Cellular behaviour is regulated by a very precise system in which the complex interplay between various types of biomolecules plays a crucial role for the proper functioning of the system itself. Proteins interacting with DNA are in charged of its replication, packaging repair and recombination, among them, transcription factors regulate gene expression, but in turn they are part of a larger network of proteins interactions. In this thesis I addressed these aspects, in relation to a certain phenotype, in first instance by identifying common regulators of genes with similar expression signatures derived from high-throughput experiments, and then by computationally modelling the signal transduction by means of a message-passing algorithm. This allowed the identification of main regulators in the specific systems describing the infection process of Salmonella spp. in two different hosts: Arabidopsis thaliana and Homo sapiens. The same approach showed encouraging results in the pharmaco-dynamic study of drug-drug interactions. / El comportament cel•lular és regulat per un complex conjunt de relacions entre diferents tipus de biomol•lècules, que juga un paper fonamental per al correcte funcionament del propi sistema cel•lular. Diferents proteïnes s’encarreguen de la replicació, empaquetament, reparació i recombinació de l’ADN, i en regulen la seva expressió per mitjà de factors de transcripció. Aquests modulen la seva activitat mitjançant interaccions amb d’altres proteïnes, formant part d’una xarxa d’interaccions molt més extensa. En aquesta tesi m’interesso per aquests aspectes en relació a certs fenotips. Primer, identificant reguladors comuns de gens amb patrons d’expressió similars, obtinguts d’experiments d’alt rendiment; després, usant d’algorismes de transmissió del missatge per al modelat computacional de la transducció del senyal. Així he identificat reguladors principals en el procés d’infecció de Salmonella spp. en Arabidopsis thaliana i Homo sapiens. Una aproximació idèntica aporta resultats esperançadors en l’estudi de la farmacodinàmica de les interaccions entre drogues.

Hydroxytyrosol [2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethanol], a potent bioactive molecule mainly present in virgin olive oil and to a lower extent in wine, is also a by-product of dopamine metabolism. In a previous clinical trial designed to assess the effects of moderate wine intake it was found that hydroxytyrosol urinary recoveries were higher than the corresponding to the dose administered, suggesting an endogenous formation. The aim of the present work was to assess new mechanisms responsible for hydroxytyrosol generation by using an array of methodologies and studies ranging from in vitro assays to in vivo experiments in animal models and humans. The mechanisms identified as being involved in the generation of hydroxytyrosol were (1) CYP2A6/CYP2D6-catalyzed tyrosol-to-hydroxytyrosol biotransformation, (2) ethanol-induced increase in tyrosol bioavailability, and (3) alteration of dopamine oxidative metabolism due to ethanol. Considering these observations, it is postulated that hydroxytyrosol may contribute significantly to the health effects derived from moderate wine intake. / L’hidroxitirosol [2-(3,4-dihidroxiphenil)etanol], una potent molècula bioactiva present de forma rellevant a l’oli d’oliva verge i minoritàriament al vi, és també un producte del metabolisme de la dopamina. En un assaig clínic previ dissenyat per avaluar els efectes del consum moderat de vi es trobà que les recuperacions urinàries d’hidroxitirosol eren superiors a la dosi administrada, suggerint-ne una gènesi endògena. L’objectiu del present treball fou estudiar nous mecanismes responsables de la generació d’hidroxitirosol mitjançant diverses tècniques i estudis, des d’assajos in vitro a experiments in vivo en animals i humans. Els mecanismes involucrats a la generació d’hidroxitirosol són (1) la biotransformació de tirosol a hidroxitirosol catalitzada per CYP2A6/CYP2D6, (2) l’augment a la biodisponibilitat del tirosol induïda per l’etanol, i (3) l’alteració del metabolisme oxidatiu de la dopamina per l’etanol. Globalment, aquestes observacions donen a l’hidroxitirosol un paper clau en la comprensió dels efectes beneficiosos associats al consum moderat de vi.

Over the past years it has been described the important role of oxidative stress in the Metabolic Stress related manifestations, specifically in the obesity. It is well known that agents that reduce oxidative stress represent an important tool to reduce the obesity-induced complications such as hepatic steatosis. In this sense, flavonoids are described as antioxidant molecules, due to their scavenging properties. Moreover, omega-3 PUFAs are considered effective in the treatment and prevention of several chronic diseases. Therefore, the principal aim of this thesis was to study the antioxidant effects of flavonoids and n-3 PUFAs, as well as the possible additive effects of two compounds together. These studies were developed under several oxidative stress conditions (metabolic, chemical) both in vitro and in vivo. It has been demonstrated the importance of using nutritional supplements in different oxidative stress conditions. / Durant els últims anys s’ha descrit la importància que té l’estrès oxidatiu en les diferents patologies associades al Síndrome Metabòlic, especialment en l’obesitat. Així, agents que redueixen l’estrès oxidatiu son una important eina per reduir les complicacions relacionades amb l’obesitat, incloent la esteatosis hepàtica, definida com l’acumulació de greix al fetge. En aquest sentit, els polifenols, que presenten activitat antioxidant, i els àcids grassos poliinsaturats omega-3 que són considerats efectius en el tractament d’esteatosis hepàtica i en el desenvolupament de malalties cardiovasculars, són una bona eina per combatre aquest estrès oxidatiu. En aquesta tesi, s’ha estudiat en condicions d’estrès oxidatiu tant in vitro (hepatòcits) com in vivo (estat postprandial, estat d’obesitat induïda per la dieta o d’obesitat genètica) els efectes antioxidants dels flavonoides i/o omega-3 tant de manera individual com conjunta. S’ha demostrat la importància d’utilitzar suplements alimentaris en condicions metabòliques d’estrès oxidatiu.

L’objectiu d’aquesta tesis es desenvolupar una nova estratègia preventiva i terapèutica que requereixi les mínimes modificacions dels hàbits dietètics simultàniament efectiva en contra de l’obesitat i les seves malalties associades. Per aquest estudi s’han seleccionat compostos alimentaris presents en una dieta sana on el seus efectes beneficiosos han estat documentats tant en la obesitat com el risc de patir malalties cardiovasculars. S’inclou els polifenols com l’epigallocatechin gallate (EGCG) i les proantocyanidines i també els àcids grassos poliinsaturats omega 3 (PUFAs) o l’àcid docosahexaenoic (DHA). El treball esta enfocat en el funcionament mitocondrial del múscul, el teixit mes important de l’organisme en el control del balanç de nutrients. Els nostres resultats indiquen que hi ha una millora postprandial amb un increment de la capacitat d’oxidació dels àcids grassos millorant el perfil lipídic i la flexibilitat metabòlica. / El objetivo principal de esta tesis es desarrollar una nueva estrategia preventiva y terapéutica que requiera les mínimas modificaciones de los hábitos dietéticos simultáneamente efectiva en contra de la obesidad y sus enfermedades asociadas. Para este estudio se han seleccionado compuestos alimentarios presentes en una dieta sana dónde sus efectos beneficiosos han estado documentados tanto en la obesidad como en el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares. Se incluyen los polifenoles como el epigalocatequin galato (EGCG) y las proantocianidinas; también los ácidos grasos poliinsaturados omega 3 (PUFAs) y el acido docosahexaenoico (DHA). El trabajo está enfocado en el funcionamiento mitocondrial de musculo, el tejido más importante del organismo en el control del balance de nutrientes. Nuestros resultados indican que hay una mejora postprandial con un incremento de la capacidad de oxidación de los ácidos grasos mejorando el perfil lipídico y la flexibilidad metabólica. / The global goal of the present thesis is the development of a new preventative and therapeutic strategy that requires only minor modifications of dietary habits and simultaneously effective against obesity and its major associated diseases. For this study, we have selected food ingredients characteristic in healthy diets which has been documented beneficial effects on obesity or cardiovascular disease risk. These include plant polyphenols, epigallocatechin gallate (EGCG) and proanthocyanidins as well as the sea fish omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and docosahexaenoic acid (DHA). Our work is focused on the mitochondrial function of skeletal muscle, a major player in the body’s overall nutrient balance, and adipose tissue, which is the key regulator of energy homeostasis in the organism affected by obesity and related diseases. Our results indicate a postprandial improvement with an increase of the fatty acid oxidation capacity, improving lipid profile and metabolic flexibility.

The answer to whether or not, human pancreatic ribonuclease may have a diagnostic value as a serum marker of pancreatic disease, depend upon the specific detection of ribonucleases originated in pancreas amogn those coexisting in serum. From our point of view, two approaches would be necessary. On one hand the characterization of the carbohydrate component of the human pancreatic ribonuclease because glycosylation is organ-specific. On the other hand, obtain monoclonal antibodies in order to specifically recognize the secretory -typeribonuclease in serum. The purification system that has been established consists of two chromatographic steps using HPLC. The first, an exchange cromatography, allows for a partial purification of ribonuclease component. The second, a reversed-phase chromatography, resolves chromatographically the human pancreatic ribonuclease heterogeneity into different fractions / La resposta a si la ribonucleasa de pàncreas humà pot tenir algun valor diagnòstic com a marcador sèric de disfuncions pancreàtiques passa per la identificació de forma inequívoca de la ribonucleasa de pàncreas humà en sèrum. Segons el nostre enfoc, caldrien dues aproximacions, d’una banda la caracterització a nivell glucídic de la ribonucleasa de pàncreas humà, i de l’altra, el desenvolupament d’anticossos monoclonals dirigits a discriminar la ribonucleasa de tipus secretori d’entre els diferents tipus que coexisteixen en sèrum. En aquest sentit s’ha establert un sistema de purificació de la ribonucleasa pancreàtica humana que fos ràpid i repetitiu que respectés l’heterogeneïtat glucídica per a la seva posterior caracterització. El sistema de purificació establert a partir de pàncrees obtinguts a partir de donants sans d’òrgans consta de dues etapes cromatogràfiques per HPLC. La primera, una cromatografia de bescanvi catiònic, possibilita una purificació parcial, mentre la cromatografia de la fase inversa permet resoldre cromatogràficament l’heterogeneïtat de la ribonucleasa humana de pàncreas en diferents fraccions

Electrospinning is a manufacturing process that uses an electric field to produce fibers from a polymer solution. The accumulation of these fibers conform a three-dimensional fiber matrix or scaffold. Fibers can be prepared in a wide diameter range, namely from a micrometer to nanometer size. Furthermore, the fiber matrix or scaffold has a large surface per mass unit, a porous structure and mechanical properties influenced by the orientation of the fibers. The electrospinning technique is highly versatile and therefore a large number of polymers with different properties can be processed. However, a large number of variables can influence the characteristics of the resulting fibers, either because they are related to the polymer properties (e.g., solubility, molecular weight, etc.) or with the specific processing parameters (voltage, flow rate or distance tip-collector). Electrospun fiber matrices are attractive for biomedical applications as for example tissue engineering and drug delivery systems. In the last case, it is important the possibility to load the fibers with different drugs for their direct and localized administration into the human body. The goal of this Thesis is the study of different matrices constituted by electrospun micro- nanofibers and specifically four points have been considered. In the first one, polylactide electrospun scaffolds have been loaded with different molecules with antioxidant activity (i.e., vitamin B6 in pyridoxine and pyridoxal forms, p-coumaric acid and caffeic acid). The influence of these molecules on physical properties, morphology, in vitro release profiles and biocompatibility was determined. Furthermore, the application of these new materials for the inhibition of oxidative DNA damage caused by free radical initiators was demonstrated, and consequently, they appear appropriate candidates for purification of plasmidic or genomic DNA. In the second point, PLLA matrices loaded with two or three drugs were prepared in order to get a multifunctional activity. Thus, antioxidant, anti-inflammatory and antimicrobial molecules were considered in order to prevent chain oxidation processes in different biomolecules (proteins, DNA, etc.), avoid the subsequent local inflammation, and reduce the potential risk of microbial infection of wounds, respectively. These matrices are especially interesting due to the synergies and antagonisms that may occur during their simultaneous release. In the third point, the possibility of preparing biodegradable scaffolds from non electrospinable polymers has been considered. These polymers may have advantages like conductivity/electroactivity or bactericide activity. Hybrid scaffolds constituted by different ratios of polylactide as a biodegradable polymer and (poly(3-thiophene methyl acetate)) as electroactive polymer were evaluated. PLA nanofibers were also successfully loaded with polyhexamethylenebiguanide hydrochloride giving rise to 3D biodegradable scaffolds with a well proven antibacterial activity and a release that was highly dependent on the hydrophilicity of the medium. Finally electrospun scaffolds were obtained using a sacrificial polymer (e.g. poly(ethylene glycol) (PEG)) that could easily be subsequently removed by solubilization in aqueous media. Three approaches were evaluated: a) Preparation of scaffolds constituted by different ratios of PLA and PEG electrospun fibers, b) Preparation of scaffolds constituted by electrospun fibers with different PLA and PEG content; c) Preparation of scaffolds constituted by coaxial electrospun fibers with different core-shell polymer distributions. Cell colonization was in all cases favoured. The three procedures allowed preparing scaffolds with a differentiated drug release behavior. / La técnica de 'electrospinning' o electrohilado es un proceso de fabricación que utiliza un campo eléctrico para producir fibras a partir de disoluciones de polímeros. La acumulación de estas fibras conforma una matriz tri-dimensional o 'scaffold', y las fibras pueden ser preparadas en escala micro y nanométrica. Además, estas matrices o 'scaffold' se caracterizan por su gran superficie por unidad de masa, estructura porosa y propiedades mecánicas influenciadas por la orientación de las fibras. El 'electrospinning' es muy versátil y un gran número de polímeros con diferentes propiedades pueden ser procesados. Sin embargo, un gran número de variables pueden influir en las características de las fibras obtenidas, siendo variables propias del polímero (p.e., solubilidad, peso molecular, etc.) o relacionadas a los parámetros del proceso (voltaje, flujo, distancia colector-aguja). Estas matrices de fibras son atractivas para aplicaciones biomédicas como la ingeniería de tejidos y sistemas de liberación controlada de fármacos. En el último caso, es importante la carga de diferentes fármacos o drogas para su administración directa y localizada en el cuerpo humano. El objetivo de esta Tesis es el estudio de diferentes matrices constituidas por nano o microfibras electrohiladas. El desarrollo de este estudio se divide en cuatro bloques. En el primer bloque, matrices de fibras de poliláctico (PLA) fueron cargadas con diferentes moléculas con actividad antioxidante (vitamina B6 en sus formas de piridoxina y piridoxal, ácido p-cumárico y ácido cafeico). Se determinó la influencia de estas moléculas sobre las propiedades físicas, morfología, liberación in vitro y biocompatibilidad de dichas matrices. Además, se demostró la aplicación de estos nuevos materiales en la inhibición del daño oxidativo del ADN causado por iniciadores de radicales libres, y en consecuencia, estas matrices serían útiles para la purificación de ADN plasmídico o genómico. En el segundo bloque, las matrices de PLA fueron cargadas con dos o tres fármacos para obtener matrices multifuncionales en base a sus actividades. Con esta finalidad, moléculas con actividad antioxidante, anti-inflamatoria, y antimicrobiana fueron cargadas en las matrices para evitar los procesos de oxidación de diferentes biomoléculas (proteínas, ADN, etc.), evitar la inflamación local, y reducir el riesgo potencial de infección microbiana de las heridas, respectivamente. Estas matrices son especialmente interesantes debido a las sinergias y antagonismos que pueden ocurrir durante su liberación simultánea. En el tercer bloque, se prepararon matrices biodegradables a partir de polímeros no-electrohilables. Estos polímeros pueden presentar características particulares, como actividad bactericida, o actividad conductora/electroactividad. Matrices hibridas conformadas con diferentes ratios de PLA usado como polímero biodegradable y el poli(3-tiofeno metil acetato) como polímero electroactivo fueron preparadas y evaluadas. También se prepararon matrices de nanofibras de PLA cargadas con clorhidrato de polihexametilenbiguanida (PHMB) obteniéndose matrices biodegradables con actividad antibacteriana, y la liberación del PHMB fue altamente dependiente de la hidrófilicidad del medio. Finalmente, en el cuarto bloque, se prepararon matrices electrohiladas usando un polímero de sacrificio (polietilenglicol o PEG) que puede ser eliminado fácilmente por solubilización en medios acuosos. Tres preparaciones diferentes fueron evaluadas: a) Matrices constituidas por diferentes proporciones de PLA y PEG en las fibras, b) Matrices constituidas por fibras de PLA y fibras de PEG y, c) Matrices constituidas por fibras coaxiales con diferentes distribuciones de polímeros en el núcleo y la corteza de la fibra. La colonización celular en todas estas matrices fue mejorada. Estos tres procedimientos permitieron obtener matrices con diferentes comportamientos para la liberación de fármacos.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process by which epithelial cells acquire a mesenchymal phenotype. It is characterized by the down-regulation of the adherens junction protein E-cadherin, and it is important during embryonic development. Snail1 expression is sufficient to trigger EMT in cultured cells and is found up-regulated in some cancers. Snail1 is stabilized both at mRNA and protein levels and in this project we analyzed the action of ubiquitin ligases affecting protein half-life. Apart from the already described β-Trcp1, that degrades Snail1 in a GSK-3β phosphorylation-dependent manner, we found the F-box proteins FBXL14 and FBXL5 as novel E3 ubiquitin ligases for Snail1. FBXL14 is a cytoplasmic ubiquitin ligase that is down-regulated in hypoxia through a transcriptional mechanism. FBXL5 is nuclear and modulates Snail1 binding to the DNA and nuclear ubiquitination. FBXL5 protein is destabilized after γ-irradiation, inducing high levels of Snail1. Together, these ligases keep a tight control of Snail1 cellular levels, maintaining them low in normal conditions. / La transició epiteli-mesènquima (per l’acrònim en anglès de: “epithelial to mesenchymal transition”, EMT) és un procés durant el qual cèl•lules epitelials adquireixen un fenotip mesenquimal. Està caracteritzat per la baixada de l’E-caderina, una proteïna de les unions adherents, i és important en el desenvolupament embrionari. L’expressió de Snail1 és suficient per desencadenar la EMT en cèl•lules en cultiu i s’ha trobat sobre-expressada en alguns càncers. Snail1 s’estabilitza tant a nivell de mRNA com de proteïna i en aquest projecte hem analitzat l’acció de les lligases d’ubiquitina que afecten els nivells de la proteïna. Apart de la ja descrita β-Trcp1, que degrada Snail1 de manera depenent a la fosforilació de Snail1 per GSK-3β, hem trobat les proteïnes F-box FBXL14 i FBXL5 con a noves lligases d’ubiquitina E3 que degraden Snail1. La FBXL14 és citoplasmàtica i els seus nivells disminueixen en hipòxia a través d’un mecanisme transcripcional. La FBXL5 és nuclear i modula tant la unió de Snail1 al DNA com la seva ubiquitinació nuclear. La proteïna FBXL5 es desestabilitza degut a la radiació gamma (γ) induint els nivells de Snail1.

Magister en Biofísica Médica / La clasificación de potenciales de acción generados por las neuronas es un problema complejo y recurrente en el análisis de datos neuroeléctricos. Los métodos de clasificación actuales se basan en escoger parámetros de clasificación que representen las características de cada espiga con un número reducido de coeficientes. Esta tesis propone utilizar los coeficientes de la transformada de wavelet discreta (DWT) como parámetros de clasificación. Los coeficientes DWT son ortogonales, de cómputo rápido y cuantifican componentes localizados de frecuencia. La eficiencia de la clasificación basada en coeficientes DWT ( wavelet-based spike classification WSC) de las espigas fue comparada con resultados obtenidos con coeficientes de análisis de componentes principales (PCA) y un método de reconocimiento de patrones publicado como método RFS ( reduced feature set ). En un tren de datos artificial ruidoso, el método WSC demostró mayor capacidad para discriminar entre espigas muy similares que los métodos PCA y RFS. Estos resultados fueron publicados en el Journal of Neuroscience Methods. También se mostró la utilidad del método WSC analizando trenes de espigas multiunitarios ruidosos registrados en tectum de paloma. Se discuten las ventajas del uso del método WSC sobre el PCA y el RFS. Se analiza la actual implementación del método WSC, y se proponen mejoras importantes, basándose en los avances más modernos de la adquisición y análisis de registros neuroeléctricos.

Orientador: Elso Drigo Filho / Banca: Keizo Yukimitu / Banca: Nelson Augusto Alves / Banca: José Geraldo Nery / Banca: Marcelo de Freitas Lima / Resumo: As interações que ocorrem dentro de hemoproteínas são importantes para os sistemas biológicos e constituem termos de forte interesse para compreensão de sistemas vivos. Desta forma, é importante conhecer as interações vibracionais e eletrostáticas neste sistema. Neste trabalho foi feito um estudo sobre a interação entre o íon ferro(II) e o monóxido de carbono confinados em cavidades esféricas que mimetizam volumes de cavidades proteicas e um estudo do potencial de Morse confinado para o monóxido de carbono. Dessa forma, descrevemos como os autovalores de energia no estado fundamental para os potenciais da interação íon-dipolo e Morse se comportam no confinamento para um dos possíveis ligantes da mioglobina e da hemoglobina. Para o potencial de Morse desdobramos os cálculos para as seguintes moléculas diatômicas: nitrogênio, lítio e hidreto de sódio. Foi calculada, via Método Variacional, a energia para o sistema íon-dipolo confinado e potencial de Morse confinado. A função de onda teste sugerida foi inspirada na Mecânica Quântica Supersimétrica. Por fim, verificou-se como a energia de interação entre o íon e o dipolo se comporta com a mudança de permissividade do meio e como é o comportamento vibracional das moléculas de CO, N2, Li2 e NaH / Abstract: The interactions that occur within hemeproteins were important for biological systems and they were terms of strong interest for understanding living systems. ln this way, it is important to know the vibrational and electrostatic interactions in this system. ln this work a study is made on the interaction between iron ion and carbon monoxide confined in spherical cavities that mimic volumes of protein cavities and a study of the confined Morse potential for carbon monoxide. ln this way, we describe how the eigenvalues of energy in the ground state for the potentials of ion-dipole interaction and Morse behave in the confinement regime for one of the possible ligands of myoglobin and hemoglobin. For the Morse potential, we perform the calculations for the following diatomic molecules: nitrogen, lithium and sodium hydride. The energy for the confined ion-dipole system is calculated using the Variational Method. The suggested trial wavefunction is inspired by Supersymmetric Quantum Mechanics. Finally, it is verified how the energy of interaction between the ion and the dipole behaves in a change permittivity and how is the vibrational behavior of molecules of CO, N2, Li2 and NaH / Doutor

Orientador: Antonio Manoel Mansanares / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-26T17:41:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barja_PauloRoxo_D.pdf: 636475 bytes, checksum: af155e75acdcb3b2a4afe4038311d647 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Este trabalho mostra a caracterização de sistemas vegetais em função de sua atividade fotossintética a partir de medidas efetuadas com a técnica fotoacústica. Um modelo para a difusão de oxigênio em folhas é analisado e verificado através de medidas in vivo e in situ em plantas de diversas espécies. Medidas de indução da fotossíntese em mudas de eucalipto produzidas a partir de dois procedimentos diferentes permitiram constatar o melhor desempenho fotossintético dos clones obtidos por estaquia, quando comparados às mudas semeadas. A ocorrência de estresse radicular e seus efeitos na fotossíntese do eucalipto foram avaliados através de medidas fotoacústicas. Este estudo também permitiu comparar a eficiência das técnicas fotoacústica e fluorescência na diagnose das mudas sujeitas a estresse / Abstract: This work shows the characterization of plant systems through their photosynthetic activity measured with the photoacoustic technique. A model for oxygen diffusion in leaves is analyzed and checked through in vivo and in situ measurements in plants from different species. Photosynthetic induction measurements in eucalyptus plants produced by two distinct procedures lead to the conclusion that clones (shoot cuttings) presented a higher photosynthetic performance than that shown by seedlings. The occurrence of radicular stress and its effects in the photosynthesis of eucalyptus samples were evaluated through photoacoustic measurements. This study also allowed the comparison between the efficiency of the photoacoustic and the fluorescence techniques on the diagnosis of plants subjected to stress conditions / Doutorado / Física / Doutor em Ciências