces maladies.Notre projet a donc consisté à développer une nouvelle interface pour des biosenseurs par spectroscopie IR, basée sur une stratégie innovante :le greffage de calixarènes. En effet, la fonctionnalisation chimique du matériau de support reste toujours un des principaux défis pourle développement de biosenseurs, car la performance du dispositif en dépend directement. Nous avons choisi de développer le biosenseur sur du germanium, car cet élément est un matériau de support idéal pour l’analyse par spectroscopie FTIR. Voici en quelques lignes une traversée du chemin qui m’a permis de réaliser ce projet.A. Caractérisation des calixarènes greffés par spectroscopie IRLa fonctionnalisation de surfaces via le greffage covalent de calix[4]arènes sur divers supports a été réalisée dans notre laboratoire. Différentes techniques d’analyse ont été utilisées pour la caractérisation des surfaces modifiées (l’électrochimie, la spectroscopie photoélectriqueà rayons X, la microscopie à force atomique, l’éllipsométrie, la spectroscopie UV-VIS). L’adaptabilité de la spectroscopie infrarouge pour la caractérisation des calixarènes greffés est la première vérification réalisée dans le cadre de notre travail. En premier lieu, les spectresd’absorbance IR de nanoparticules d’or portant des calix[4]arènes ont été caractérisés. Ensuite, ces mêmes calix[4]arènes, et d’autres, ont été greffés sur des surfaces de germanium et leurs spectres d’absorbance IR ont été entièrement caractérisés.B. Inhibition des phénomènes d’adsorption non spécifiqueLe greffage de calix[4]arènes sur germanium a été validé par d’autres techniques d’analyse (l’électrochimie, les angles de contact, etc.). Afin d’utiliser cette stratégie innovante dans le cadre de la biodétection, elle doit remplir certains critères, dont l’inhibition des phénomènes d’adsorption non spécifique sur les surfaces. Une diminution de cette adsorption parasite a étéobtenue à plus de 85 % sur germanium.C. Conception du biosenseurUn certain nombre de propriétés validées (la stabilité, la nature et la répartition des groupes fonctionnels, etc.), la stratégie a ensuite montré son intérêt dans le domaine de la biodétection. Une preuve du concept a d’abord été réalisée sur des surfaces de germanium avec un coupled’affinité modèle :la biotine (élément de reconnaissance) et la streptavidine.En parallèle, cette même stratégie a été utilisée pour une reconnaissance du L-tyrosinamide par résonance plasmonique de surface ou par une microbalance à cristal quartz durant un stage de recherche à Grenoble. Pour les deux reconnaissances, l’immobilisation du récepteur a principalement été réalisée via un couplage de type peptidique. D’autres immobilisations ont été réalisées notamment la bioconjugaison d’un dérivé thiol sur une surface calix-maléimide.D. Détection de biomarqueurs liés à la maladie d’Alzheimer Pour valoriser au mieux cette recherche, le biosenseur développé a été utilisé avec succès dans une expérience directement liée à la maladie d’Alzheimer. / AbstractBiosensors are widely used in many fields, especially in that of medical diagnosis. They allow the detection, quantification and characterization of often protein biomarkers.Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) is an optical transducer particularly well suited, for example for the detection of amyloidosis. These are diseases (like Alzheimer's disease, prion and Parkinson's disease) characterized by the aggregation and accumulation of proteins that change their conformation. In this context, the study of conformations, thanks to the FTIR spectroscopy, which distinguishes the secondary structures of the proteins investigated, is important to follow the evolution of those diseases.Our project therefore consisted in developing a new interface for biosensors using the IR spectroscopy, based on an innovative strategy: the grafting of calixarenes. Indeed, the chemical functionalization of the support material still remains one of the main challenges for thedevelopment of biosensors, the performance of the device directly depending on it. We chose to develop the biosensor on germanium, because that element is an ideal support material for analysis by FTIR spectroscopy. Here is in a few lines a reminder of the path that allowed me tocarry out this project.A. Characterization of grafted calixarenes by IR spectroscopyThe functionalization of surfaces via the covalent grafting of calix[4]arenes on various supports was carried out in our laboratory. Different analytical techniques have been used for the characterization of the modified surfaces (electrochemistry, X-ray photoelectricspectroscopy, atomic force microscopy, ellipsometry, UV-VIS spectroscopy). The adaptability of infrared spectroscopy for the characterization of grafted calixarenes is the first verification carried out in our work. First, the IR absorbance spectra of gold nanoparticles bearingcalix[4]arenes were characterized. Then, those same calix[4]arenes, and others, were grafted onto germanium surfaces and their IR absorbance spectra were fully characterized.B. Inhibition of non-specific adsorption phenomenaThe grafting of calix[4]arenes on germanium has been validated by other analytical techniques (electrochemistry, contact angles, etc.). In order to use this innovative strategy for biodetection, it must meet certain criteria, including the inhibition of non-specific adsorptionphenomena on surfaces. A decrease in this spurious adsorption was obtained with more than 85% on germanium.C. Design of the biosensorOnce a certain number of properties (stability, nature and distribution of functional groups, etc.) had been validated, the strategy then showed its interest in the field of biodetection. A proof of concept was first performed on germanium surfaces with a model affinity couple:biotin (recognition element) and streptavidin. In parallel, this same strategy was used for a recognition of L-tyrosinamide by surfaceplasmon resonance or by a quartz crystal microbalance during a research internship in Grenoble. For both recognitions, immobilization of the receptor was mainly achieved via peptide-type coupling. Other immobilizations were carried out, in particular the bioconjugation of a thiolderivative on a calix-maleimide surface.D. Detection of biomarkers linked to Alzheimer's diseaseTo make the most of this research, the biosensor developed was used with success in an experiment directly linked to Alzheimer's disease. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les antibiotiques, et plus particulièrement les β-lactamines, furent pendant longtemps considérés comme l’arme absolue pour le traitement des infections bactériennes, du fait de leur efficacité, leur bonne tolérance et de leur faible coût. Cependant, les bactéries ont développé des mécanismes de résistance, y compris vis-à-vis des β-lactamines possédant le spectre d’activité le plus large, les carbapénèmes. Ces derniers sont considérés comme les antibiotiques de derniers recours pour le traitement des infections sévères à bacilles à Gram négatif en milieu hospitalier. Chez les entérobactéries, cette résistance émergente aux carbapénèmes est principalement due à l’expression d’enzymes appelées les carbapénèmases capables d’inactiver les carbapénèmes. L’émergence exponentielle à l’échelle mondiale de ces entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC) constitue un problème majeur de santé publique. Actuellement, les carbapénémases les plus répandues dans le monde sont les KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), NDM-1 (New Delhi metallo- β- lactamase) et OXA-48 (Oxacillinase). La première KPC a été identifiée en 1996 aux Etats- Unis, NDM-1 en 2009 en Suède chez une patiente en provenance d’Inde et OXA-48 en 2003 en Turquie. En France, les carbapénèmases de type OXA-48 sont largement majoritaires et représentent près de 70% des EPC. Ainsi, le retentissement de leur dissémination et le besoin de développer de nouveaux inhibiteurs capables d’inactiver les carbapénèmases se fait de plus en plus pressante.Cette thèse a pour objectif de mieux comprendre le mode d’ action de ces 3 carbapénèmases d’un point de vue moléculaire et biochimique, afin d’ identifier les éléments structuraux nécessaires à leur fonctionnement, mais aussi de poser les bases du développement de « pan-inhibiteurs » et de nouveaux outils de diagnostics. Pour cela, la caractérisation biochimique des carbapénèmases de type KPC, NDM et OXA-48, de leurs variants naturels et de mutants générés in vitro a été entreprise. Il a pu être mis en exergue l’implication de résidus spécifiques et d’éléments structuraux nécessaires à l’ hydrolyse des carbapénèmes. L ’ étude cristallographique et RMN ainsi que l’étude in silico (modélisation) de ces enzymes et de leurs mutants respectifs, nous a permis de mieux comprendre le mode d’ interaction enzyme- substrat. Nous avons ainsi pu comprendre les bases de la capacité impressionnante de ces carbapénèmases à s’adapter et à évoluer en fonction des pressions de sélections exercées.En collaborations avec différentes équipes de chimistes nous avons développés différentes séries de molécules « pan-inhibiteurs » capables d’inhiber les 3 classes de carbapénèmases. Ainsi nous avons montré un effet inhibiteur de certains composés de la famille des flavonoïdes dont la myrécétine, molécule la plus active. Nous avons également identifié une série de composés, les imidazolines, possédant un effet pan-inhibiteur avec des valeurs de CI50 sub-micromolaires et donc compatible avec une utilisation in vivo.Enfin, nous avons participé au développement (en collaboration avec le CEA) d’ un outil de diagnostic rapide basé sur l’immunochromatographie, permettant détection des EPC en moins de 15 minutes. / Antibiotics, and particularly ß- lactams, have long been considered the ultimate weapon for the treatment of bacterial infections, because of their effectiveness, good tolerance and low cost. However, bacteria have developed mechanisms of resistance, including against β- lactams with the broadest spectrum of activity, carbapenems. The latter are considered as last resort antibiotics for the treatment of severe infections due to Gram negative bacilli in hospital. This emerging resistance to carbapenems in Enterobacteriaceae is mainly due to the expression of enzymes called carbapenemases capable of inactivating carbapenems. The worldwide exponential spread of these carbapenemase-producing enterobacteria (CPE) represents a major public health issue. Currently, the most common carbapenemases in the world are KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), NDM-1 (New Delhi metallo-β-lactamase) and OXA-48 (Oxacillinase). The first KPC was identified in 1996 in the United States, NDM-1 in 2009 in Sweden in a patient from India and OXA-48 in 2003 in Turkey. In France, OXA-48- type are the most abundant carbapenemases with nearly 70% of the EPCs. Thus, the repercussion of their dissemination and the development of new inhibitors capable of inactivating carbapenemases is becoming more and more urgent.The aims of this thesis were to better understand the mode of action of the 3 main carbapenemases from a molecular and biochemical point of view, in order to identify the structural elements necessary for their functioning, but also to lay the basis for the development of "pan-inhibitors" and noveldiagnostic tools. For this purpose, the biochemical characterization of carbapenemases of the KPC, NDM and OXA-48 type, their natural variants and mutants generated in vitro has been undertaken.We could highlight the involvement of specific residues and structural elements necessary for the hydrolysis of carbapenems. The crystallographic and NMR study as well as the in silico (modeling) studies of these enzymes and their respective mutants, allowed us to better understand the enzyme-substrate interaction mode. We could thus understand the basis of the impressive capacity of these carbapenemases to adapt and therefore to evolve according to the selection pressures exerted.In collaboration with several chemists we participated in the development of different series of "pan-inhibitors" that were able to inhibit the 3 classes of carbapenemases. Thus we could show the inhibitory properties of some compounds of the family of flavonoids including myricetin, the most active molecule. We have also been able to identify a series of compounds, imidazolines, possessing a pan- inhibitory effect with sub-micromolar IC50 values and therefore compatible with in vivo use. Finally, we participated in the development (in collaboration with the CEA) of a rapid diagnostic tool based on theimmunochromatographic, allowing the detection of EPCs in less than 15 minutes.

La grande majorité des bactériophages connus ont un virion équipé d'une queue permettant la reconnaissance de l'hôte, la perforation de l'enveloppe bactérienne et l'éjection du matériel génétique viral directement dans le cytoplasme de la bactérie. La famille des Siphoviridae représente 60% des phages caudés et est caractérisée par une queue longue et non-contractile. Le tube de la queue est formé par un empilement de protéine majeur de tube (TTP) polymérisé autour de la protéine vernier (TMP). L'extrémité distale de la queue est équipé d'un complexe de protéine dans lequel se trouve les protéines de liaison au récepteur (RBP). La séquence d'évènement permettant l'éjection de l'ADN et l'infection est encore mal décrite.Au cours de cette thèse, la structure de pb6, la TTP du phage T5 qui s'assemble de façon non-canonique en trimères, a été résolue par cristallographie à une résolution de 2,2 Å. L'analyse de cette structure confirme cependant une homologie structurale de pb6 avec les autres TTPs et avec des protéines bactériennes du système de sécrétion de type VI et des pyocines R. Une étude RMN comparant pb6 dans ses états de monomère et de tube polymérisé est en cours et permettra à terme une description très fine de cet assemblage.De plus, les structures du complexe distal de queue et du tube de la queue (tube de pb6) ont été résolue des résolutions intermédiaires avant et après interaction avec le récepteur bactérien. Ces structures obtenues par cryo-microscopie électronique révèle une absence de changements structuraux au niveau du tube, en contradiction avec le modèle jusque là proposé que la TTP transmettait l'information de fixation du récepteur à la capside.Bien qu'à un stade préliminaire, les reconstructions du complexe distal sont très informatives sur les rôles de protéines pb2 et pb4.L'ensemble de ses données ainsi que des expériences biochimique et la comparaison avec d'autres systèmes bien décrits dans la littérature permet de proposer un nouveau modèle pour les premières étapes de l'infection des Siphoviridae. Ce modèle a également un intérêt pour l'étude du mécanisme d'autres familles de virus (Myoviridae). Les différences, similarité et parenté d'éléments de la queue du phage T5 avec d'autres systèmes de perforation de membrane sont discutés. / The vast majority (96%) of bacteriophages possess a tail that allows host cell recognition, cell wall perforation and safe viral DNA channelling from the capsid to the cytoplasm of the bacterium. Siphoviridae is a familly representing 60% of all tailed phages characterized by a long flexible tail. The tail tube is formed by stacks of hexamers of the tail tube protein (TTP) polymerised around the tape measure protein (TMP). At the distal end of the tail, the tail tip complex harbours the receptor binding proteins (RBP). For these phages, little is known on the mechanism that triggers DNA ejection after binding to the host.We report the crystal structure at 2.2 Å resolution of pb6, an unusual trimeric TTP, of siphophage T5. Structure analysis however confirms the homology of pb6 with all TTPs, related tube proteins of bacterial puncturing devices (type VI secretion system and R-pyocin) and procapsid proteases. We fit this structure into the cryo-electron microscopy map of the tail tube determined at 6 Å resolution. Comparing the structure of the tail tube before and after interaction with the host receptor, we show that unlike previously proposed, the host binding information is not propagated to the capsid by the tail tube, as the two structures, at that resolution, are identical. An ambitious NMR comparative study of the TTP in its monomeric and tube form is underway to further describe this assembly.Moreover, the structures of the tail tip complex prior and after interaction with the bacterial receptor were solved at intermediate resolution. These structures reveal interesting conformationnal changes triggered by the RBP binding to the bacterial receptor. Those rearrangements are the first to occur after phage irreversible binding to its host and they induce the TMP ejection, the capsid opening, the enveloppe perforation and ultimately DNA channeling to the host cytoplasm.Together with biochemical data and comparison with other known system in the litterature we are able to propose a model for Siphoviridae very first steps of infection. These findings might be of interest for the mechanism of other viral familly (notably Myoviridae) and similarity with other membrane perforating systems is discussed.