La vía de señalización celular MEK5-ERK5 se activa en respuesta a un amplio rango de factores de crecimiento y diferentes tipos de estrés. Fosforila los factores de transcripción de la familia MEF2 y juega un relevante papel en el control de la proliferación celular inducida por factores como el EGF, además de controlar la supervivencia celular y la angiogénesis. ERK5 difiere estructuralmente de otras MAP quinasas en presentar una larga y única cola C-terminal. Esta cola tiene un efecto autoinhibitorio sobre la actividad quinasa y presenta un motivo de localización nuclear NLS (sólo accesible en la conformación activa/abierta de la quinasa), además de un dominio de activación transcripcional que interacciona con MEF2D y potencia la actividad transactivadora del factor de transcripción AP-1. Así, ERK5 activa la transcripción de ciertos genes no sólo por la fosforilación directa de factores de transcripción, sino también actuando como coactivador transcripcional de, por ejemplo, el factor AP-1. Previamente en nuestro laboratorio, utilizando la técnica del Tandem Affinity Purification (TAP), se identificó a la chaperona Hsp90β como una putativa proteína que interacciona con ERK5. En este trabajo, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación de las proteínas endógenas y sobre-expresadas, demostramos que ERK5 forma un complejo trimérico con las chaperonas Hsp90β y Cdc37, y que la inhibición farmacológica de Hsp90β o Cdc37 induce la ubiquitinación y degradación proteosomal de ERK5. Estos resultados proponen a ERK5 como una nueva proteína cliente de la chaperonas Hsp90/Cdc37, necesarias para el correcto plegamiento y mantenimiento de la estructura de la quinasa. Por primera vez se muestra que la activación canónica de ERK5 (por MEK5) induce la disociación de Hsp90 del complejo ERK5-Cdc37, como paso previo a la translocación nuclear de ERK5 y la consiguiente activación de la transcripción, por un mecanismo que requiere la autofosforilación de la cola C-terminal de la quinasa. Por otra parte, se ha establecido que la expresión de Cdc37 en exceso (como ocurre en algunos tipos de cáncer) promueve la disociación de Hsp90 del complejo y la translocación nuclear de una forma inactiva de ERK5 capaz de potenciar la actividad transcripcional del factor AP-1. Este resultado constituye la primera evidencia de un mecanismo no canónico de translocación que implica la entrada en el núcleo de una ERK5 inactiva que retiene la capacidad de activar la transcripción mediada por el factor AP-1. También se propone a Hsp90 como una proteína que serviría de anclaje citosólico de ERK5. Por otra parte, se han obtenido evidencias que muestran que tanto la activación canónica (MEK5) como no canónica (Cdc37) inducen la SUMOilación de ERK5 en el extremo N-terminal de la proteína. Mediante ensayos bioquímicos y de inmunofluorescencia aportamos evidencias que apuntan a que tanto la disociación de Hsp90 como la SUMOliación son eventos necesarios pero no suficientes per se para que ocurra la translocación nuclear de ERK5. Se han generado líneas celulares que sobre-expresan establemente ERK5 y/o Cdc37, que muestran que ambas proteínas cooperan en promover un drástico incremento en la proliferación y la migración celular. Este resultado es relevante dado que la sobreexpresión de ERK5 como Cdc37 son eventos que ocurren en ciertos tipos de cáncer, como el adenocarcinoma prostático. Por último, mostramos que ERK5 interacciona con el receptor de andrógenos (AR) en el citosol de las células en reposo, y que la activación de este receptor con ligandos induce la translocación de AR y ERK5 inactiva al núcleo, donde siguen interaccionando y colaboran en la promoción de la actividad transcripcional del AR sobre la proteína antígeno prostático (PSA, biomarcador clínico especifico del cáncer de próstata). Se ha observado otro link funcional entre ambas proteínas, ya que la activación de ERK5 por MEK5 o la sobre-expresión de Cdc37 incrementan la actividad ligandodependiente del receptor de andrógenos, mientras que el silenciamiento de la ERK5 celular bloquea dicha activación transcripcional. / The MEK5-ERK5 signaling pathway is activated in response to growth factors and different forms of stress. ERK5 phosphorylates the transcription factors, members of the myocyte enhancer factor family, MEF2 and plays an important role in the control of cell proliferation induced by factors such as EGF, as well as control of cell survival and angiogenesis. In contrast with other MAPKs, ERK5 has a unique C-terminal tail. This domain auto-inhibits the kinase activity and has a nuclear localization signal (NLS) (only available in the active/open conformation), moreover contains a transcriptional activation domain that interacts with MEF2D and enhances the activity of the AP-1 transcriptional complex. Thus, ERK5 is able to activate transcription not only by direct phosphorylation of transcription factors but by acting itself as a transcriptional coactivator, as, for example, in the case for the activator protein 1 (AP-1) transcription factor. Previously in our laboratory using the technique of Tandem Affinity Purification (TAP), we identified the chaperone Hsp90β as a putative interacting protein ERK5. In this study, using co-immunoprecipitation assays of endogenous and recombinant proteins, we demonstrated that ERK5 forms a trimeric complex with Hsp90β and Cdc37, and the pharmacological inhibition of Hsp90 and Cdc37 induces ubiquitination of ERK5 prior to degradation at the proteasome. These results suggest that ERK5 is a novel client protein of the chaperone Hsp90/Cdc37, and these chaperones are necessary to maintain the proper folding and structure of the kinase. For the first time we show that the canonical activation of ERK5 (by MEK5) induces the Hsp90 dissociation from the ERK5-Cdc37 complex, leading to ERK5 nuclear translocation and activation of transcription, by a mechanism which requires the autophosphorylation at its C-terminal tail. Moreover, the overexpression of Cdc37 (as in some types of cancer) promotes Hsp90 dissociation and the nuclear translocation of a kinase-inactive form of ERK5 which retains transcriptional activity. This is the first example showing that ERK5 transcriptional activity does not require kinase activity. We propose that Hsp90 might be the cytosolic anchor of ERK5. Moreover, we show that both the canonical activation canonical (MEK5) as noncanonical (Cdc37) induce the ERK5 SUMOylation at its Nterminal half. The biochemical and immunofluorescence assays provided evidence that both the Hsp90 dissociation as the ERK5 SUMOylation are necessary but not sufficient per se to induce ERK5 nuclear translocation. We generated stable cell lines that over-express ERK5 and/or Cdc37, we showed that both proteins cooperate to promote a dramatic increase in cell proliferation and migration. This result is important because overexpession of ERK5 and Cdc37 are events that occur in certain types of cancer, including prostate adenocarcinoma. Finally, we show that ERK5 interacts with the androgen receptor (AR) in the cytosol of resting cells, and that activation of this receptor with ligands induces the nuclear translocation of AR and inactive ERK5, and in this cellular compartment they continue interacting and promoting the transcriptional activity of AR through PSA (PSA specific clinical biomarker for prostate cancer). It has been observed another functional link between these proteins, and that activation of ERK5 by MEK5 or overexpression of Cdc37 increase ligand-dependent activity of the androgen receptor, whereas the silencing of ERK5 inhibits this transcriptional activation.

Resum Mutacions en els gens de les presenilines (PS: PS1 i PS2), el component catalític del complex γ-secretasa, són la principal causa d'Alzheimer familiar hereditari (FAD). Evidències recents demostren que mutacions associades a FAD produeixen una reducció del processament per PS/γ-secretasa de diversos substrats, suggerint un mecanisme de pèrdua de funció d´aquestes mutacions. De fet, la inactivació genètica d'ambdues PS en el cervell adult causa dèficits en la plasticitat sinàptica i memòria, i neurodegeneració. Durant el desenvolupament embrionari, la inactivació de PS1 indueix canvis en la neurogènesi i la mort prematura probablement degut, almenys en part, a alteracions en la via de senyalització de Notch. Malgrat això, el paper de la PS1 i/o l´activitat γ-secretasa i els mecanismes moleculars regulats per aquests durant els processos de diferenciació neuronal, tals com el creixement axonal i dendritic i la formació de sinapsis, en gran part es desconeixen. Un dels principals esdeveniments durant la maduració neuronal és el creixement de l´axò, un procés necessari per establir connexions sinàptiques adequades pel funcionament dels circuits neuronals. La família de proteïnes Rho GTPases regulen la polarització neuronal i el creixement de l'axó. Per altra banda, els receptors tirosina quinasa d´efrina (Eph) regulen el creixement i la guia axonal durant la maduració neuronal. L'activació dels receptors Eph indueix el col·lapse del con de creixement i la retracció axonal a través de l'activitat RhoA. L´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha sigut investigar el paper de PS1/γ-secretasa durant el creixement axonal, així com els mecanismes moleculars implicats en aquesta regulació. Els resultats obtinguts demostren que la inactivació genètica de PS1 en ratolins indueix una reducció del creixement axonal en la regió ventricular i en l'hipocamp. En el mateix sentit, la inactivació genètica o farmacològica de l'activitat PS1/γ-secretasa indueix una reducció significativa del creixement axonal en neurones hipocampals en cultiu. De fet, la inactivació de PS/γ-secretasa incrementa l'activitat de RhoA GTPasa causant defectes en l'elongació de l'axó, un efecte que és revertit a l´inhibir RhoA o la seva proteïna efectora ROCK. A més, en aquest treball descrivim per primera vegada que PS1 col·localitza amb el receptor EphA3 en els axons de neurones hipocampals, i que PS1/γ-secretasa regula el processament d´EphA3 de forma constitutiva i independent de lligand, essent aquest processament necessari per al creixement axonal. A més, demostrem que la generació del fragment intracel·lular EphA3 ICD per PS/γ-secretasa, és clau per al creixement axonal, de manera que un mutant de EphA3 que perd la capacitat de ser proteolitzat no reverteix els defectes del creixement axonal causats per la inactivació de PS1. Per contra, l'expressió d'EphA3 ICD rescata el creixement axonal en neurones hipocampals deficients en PS/γ-secretasa o EphA3. A més, l'expressió d'EphA3 ICD disminueix l'activitat RhoA GTPasa, a la vegada que interacciona amb les miosines Ib i IIa, proteïnes que són clau en la regulació de l´organització del citoesquelet axonal en el con de creixement. Per tant, els nostres resultats demostren que la PS1/γ-secretasa juga un paper essencial durant creixement axonal en neurones hipocampals a través de la regulació de les vies de senyalització d´EphA3 i RhoA. / Mutations in the Presenilin genes (PS: PS1 and PS2), the catalytic component of the γ-secretase complex, are the main cause of familial Alzheimer’s disease (FAD). Recent evidences show that FAD-linked mutations induce a reduction of PS/γ-secretase processing of several substrates, suggesting a loss-of-function mechanism in this mutations. In fact, the genetic inactivation of both PS in adult brain induces synaptic plasticity and memory deficits, and neurodegeneration. In developmental stages, inactivation of PS1 induces alterations in neurogenesis and premature death of the embryos, partially, due to alterations in the Notch signaling pathway. However, the role of PS1 or the γ-secretase activity and the molecular mechanisms regulated during the neuronal differentiation, such as axonal and dendritic elongation and synapse formation, are widely unknown. Axon elongation, a process necessary for the establishment of functional synaptic connections in the neural circuitry, is one of the main events during neuronal differentiation. Rho GTPase family proteins regulate neuronal polarization and axon elongation. On the other hand, ephrin tyrosine kinase receptors (Eph) regulate the elongation and axon growth during neuronal differentiation. Activation of Eph receptors induces the growth cone collapse and axonal retraction through the RhoA activity. The objective in this doctoral thesis has been to investigate the role of PS1/γ-secretase during the axonal elongation, and the molecular mechanisms involved in this pathway. Our results show that genetic inactivation of PS1 in mice induces a significant reductions of the axon growth in primary hippocampal neurons. In fact, the inhibition of PS/γ-secretase induces an increase in RhoA GTPase activity, which in turn causes elongation defects in the axon, an effect reverted by RhoA or ROCK effector protein inhibition. Moreover, in this thesis we describe for the first time the colocalization of PS1 and EphA3 receptor in the axons of hippocampal neurons, where PS1/γ-secretase regulates the constitutive and ligand-independent processing of EphA3, a mechanism necessary for axonal growth. Furthermore, we demonstrate that generation of the intracellular fragment of EphA3 (EphA3 ICD) is a key event for axonal growth, where processing-defective EphA3 mutants are not able to rescue axonal growth defects caused by PS1 inactivation. Otherwise, expression of EphA3 ICD induces a decrease of RhoA GTPase activity, which in turn interacts with myosin-IB and myosin-IIA key proteins for the reorganization of the axon cytoskeleton in the growth cone. Therefore, our results indicate that PS1/γ-secretase has an essential role during axonal growth in hippocampal neurons by regulating EphA3 and RhoA signaling pathways.

El meu projecte de doctorat s’enmarca en l’estudi de l’estructura i la funció de les ribonucleases antimicrobianes humanes. Actualment, es coneixen vuit ribonucleases humanes funcionals pertanyents a la superfamília de ribonucleases secretades per vertebrats. Cal remarcar, que alhora de la seva activitat per a hidrolitzar àcids ribonucleics, també presenten altres propietats biològiques com l’activitat antimicrobiana, que suggereixen una possible funció ancestral relacionada amb el sistema immunitari. La proteïna catiònica d’eosinòfils (ECP) és un dels components majoritaris dels grànuls secundaris dels eosinòfils. Degut al seu gran nombre d’arginines l’ECP és una proteïna molt catiònica i presenta una elevada activitat antimicrobiana vers una gran diversitat de patògens, com bacteris, helmints i protozous. En el nostre laboratori hem estudiat extensament el mecanisme antimicrobià de diverses ribonucleases. Concretament, el treball desenvolupat en aquesta tesi ha permès: i. Identificar el farmacòfor de l’ECP mitjançant eines de minimització racional de l’estructura. ii. Analitzar els canvis que es produeixen a la superfície bacteriana com a conseqüència de l’acció de l’ECP i dels seus pèptids derivats. Principalment, en detallar com aquests interaccionen amb els lipopolisacàrids de la paret bacteriana. iii. Descobrir que l’agregació amiloid de l’ECP a la superfície de les bactèries és fonamental per a la seva acció antimicrobiana i, en concret, per la seva activitat d’aglutinació. iv. Identificar factors estructurals i de seqüencia en el domini N-terminal necessaris per l’acció antimicrobiana de les ribonucleases conservats durant l’evolució. v. Caracteritzar els elements seqüencials de les ribonucleases que determinen les propietats antimicrobianes i d’aglutinació mitjançant el disseny de proteïnes híbrides entre les ribonucleases 2 i 3 (EDN i ECP respectivament). vi. Descobrir que tant l’ECP com la ribonucleasa 7 presenten activitat vers micobacteris a través d’un mecanisme similar a l’exibit enfront de bacteris gram negatius. En conclusió, els resultats obtinguts en aquesta tesi ens permeten conèixer millor com les ribonucleases contribueixen a l’eliminació de diferents patògens del nostre organisme i ens obren noves vies pel disseny de nous agents terapèutics per combatre microorganismes patògens. / My PhD project focuses on the structure-function analysis of human antimicrobial RNases, Currently eight functional members have been ascribed to the vertebrate secreted RNase superfamily. Together with their catalytic activity towards RNA substrates, other biological properties have been reported such as the antimicrobial activity of diverse members of the family, therefore suggesting that RNases could have an ancestral host-defence function. The eosinophil cationic protein (ECP) is one of the major components of the secondary granules of human eosinophils. ECP is a highly cationic arginine-rich protein, which displays a high antimicrobial activity against pathogens, such as bacteria, helminths and protozoa. In our laboratory the antimicrobial mechanism of action of several RNases has been extensively studied. In particular, this work enables us to determine: i. Identify the protein pharmacophore by rational structure minimization. ii. Explore the effects that take place at the bacterial cell wall upon protein-interaction. Concretely, highlight the crucial role of the lipopolysaccharide molecule in the mechanism of action of ECP, and their N-terminal peptides. iii. Determine that the amyloid formation at the bacterial surface is crucial for the antimicrobial activity of the protein, and in particular, due to the agglutinating activity. iv. Prove that the sequence and structural determinants of RNases are evolutionary conserved at the N-terminal domain. v. Characterize the sequence and structural determinants required for antimicrobial and agglutinating activities Through RNase rational mutagenesis of the homologous RNases 2 and 3 (EDN and ECP respectively) vi. Discover that either ECP or RNase 7 present antimycobacterial activity trough a similar mechanism as proved against Gram-negative bacteria. In conclusion, the results presented in this thesis work enable us to better understanding of how RNases contribute on the host pathogen clearance and open a new window in order to the design and develop new therapeutic agents as alternative antibiotics.

Aquesta tesi s’emmarca dins d’un projecte d’investigació més general que té per objectiu caracteritzar i estudiar la funció de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals. La CK2 és una Ser/Thr quinasa present a tots els eucariotes estudiats fins al moment. Estudis fets en diversos eucariotes han evidenciat la importància d’aquesta quinasa en el creixement i en el control del cicle cel·lular, no obstant, les vies de senyalització en que participa aquesta quinasa encara no estan caracteritzades per complet. Al primer capítol d’aquesta tesi es descriu per primera vegada la involucració de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis en la via de senyalització de les auxines, en particular, del transport d’auxina. En plantes, la fitohormona auxina és la principal reguladora del creixement cel·lular. Recentment s’ha demostrat que la distribució asimètrica de l’auxina en els diferents òrgans de la planta és essencial per al desenvolupament vegetal i, aquesta distribució depèn principalment del transport polar de l’auxina. Per dur a terme aquesta investigació hem utilitzat un mutant dominant negatiu de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis thaliana (la línia CK2mut); aquest mutant té uns trets fenotípics que estan lligats a alteracions en processos dependents d’auxina, com són la inhibició del creixement de l’arrel principal, l’absència d’arrels laterals i el fenotip wavy. No obstant, s’ha comprovat que la percepció de l’auxina no està afectada ja que les plantes CK2mut responen al tractament exogen amb aquesta hormona. Hem demostrat que aquest mutant no té defectes en la síntesi de l’auxina, però si en el transport d’aquesta hormona. Eliminant l’activitat CK2 utilitzant eines genètiques (línia CK2mut) i eines farmacològiques (tractament amb TBB, un inhibidor específic de la CK2) hem demostrat que hi ha anomalies en la formació dels gradients d’auxina i canvis en l’expressió de gens relacionats amb les auxines; en particular, en membres de la família de transportadors de sortida d’aquesta hormona cap a l’exterior cel·lular (PINs) i en la proteïna quinasa PINOID (PID). Aquestes proteïnes són reguladores dels fluxos d’auxina. Estudis fets amb plàntules PIN4::PIN4-GFP i PIN7::PIN7-GFP han permès detectar que l’eliminació de l’activitat CK2 provoca l’acumulació d’aquestes proteïnes en vesícules endosomals. La formació de vesícules endosomals va fer pensar que la CK2 tenia algun paper en la via de tràfic vesicular d’aquests transportadors, i aquest ha estat el tema d’estudi del segon capítol d’aquesta tesi. S’han emprat diversos inhibidors de diferents punts de la via de tràfic vesicular per tal de poder discriminar a quin punt d’aquesta via actua la CK2. Aquests experiments s’han realitzat utilitzant plantes PIN7::PIN7-GFP i utilitzant com a model les plantes PIN1::PIN1-GFP, ja que PIN1 és el transportador d’auxina més ben caracteritzat. Amb el tractament amb tyrphostin A23 hem observat que les vesícules endosomals que es formen per eliminació de l’activitat CK2 estan revestides de clatrina. Amb els tractaments amb brefeldin A (BFA) i wortmannin hem determinat que la CK2 actua en algun punt de la via d’endocitosi diferent al d’aquests inhibidors. S’ha detectat que aquests endosomes no es tenyeixen amb el colorant específic de lípids FM4-64 i que són més grans que els endosomes obtinguts pel tractament amb BFA. Per últim, el tractament amb cicloheximida ens ha permès observar dos efectes: el primer és que la formació d’endosomes no depèn de la síntesi de proteïnes de novo i el segon, és que la inhibició de la CK2 no compromet la degradació al vacúol d’aquestes proteïnes. Així doncs, amb els resultats obtinguts podria ser que l’eliminació de la CK2 provoqués la formació d’endosomes sorting nexin aberrants, indicant així, que aquesta quinasa estaria intervenint en la via del retròmer. / This thesis is involved in a more general project that aims to characterise and study the protein kinase CK2 in vegetal systems. Protein kinase CK2 is a pleiotropic Ser/Thr kinase and evolutionary conserved in eukaryotes. Studies performed in different organisms, from yeast to humans, have highlighted the importance of CK2 in cell growth and cell-cycle control. However, the signalling pathways in which CK2 is involved have not been fully identified. The first chapter of this thesis involves for first time the protein kinase CK2 in the auxin signaling pathway. In plants, the phytohormone auxin is a major regulator of auxin cell growth. Recent discoveries have demonstrated that differential distribution of within plant tissues is essential for developmental processes, and that this distribution is dependent on polar auxin transport. We report here that a dominant-negative mutant of CK2 (CK2mut) in Arabidopsis thaliana shows phenotypic traits that are typically linked to alterations in auxin-dependent processes. However, CK2mut plants exhibit normal responses to exogenous indole-3-acetic acid (IAA) indicating that they are not affected in the perception of the hormone, but upstream in the pathway. We demonstrate that mutant plants are not deficient in IAA but are impaired in its transport. Using genetic and pharmacological tools we show that CK2 activity depletion hinders correct formation of auxin gradients and leads to widespread changes in the expression of auxin-related genes. In particular, members of the auxin efflux carrier family (PINs), and the protein kinase PINOID, both key regulators of auxin fluxes, were misexpressed. PIN4 and PIN7 were also found mislocalized, with accumulation in endosomal bodies. The endosomal bodies formation lead to think that CK2 has a role in vesicular traffic pathway of these carriers and this was the topic of the study of the second chapter of this thesis. We have used several inhibitors in order to identify the point of the pathway in which acts the CK2. We performed these experiments using both PIN7::PIN7-GFP and PIN1::PIN1-GFP as a model, because PIN1 is the carrier more characterized. The tyrphostin A23 treatment reveals that these endosomal vesicles formed by the CK2 inhibition are clathrin coated. The brefeldin A and wortmannin treatments have determined that CK2 acts in a different point of the pathway than these inhibitors. We have detected that the endosomal bodies obtained by CK2 inhibition are not stained by FM4-64 dye and are enlarged compared with the endosomes obtained by the BFA treatment. Finally, the cicloheximide treatment has allowed observing two effects. The first is that the formation of endosomes does not depend on de novo protein synthesis. The second one is that CK2 inhibition does not compromise the degradation of the PIN proteins in the vacuole. Therefore, our results seem to indicate that inhibition of CK2 entails the formation of aberrant sorting nexin endosomes, which may lead to think that this kinase would be involved in the retromer complex.

Las fórmulas infantiles desempeñan un papel indispensable sobre todo después de 4 a 6 meses de vida de un recién nacido ya que la leche materna ya no es suficiente para satisfacer todas las necesidades nutricionales a esta edad. Aunque las fórmulas infantiles deben ser similares a la leche materna madura en términos de sus macronutrientes y micronutrientes, por lo general no tienen, ni cualitativa ni cuantitativamente, los ingredientes funcionales que se encuentran en la leche humana, ni tienen la misma composición de proteínas y la diversidad de oligosacáridos de la leche materna. Por lo tanto, es muy importante agregar estos ingredientes de las fórmulas infantiles. La evolución en la composición las fórmulas infantiles con mejoras en sus procesos de fabricación permiten ejercer más efectos positivos en un grupo grande de los recién nacidos que no pueden ser alimentados con leche materna como fuente primaria por distintas causas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio ha sido evaluar la funcionalidad de lactoferrina humana recombinante (rhLf), hidrolizada de rhLf y GOS en las fórmulas infantiles. A este fin, el estudio se dividió en cuatro experimentos: 1. Objetivos de la tesis 1. Evaluación in vitro de la biodisponibilidad del hierro de las fórmulas infantiles suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS, usando la cantidad de ferritina sintetizados por las células Caco-2 como criterio. 2. Evaluación in vitro del efecto anti-inflamatorio de diferentes concentraciones de rhLf y el hidrolizado de rhLf. 3. Evaluación in vitro de la actividad prebiótica de rhLf y/o GOS. 4. Evaluación in vitro del efecto de la digestión simulada in vitro sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga (LCFAs). 2. Metodolgía 1. Diseño de fórmulas infantiles con la suplementación de rhLf y/o GOS con leche materna madura como un modelo. 2. En la digestión simulada in vitro de muestras suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS para determinar la (bio)-disponibilidad del hierro de fórmula infantil mediante células Caco-2 (Frontela et al., 2009). Un kit de ELISA se usa para cuantificar la ferritina formada por las células la que se utiliza como un criterio de la disponibilidad de hierro. 3. En la digestión simulada in vitro de las muestras, los digeridos obtenidos se guardaron para investigar el efecto in vitro de la digestión sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga mediante el análisis de western blot, HPLC-masas y GC. 4. Para investigar los efectos anti-inflamatorios de rhLf y el hidrolizado de rhLf, se utilizaron dos tipos de células Caco-2 y RAW 264.700 (Tanoue et al., 2008) y con el estímulo de las células de RAW 264.700 por el lipopolisacárido (LPS) (de la Escherichia coli). En este modelo, el efecto del LPS en la monocapa de células y el efecto anti-inflamatorio de rhLf y el hidrolizado de rhLf pueden visualizarse utilizando la determinación de algunos parámetros: TEER, ROS, IL-8 y NO. 5. Para investigar el efecto prebiótico de rhLf y/o GOS mediante cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación, se midieron algunos parámetros como el pH y los ácidos grasos de cadena corta. 3. Conclusiones y trabajo del futuro 1. Además de los transportadores específicos de hierro hemo y no-hemo para la absorción de hierro en las células duodenales, se ha demostrado que rhLf tiene un sitio específico para la absorción de formas ferrosos y férricos de hierro. Los resultados obtenidos del estudio llevado a cabo con células Caco-2 modelo confirmó la importancia de la suplementación de las fórmulas infantiles con Lf y GOS que llevó a aumentar ferritina formada por los cultivos celulares. Los resultados confirmaron que la solubilidad no es el único factor correlacionado con la mejora de la biodisponibilidad del hierro, por lo tanto, es útil investigar el papel de algunos genes relacionados con la biodisponibilidad del hierro como DMT1. 2. rhLf y su hidrolizado ejercen su actividad anti-inflamatoria a través de su capacidad para unirse a LPS y posteriormente modular la producción de citoquinas. El mecanismo de acción de Lf también depende en gran medida de su capacidad para influir en las respuestas tempranas, incluyendo la modulación de la producción de ROS intracelular. La actividad anti-inflamatoria de rhLf y el hidrolizado de rhLf, esta última se ha mostrado más eficaz y es considerado como un destacado agente terapéutico que se debe tener en cuenta durante el diseño de las fórmulas infantiles. 3. Los resultados del estudio llevado a cabo con cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación ha mostrado que tanto la rhLf y/o GOS influyen en la obtención de productos finales de fermentación como los ácidos grasos de cadena corta, este proceso fermentativo además lleva a la disminución de bacterias patógenas y de forma complementaria el incremento de las bacterias bifidogénicas. 4. Los resultados obtenidos confirmaron que rhLf es más estable que Lf humana, por lo que se considera un factor importante para la suplementación de las fórmulas infantiles. Aunque se necesitan estudios complementarios para descubrir y detectar esta característica, los resultados propuestos un papel de GOS a proteger Lf contra las enzimas digestivas. Del mismo modo, los resultados obtenidos confirman la importancia de la lactancia materna relacionada a los ácidos grasos liberados por la digestión. 5. En conjunto, los resultados obtenidos confirman y apoyan la urgente necesidad de suplementación con Lf y/o GOS de las fórmulas infantiles. Los resultados demostraron la importancia del hidrolizado de rhLf como un nuevo aditivo y puede ser en un futuro próximo nuevas fórmulas contienen el hidrolizado de rhLf será visto en los mercados. / Infant formulas, as milk substitute, play an indispensable role especially after 4-6 months of infant life where human milk is no longer sufficient to meet all necessary nutritional requirements. Although infant formulas should be similar to mature human milk in terms of its macronutrients and micronutrients, normally it do not have the functional ingredients that are found in human milk, nor do they have the same protein composition and the diversity of oligosaccharides as human milk. So it is critically important adding these ingredients to infant formulas. This evolution of infant formulas manufacturing allow to exert more functionalities in a large group of infants who cannot feed human milk as a primary source and for several physiological as well as social reasons. For mimicking the structure of human milk, galactooligosaccharides (GOS, as prebiotic) and recombinant human lactoferrin (rhLf) are strongly added to infant formulas to obtain similar functionalities for what human milk has. Thus, the present study is aimed to explore the functionality of rhLf, rhLf hydrolysate and GOS whether alone or added in infant formulas. The present study is divided into four experiments: 1. Objectives of the PhD Thesis 1. In vitro assessment of the bioavailability of iron from infant formulas supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS, using the amount of ferritin synthesized as criteria 2. In vitro evaluation of the anti-inflammatory effect of different concentrations of rhLf and rhLf hydrolysate. 3. In vitro evaluation of the prebiotic activity of rhLf and/or GOS. 4. In vitro evaluation of the effect of simulated gastrointestinal digestion on the added rhLf fractionation and long chain fatty acids (LCFAs) profile. 2. Methodology 1. Design of infant formulas with the supplementation of rhLf and/or GOS with mature human milk as a model. 2. In the in vitro simulated digestion of samples supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS aimed to determine the (bio)-availability of iron of infant formula by using Caco-2cell model (Frontela et al., 2009). An ELISA kit for the analysis of ferritin formed by the cells which is used as a criterion of the availability of iron. 3. In the in vitro simulated digestion of supplemented samples, the digests were kept to investigate the effect of the in vitro digestion on the fractionation of rhLf and the profile of the long-chain fatty acids by using the western blot, HPLC-mass and GC. 4. To investigate the anti-inflammatory effects of rhLf and rhLf hydrolysate, it were used two types of cells are Caco-2 and RAW 264.7 (Tanoue et al., 2008) and with the stimulation of the RAW 264.7 cells by lipopolysaccharide (LPS) (from Escherichia coli). In this model, the effect of LPS on the monolayer of cells and the anti-inflammatory effect of rhLf and rhLf hydrolysate and can be viewed using the extent of some parameters: TEER, ROS, IL-8 and NO. 5. To investigate the prebiotic effect of rhLf and/or GOS by using batch fermentation culture system, some parameters were measured as pH and short-chain fatty acids. 3. Conclusions and future work 1. Beside heme and non-heme specific transporters for the absorption of iron in duodenal cells, it has been proved that rhLf has a specific site for the absorption of ferrous and ferric forms of iron. The obtained results of the study carried out using Caco-2 cell model confirmed the importance of the supplementation of infant formulas with rhLf and GOS where it led to increase ferritin formed by cell cultures. The results confirmed that solubility is not the only factor correlated with improvement of iron bioavailability, therefore it is useful investigate the role of some genes related with iron bioavailability such as rhLf hydrolysate exert their anti-inflammatory activity through its ability to bind LPS and subsequently modulate cytokine production. The mechanism of Lf’s action is also largely dependent on its ability to influence early responses, including the modulation of intracellular ROS production. Between rhLf and rhLf hydrolysate, rhLf is more effective and is considered a prominent therapeutic agent, which must to be taken into account during infant formulas design. 2. The results of study carried out using batch culture fermentation system proposed that rhLf and/or GOS influenced the fermentation end products such as SCFAs. This fermentation process lead to a decreasing of the pathogenic bacteria and complementary an increase of the bifidogenic ones. 3. The obtained results confirmed that rhLf is more stable than human Lf and thus it is considered a prominent factor for infant formulas supplementation. Although many studies are needed to discover this characteristic, the results proposed a role for GOS in protect rhLf against the digestive enzymes. Likewise, the results confirmed the importance of the breastfeeding pattern concerning with the released free fatty acids by digestion. 4. Overall, the obtained findings confirm and support the urgently need to supplementation with rhLf and/or GOS of infant formulas. The results demonstrated the importance of the hydrolysate of human recombinant lactoferrin as a new additive and may be in the near future new formulas contain the hydrolysate of rhLf will be seen in the markets.

En l’actualitat, la industria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d’elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar l’activitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d’aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa a l’ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, entre les que es troba la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules en cultiu, degut a l’activació del procés de mort cel·lular programada o apoptosi. La principal causa de l’activació d’aquest tipus de mort cel·lular és l’esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l’acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula al llarg del cultiu. L’apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i, en conseqüència, la productivitat del bioreactor. En aquest treball, s’han utilitzat cèl·lules murines d’hibridoma KB26.5 productores de la immunoglobulina IgG3, transfectades amb el gen bhrf1 i s’ha comprovat com aquesta modificació és capaç de reduir el nivell de mort per apoptosi, i garantir la supervivència de les cèl·lules durant un període on hi ha una situació d’inducció a l’apoptosi. Aquesta capacitat s’ha observat en dos sistemes de cultiu cel·lular com són el discontinu i la perfusió. Aquest últim sistema de cultiu s’ha posat en evidència que, a més de conferir una major resistència a la mort cel·lular, BHRF1 afecta al cicle cel·lular tant sols en els moments de limitació de nutrients. Aquestes observacions han portat a estudiar els efectes intracel·lulars de BHRF1 per entendre com l’expressió d’aquest gen víric era capaç de produir aquests efectes fenotípics. S’ha determinat que BHRF1 no es limita tant sols a l’aturada de l’apoptosi a nivell mitocondrial, sinó que és capaç d’influir en diverses rutes que intervenen en processos vitals per la cèl·lula. Les anàlisi realitzades amb microarrays de DNA han revelat la capacitat de BHRF1 d’induir de forma diferencial l’expressió de gens relacionats amb l’apoptosi, el cicle cel·lular, la ruta Akt/mTOR i la via de JNK. A més, estudis realitzats mitjançant PCR en temps real han indicat que, tant sols en condicions inductores de l’apoptosi, es produeix una sobreexpressió de bcl2 en les cèl·lules KB26.5 transfectades amb el gen bhrf1, indicant que hi ha una relació entre les dues proteïnes codificades per aquests gens. Per tal de veure els efectes de la sobreexpressió de bcl2 s’han utilitzat inhibidors químics específics per la proteïna Bcl-2. Com a resultat s’ha anul·lat la resistència a l’apoptosi per part d’aquelles cèl·lules amb expressió de BHRF1. La sobreexpressió de bcl2 es pot relacionar, a més, amb l’aturada observada del cicle cel·lular en la fase G1. La relació entre BHRF1 i Bcl-2 no s’ha constatat a través d’una interacció directa, ja que tant sols s’han vist interaccions de BHRF1 amb la proteïna proapoptòtica Bim i amb VRK2, relacionada amb la ruta JNK. Aquestes interaccions proteiques poden explicar la conservació de la integritat mitocondrial que s’ha observat en aquelles cèl·lules amb presència de BHRF1 i la resistència a l’apoptosi en condicions d’estrès. En aquest treball s’ha determinat també que BHRF1 és una proteïna exclusivament mitocondrial, ja que aquesta no varia la seva localització cel·lular tant en un context d’alta viabilitat cel·lular com d’apoptosi, per tant les interaccions proteiques s’han de donar a nivell del mitocondri. / Now a day the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of elevated therapeutic interest products as well as biological model for the assay of novel drugs. Many corporations use this technology as the best approach to obtain complex molecules. Notwithstanding there are several important drawbacks on the animal cell culture. Among them there is the loose of viability in cultured cells due to the activation of the programed cell death or apoptosis. The main origin of the apoptosis triggering is the essential nutrient or growth factors deprivation and the accumulation of harmful metabolites during the cell culture. Apoptosis represents a major inconvenient for the in vitro cell culture in bioreactors as is responsible for the dramatic cell viability reduction and consequently a decrease in productivity. The IgG3 producing murine hybridoma cells KB26.5 have been used in this thesis. These cells have been transfected with bhrf1 gene and it was checked that this particular modification was able to reduce the number of apoptotic cells and ensure cell survival in proapoptotic conditions. This ability was observed in two cell culture systems such as batch and perfusion. The later culture system clearly showed that BHRF1 directly affects to the cell cycle only in a nutrient limitation situations. These observations led to a deep study of the BHRF1 intracellular effects to understand how the expression of this gene was able to generate those phenotypical effects. It was determined that the cellular effect of BHRF1 was not only constricted to prevent the apoptosis by itself at a mitochondrial level, but also was able to influence on several essential pathways. Microarray analysis unveiled the BHRF1 capability to differentially induce gene expression related to apoptosis, cell cycle, Akt/mTOR and JNK pathways. Moreover studies using real time PCR showed, only under apoptotic conditions, an over expression of bcl2 in KB26.5 transfected cells with bhrf1 gene. This indicates that exist a relationship between both proteins. In order to see the effect of the bcl2 overexpression two chemical inhibitors for Bcl-2 were used; BHRF1 expressing cells did not exhibit apoptosis resistance. The overexpression of bcl2 can be related with G1 arrest observed under apoptotic conditions in BHRF1 expressing cells in the cell culture systems used. It was not determined a direct interaction between BHRF1 and Bcl-2, even though a direct interaction between BHRF1 and the proapoptotic protein Bim and the JNK pathway related protein VRK2 were observed. Those interactions must take place in the mitochondria as it was observed that BHRF1 was a fully mitochondrial protein.

El análisis del metaboloma presenta multitud de aplicaciones en el estudio de los sistemas biológicos debido a la disponibilidad actual de técnicas analíticas. En la presente memoria, se ha desarrollado una plataforma de perfil metabólico que incluye: la paralización del metabolismo celular (quenching), la extracción de los metabolitos intracelulares, el análisis cualitativo/cuantitativo de los metabolitos y el procesamiento de datos. Debido a que diversos metabolitos son extremadamente lábiles, se validó el protocolo de extracción de los mismos. Los resultados mostraron que el NADP(H), NAD(H),glutatión (GSH y GSSG), y la relación de AcetilCoA/CoA, se alteraban al incluir la liofilización en el proceso o el metanol/agua como disolvente de extracción. En consecuencia, el protocolo basado en ACN/CHCl3 resultó ser el más eficiente y se aplicó en el estudio de diversos sistemas biológicos (Capítulos 2-5). En el Capítulo 2, se aplicó el análisis metabólico para el estudio de los mecanismos de resistencia a la quimioterapia. Se determinaron 21 metabolitos por LC-UV en las líneas celulares: L1210 (sensible a daunomicina, DNM), L1210R (resistente a múltiples fármacos) y CBMC-6 (expresa la glicoproteína P, P-gp), antes y después de la exposición a DNM. L1210R y CBMC-6 presentaron 5 y 2 veces, respectivamente, la concentración de GSH con respecto a L1210, lo cual se correlacionó con la alta supervivencia de estas células durante la exposición a DNM. Además, las relaciones NADH/NAD+, AcCoA/CoA, la carga energética (AEC), entre otros, resultaron mayores en L1210R que en L1210. Curiosamente, las células CBMC-6 presentaron un comportamiento intermedio entre las otras dos, posiblemente debido a la presencia de la P-gp. En el capítulo 3, se analizó el metaboloma de hígados de ratas con la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), donde se cuantificaron por LC-MS más de 70 metabolitos. Los resultados mostraron diferentes perfiles metabólicos entre los hígados sanos y con EHGNA, en concordancia con los los biomarcadores clásicos. La alteración metabólica incluyó las moléculas redox (GSH, GSSG, NAD(P)(H)), y otros metabolitos como L-carnitina, CoA y diversos aminoácidos. En el Capítulo 4, se estudiaron los eventos metabólicos que tuvieron lugar en E. coli durante la exposición a altas concentraciones de NaCl durante un tiempo prolongado. Las alteraciones metabólicas intracelulares incluyeron aminoácidos, nucleótidos, metabolitos redox, L-carnitina, fosfato y derivados de CoA. Además, tuvo lugar un descenso muy pronunciado de las concentraciones de los aminoácidos extracelulares en el momento del choque osmótico. Los datos metabólicos se integraron con datos del análisis del transcriptoma por medio del análisis de rutas metabólicas (pathway-based analysis). Entre las vías alteradas se encontraron rutas del metabolismo central así como del GSH, aminoácidos y purinas. Además, se realizó el análisis de flujos metabólicos, mostrando una orientación hacia la síntesis de productos de fermentación, tales como etanol en el caso de NaCl 0.5M y lactato en el caso de NaCl 0.8M. En el Capítulo 5, se estudió la función de la deacetilasa de E. coli (CobB) en quimiostatos con acetato como única fuente de carbono. Se realizó el análisis del metaboloma y transcriptoma, y ambos conjuntos de datos se integraron por medio del análisis de rutas metabólicas. Los resultados obtenidos mostraron que los efectos más notables tuvieron lugar en el metabolismo del azufre y del nitrógeno, sugiriendo que el metabolismo del nitrógeno podría estar directa o indirectamente regulado por la acetilación de proteínas. En conclusión, la metabolómica ha sido utilizada con éxito en la presente Memoria en conjunción con la transcriptómica, la flujómica o biomarcadores clásicos. Asimismo, la cuantificación de cofactores redox, nucleótidos, coenzimas y aminoácidos es sumamente importante para la comprensión global del estado metabólico, siendo clave ATP, GSH, AcCoA, CoA y algunos aminoacidos ya que al menos uno de los mencionados ha resultado alterado en todas las situaciones descritas en esta Tesis a lo largo de los Capítulos 2-5. Además, algunas de las moléculas clave mencionadas como GSH, AcCoA, CoA y también NAD(P)H han resultado ser lábiles durante el proceso de extracción, de modo que es esencial el uso de un protocolo que no altere per se estos metabolitos. / Metabolome analysis is widely used in the study of biological systems due to the affordable analytical techniques currently available. A metabolic profile platform has been carefully developed, including quenching of the cell metabolism, extraction of the intracellular metabolites, qualitative/quantitative analysis and data processing. The metabolic quantification process has been thoroughly validated, including some commonly used steps such as lyophilization, since our results suggested that the ratios NADPH/NADP+, NADH/NAD+, GSH/GSSG and the AcetylCoA/CoA were modified when lyophilization was included in the extraction process or when methanol/water is used as the extraction solvent. To avoid this, a highly efficient extraction protocol based on ACN/CHCl3 was validated with standard mixtures. Then, the metabolome analysis was applied to the study of metabolic alterations in liver tissues or bacterial cultures. In Chapter 2, it is shown how metabolic analysis contributed to the better understanding of the chemotherapy resistance mechanisms. For that purpose, 21 metabolites were determined by LC/UV before and after DNM exposure in different murine cell line cultures: L1210 (sensitive to DNM), L1210R (multidrug-resistance phenotype, MDR) and CBMC-6 (L1210 transfected with the glycoprotein P, P-gp). P-gp is one of the known mechanisms of chemotherapy resistance since it is able to take out the drug outside the cell. The results showed that L1210R and CBMC-6 presented 5 and 2-fold, respectively, the concentrat on of GSH with respect to L1210, which suggest that this metabolite plays a protective role since it was correlated with the high survival percentage of these lines during DNM exposure. Additionally, the NADH/NAD+, AcCoA/CoA, adenylate (AEC), uricilate (UEC) and guanylate (GEC) energy charge ratios were always higher in L1210R than in L1210. Interestingly, CBMC-6 cells presented an intermediate behaviour between the other two due to the presence of the P-gp. In Chapter 3, the metabolome analysis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rat livers was carried out with more than 70 metabolites being identified and quantified by LC/MS. The metabolic pattern showed clear differences between healthy and NALFD-livers attending to the diet and as assessed by classical biomarkers. Interestingly, the metabolic alteration included not only redox molecules (GSH, GSSG, NAD(P)(H)), as expected, but also other metabolites such as L-carnitine, CoA and amino acids. In Chapter 4, the long-term exposure of E. coli to osmotic stress has been studied from a metabolic point of view, where it was seen that intracellular metabolic levels were highly dependent on the NaCl concentration in the medium. The results obtained pointed to clear alterations in several metabolites, such as intracellular amino acids, nucleotides, redox coenzymes, acetyl phosphate and CoA derivatives. Moreover, the depletion of extracellular amino acids was measured when NaCl was added. These metabolic data were combined with the transcriptomic profile using integration pathway-based analysis, highlighting the main pathways affected, namely, GSH metabolism, glycolysis/gluconeogenesis, amino acid biosynthesis/degradation, purine metabolism, phosphorylative oxidation, and the TCA cycle/glyoxylate shunt. In addition, metabolic flux analysis pointed out a fermentation pattern that depended on the NaCl concentration. In Chapter 5, metabolome analysis was carried out to shed light on the role of the only known deacetylase of E.coli (CobB) in acetate-feeding chemostats. Moreover, transcriptomic analysis was performed and both data sets were integrated by using pathway-based analysis. The results showed the main effects were in both the sulfur and nitrogen pathways, including CoA, taurine, pyrimidines and several amino acid metabolisms, suggested that nitrogen metabolism is directly or indirectly regulated by protein acetylation. To conclude, metabolome analysis can be used in conjuction with other techniques such as transcriptomics, fluxomics or classical experiments. The quantification of redox cofactors, nucleotides, coenzymes and amino acids is highly important for the understanding of the whole metabolic state in biological systems being key metabolites GSH, ATP, AcCoA, CoA and some amino acids since at least one of them has resulted altered in any of the situations described along Chapters 2 to 5. Surprisingly, GSH, AcCoA, CoA and also NAD(P)H concentrations could be altered during the extraction process therefore the use of an appropriate extraction protocol has been proved to be essential.

La presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de metodologías analíticas de carácter innovador para el estudio de diferentes rutas de regulación genética. Éstas nuevas técnicas de análisis se presentan como una atractiva alternativa para conseguir un diagnóstico y seguimiento de terapia del cáncer más precisos e informativos. Se propone el uso de un nuevo biosensor basado en tecnología nanofotónica como una plataforma ideal para el análisis rápido, directo y altamente sensible de dichas rutas, evitando el uso de marcadores o procesos de amplificación. Diferentes trastornos genéticos y epigenéticos asociados con la aparición y el progreso de cáncer han sido estudiados empleando ácidos nucleicos como marcadores biológicos. Para ello, se han empleado dos tipos de biosensores ópticos: (i) el conocido biosensor basado en Resonancia de Plasmón Superficial (SPR), y (ii) una nueva plataforma nanotecnológica altamente sensible basada en señales interferométricas producidas en guías de onda bimodal (biosensor BiMW). En primer lugar se ha llevado a cabo un estudio en profundidad de diversos procesos de biofuncionalización en ambas plataformas biosensoras. Se han optimizado diferentes procedimientos químicos de funcionalización de superficie de tal forma que aseguren una eficiente inmovilización de oligonucleótidos como elementos de biorreconocimiento. Esto ha permitido la detección de las secuencias diana de forma muy selectiva, ofreciendo la máxima sensibilidad y reproducibilidad posibles, especialmente para el análisis de muestras humanas complejas como son la orina o el suero. Una vez optimizadas las estrategias de biofuncionalización, se han evaluado diferentes rutas de regulación genéticas clínicamente relevantes como son los procesos de splicing alternativo, la regulación de micro-ARNs o los procesos de metilación de ADN. Todas las metodologías desarrolladas han sido evaluadas en términos de selectividad, sensibilidad y reproducibilidad, siendo validadas finalmente con el análisis de muestras reales. Las metodologías desarrolladas eluden inconvenientes críticos a los que se enfrentan normalmente las tecnologías convencionales empleadas para el estudio de estos procesos, ofreciendo protocolos más estandarizados que permiten una detección muy sensible, selectiva y con una mínima manipulación de la muestra. Este trabajo constituye el nacimiento de una nueva línea de investigación en nuestro grupo de investigación y combina nuestro amplio conocimiento en el desarrollo de innovadoras tecnologías biosensoras con nuestra gran experiencia en bioanalítica, ofreciendo finalmente herramientas de análisis muy avanzadas para la evaluación directa y efectiva de rutas de regulación genética como nuevas soluciones en el diagnóstico de cáncer y seguimiento de terapias. / This Doctoral Thesis focuses on the development of innovative biosensor devices as alternative analytical techniques for the evaluation of different gene regulating pathways in order to obtain a more informative and accurate diagnosis and follow-up therapy of cancer. We propose the use of a novel nanophotonic biosensor for a rapid, highly sensitive and direct analysis of these regulating routes without the need of labeling or amplification steps. Different genetic and epigenetic disorders associated with cancer appearance and progression are studied taking advantage of circulating nucleic acids as target biomarkers. For the label-free detection and evaluation of these biomarkers, we have employed two different optical biosensors: (i) the well-known Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor, and (ii) a novel nanotechnology-based interferometric device, the Bimodal Waveguide (BiMW) biosensor. First, an in-depth study of different biofunctionalization strategies on both platforms is presented. Several surface chemistry procedures have been optimized for an efficient immobilization of nucleic acids as biorecognition elements that ensure a highly sensitive target detection with maximum selectivity and reproducibility, especially for the direct analysis of complex human samples such as urine or serum. The optimized strategies were applied for the evaluation of specific and clinically relevant gene regulation pathways, such as RNA alternative splicing events, micro-RNA regulation, or DNA methylation processes. All the developed methodologies have been assessed in terms of selectivity, sensitivity and reproducibility, and in some cases, they have been validated with real samples. The obtained results overcome some of the critical drawbacks of the current methodologies employed for the analysis of such processes and offer standardized protocols for a highly sensitive and selective detection with minimal sample manipulation. The work in this Thesis has opened a new Research line in our Group and combines our wide knowledge in the development of powerful photonic biosensor technology with our bioanalytical expertise in order to offer advanced analytical tools for the direct and effective evaluation of gene regulating pathways as new solutions for cancer diagnosis and follow-up therapy

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Cytoplasmic polyadenylation element binding proteins (CPEBs) are a family of RNA-binding proteins essential for the translational regulation of mRNAs in various biological contexts. CPEBs recognize CPE elements in the 3’ untranslated region of target mRNAs and regulate their translational fate through cytoplasmic polyadenylation. This process is especially important during meiosis, since its progression relies on the translational activation of stored maternal mRNAs. CPEB1 and CPEB4 are the two members of the family required for meiotic progression. While CPEB1 mediates the translational activation of mRNAs until metaphase I (MI), CPEB4 activates mRNAs from interkinesis to metaphase II (MII). CPEBs share a conserved RNA-binding domain and regulate overlapping mRNA subpopulations. Hence, the requirement of two distinct CPEBs to complete meiosis leans on their differential post-translational regulation. In fact, the N-terminal domain of the CPEBs is highly variable and harbours different regulatory motifs. While CPEB1 is activated by Aurora A kinase and is targeted for degradation by Cdc2 and Plk1-mediated phosphorylation, CPEB3 is controlled by monoubiquitination and SUMOylation, which regulate the transition from an inactive monomeric CPEB3 form to an active beta-amyloid-like aggregate. How the other CPEBs are post-translationally regulated is unknown. Nevertheless, unveiling how the different CPEBs are differentially regulated is crucial for understanding how they respond to different stimuli and how they are interconnected in particular scenarios of co-existence. We found that CPEB4 activity is regulated by hyperphosphorylation during the meiotic cell cycle. Specifically, CPEB4 is phosphorylated in twelve residues by two different kinases and in a phase-specific manner. All phosphorylated residues are located in the intrinsically disordered N-terminal half of CPEB4 and are required for cytoplasmic polyadenylation of target mRNAs. Accordingly, these twelve phosphorylation sites are essential for meiotic progression. Furthermore, we have shown that hyperphosphorylation of CPEB4 disordered domain modulates its aggregation properties. Hence, non-phosphorylated CPEB4 forms non-amyloid aggregates that specifically recruit and repress CPE-containing mRNAs, whereas hyperphosphorylated CPEB4 remains monomeric and is active in cytoplasmic polyadenylation. Importantly, CPEB4 aggregates are dynamic and reversible upon phosphorylation on the identified phosphosites. These results contribute greatly to the understanding of how the CPEBs are differentially regulated and how they would differentially respond in a given cellular environment. / Les CPEBs (cytoplasmic polyadenylation element binding proteins) són una família de proteïnes d’unió a ARNm essencials per a la regulació traduccional d'ARNm en diversos escenaris biològics. Les CPEBs uneixen CPEs en el 3’ UTR (untranslated region) dels l'ARNm diana i regulen la seva traducció mitjançant la poliadenilació citoplasmàtica. Aquest procés és especialment important durant la meiosi, ja que la seva progressió necessita l'activació traduccional d’ARNm materns. La CPEB1 regula la traducció d’un grup d’ARNm durant la primera divisió meiòtica, mentre que la CPEB4 ho fa durant la segona divisió. Les CPEBs comparteixen el domini d'unió a l'ARN i regulen subpoblacions d’ARNm solapants. Per tant, el fet de que es necessitin dues CPEBs durant la meiosi es deu a que es regulen diferent a nivell post-traduccional. De fet, el domini N-terminal de la CPEBs no està conservat i conté diferents motius reguladors. Mentre que la CPEB1 s’activa per Aurora A quinasa i es degrada com a conseqüència de la seva fosforilació per Cdc2 i Plk1, CPEB3 es regula per mono-ubiquitinació i SUMOilació, dues modificacions que controlen la formació d’un agregat beta-amiloide actiu en poliadenilació. Com es regula l’activitat de les altres CPEBs és desconegut. No obstant, determinar com es regulen les CPEBs és crucial per a entendre com responen a diferents estímuls i com estan interconnectades. Aquest estudi demostra que l'activitat de la CPEB4 està regulada per hiper-fosforilació. Específicament, dues quinases fosforilen la CPEB4 en dotze residus localitzats en la regió N-terminal desordenada de la CPEB4. Aquestes fosforilacions són necessàries per a l’activitat de la CPEB4 en poliadenilació citoplasmàtica i són essencials per a la progressió meiòtica. Tanmateix, hem demostrat que la hiper-fosforilació de CPEB4 modula les seves propietats d'agregació. Així, la CPEB4 no fosforilada forma agregats no amiloides que recluten i reprimeixen ARNm diana, mentre que la CPEB4 hiper-fosforilada roman monomèrica i promou la poliadenilació citoplasmàtica d’aquests ARNm. És important destacar que els agregats de CPEB4 són dinàmics i reversibles mitjançant la fosforilació dels aminoàcids identificats. Aquests resultats contribueixen a la comprensió de com es regulen les CPEBs i com respondrien diferencialment en un entorn cel·lular determinat.

Tesis por compendio de publicaciones / Zinnia elegans constituye uno de los sistemas modelos más útiles para estudiar la diferenciación en el xilema que incluye la síntesis de la pared celular secundaria, la lignificación de la pared celular, y la muerte celular programada. Además, el cultivo de células del mesófilo de Z. elegans in vitro también se ha utilizado como sistema modelo ya que la diferenciación de las células del mesófilo en traqueidas permite estudiar de manera sencilla la bioquímica y la fisiología de la xilogénesis alejados de la complejidad que imponen los tejidos vegetales. Por otra parte, Z. elegans ha resultado ser una excelente planta modelo para estudiar la implicación de las peroxidasas en la lignificación de la pared celular. Esto es debido a la simplicidad y dualidad del patrón de lignificación mostrado en los tallos e hipocotilos de esta planta y a la naturaleza básica de esta isoenzima de peroxidasa. Sin embargo, esta proteína no solo se expresa en hipocotilos y en tallos sino también en células que se encuentran en diferenciación en traqueidas. Por lo tanto, esta peroxidasa no solo cumple todos los requerimientos catalíticos impuestos para ser la candidata idónea implicada en la lignificación cumpliendo con todas las restricciones impuestas por la etapa de acoplamiento oxidativo de los alcoholes hidroxicinamilicos y polimerización, sino también debido a que su expresión es inherente en la lignificación. De hecho, su naturaleza básica no es excepcional ya que las peroxidasas básicas se expresan diferencialmente durante la lignificación en otros sistemas modelo, mostrando propiedades bioquímicas inusuales y exclusivas tales como la oxidación de las unidades siringilo. Esta Tesis se ha centrado en la realización de las actividades que conducen a un mejor entendimiento de la lignificación en Zinnia, comenzando con el estudio del patrón de lignificación, cómo se sucede este proceso, y la implicación de la peroxidasa, demostrando sus propiedades catalíticas inusuales y cómo esta enzima es regulada por el óxido nítrico (NO) y el H2O2. En relación a la producción de NO y H2O2 en los haces vasculares, utilizando la microscopía confocal láser de barrido, se observó un gradiente espacial de producción de NO inversamente relacionado con el grado de diferenciación del xilema ya que las células del xilema jóvenes, en diferenciación manifestaron una mayor capacidad para producir NO que las células del xilema completamente maduras y diferenciadas. Estos resultados demuestran la fuerte relación entre la producción de NO y la muerte celular programada que se produce durante la diferenciación del xilema y que precede a la lignificación de la pared celular. Además, la producción de NO en los cultivos celulares de mesófilo de Z. elegans que se diferencian a traqueidas, las células del mesófilo mantienen la misma propiedad mostrada por las células del xilema en diferenciación ya que la señal fluorescente se detectó, principalmente, en las células predeterminadas y en las que se encontraban en diferenciación. Por el contrario, las células aisladas del mesófilo que no habían adquirido la capacidad para diferenciarse a traqueidas, manifestaban unos niveles muy débiles de la señal fluorescente que contrastaba con la producción elevada mostrada por las células predeterminadas para diferenciarse a traqueidas. Por otra parte, mediante la utilización conjunta de técnicas de microscopía óptica y electrónica, se realizó un estudio detallado de los sitios de producción de H2O2 en el xilema en lignificación, comprobándose que en las células del xilema en diferenciación y en las células del parénquima adyacentes se localizaba la producción de H2O2 sugiriendo que estas células podrían ser las responsables de la producción de H2O2 que, posteriormente, difunde de célula a célula, a través del espacio intercelular hacia las células del xilema en diferenciación para que tenga lugar la biosíntesis de ligninas en la pared celular secundaria. Una evidencia adicional que apoyó la hipótesis planteada se obtuvo mediante la localización del H2O2 en los cultivos celulares de mesófilo de Z. elegans en diferenciación a elementos traqueales. Utilizando este sistema modelo junto con la microscopía confocal láser y el diacetato de diclorofluoresceína como sonda fluorescente, la producción de H2O2 se localizó mayoritariamente en las células del mesófilo predeterminadas para diferenciarse, detectándose un bajo nivel de H2O2 en las traqueidas completamente diferenciadas. / Zinnia elegans constitutes one of the most useful model systems for studying xylem differentiation, which simultaneously involves secondary cell wall synthesis, cell wall lignification, and programmed cell death. Likewise, the in vitro culture system of Z. elegans has been the best characterized since the differentiation of mesophyll cells into tracheary elements allows study the biochemistry and physiology of xylogenesis free from the complexity that heterogeneous plant tissues impose. Moreover, Z. elegans has resulted in an excellent plant model to study the involvement of peroxidases in cell wall lignification. This has been due to the simplicity and duality of the lignification pattern shown by the stems and hypocotyls, and to the basic nature of the peroxidase isoenzyme. This protein is expressed not only in hypocotyls and stems but also in mesophyll cells transdifferentiating into tracheary elements. Therefore, not only does this peroxidase fulfil all the catalytic requirements to be involved in lignification overcoming all restrictions imposed by the polymerization step, but also its expression is inherent in lignification. In fact, its basic nature is not exceptional since basic peroxidases are differentially expressed during lignification in other model systems, showing unusual and unique biochemical properties such as oxidation of syringyl moieties. This Thesis has focused on the experiments which led to a better understanding of the lignification process in Zinnia, starting with the basic knowledge about its lignin pattern, how lignification takes place, and the involvement of the basic peroxidase in the lignification process, demonstrating its unusual catalytic properties, and how this enzyme is regulated by nitric oxide and H2O2. In relation to the production of NO in the vascular bundles using confocal laser scanning microscopy, a spatial NO gradient inversely related to the degree of xylem differentiation was observed since differentiating xylem cells clearly manifest a higher capacity for NO production than differentiated xylem cells. In addition, the NO production in cultured mesophyll cells which are trans-differentiating in tracheary elements maintain the same property shown by differentiating xylem from the Z. elegans vascular bundles since the fluorescent probe was mainly observed in pro-differentiating thin-walled and differentiating (secondary cell wall forming) tracheary elements. By the contrary, mesophyll cells which have not acquired competence for trans-differentiation showed only background levels of triazolofluorescein green fluorescence. These results confirm that NO formation by tracheary elements is directly related to the early processes of xylem differentiation, which takes place immediately before the late processes of secondary cell wall formation and cell autolysis. On the other hand, a study of both localization and production of H2O2 in the lignifying xylem by the joint use of optical and electronic microscopy and 2,7-dichlorofluorescein diacetate and CeCl3 assays was carried out. Thus, H2O2 production was observed in thin-walled cells surround thick-walled xylem vessels and in the xylem parenchyma cells intercalated between xylem vessels suggesting that these cells could be responsible of H2O2 production and a degree of cell to cell cooperation is produced during lignin biosynthesis. Further evidence that supports this hypothesis was obtained by studying the production and localization of H2O2 during the differentiation of Z. elegans mesophyll cells into tracheary elements. Using this model system and confocal laser scanning microscopy and 2,7-dichlorofluorescein diacetate as fluorescent probe, H2O2 was mainly produced by both differentiating tracheary and parenchyma-like elements being the non-lignifying parenchyma-like cells the main H2O2 source and detecting a low level of H2O2 in the totally differentiated tracheary elements.