Clathrin-mediated membrane budding mainly occurs at the cell surface, where it drives the formation of endocytic vesicles necessary for the internalization of membrane proteins, and at the trans-Golgi network (TGN), where it mediates the trafficking of cargo proteins from the TGN to the endosomal/lysosomal system. The general objective of my doctoral research was to study adaptor and accessory proteins that play structural and regulatory roles in the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs). This was achieved principally through the characterization of two protein complexes: a first, which functions at the cell surface and a second, which regulates vesicle formation at the TGN/endosome. / First, we discovered that the endocytic protein PACSIN 1 is a binding partner for the signaling molecule mSos1. Further analysis of this interaction revealed that both proteins form a complex in vivo, that they co-localize at actin-rich sites, and that their interaction is regulated by phosphorylation. These data strengthen the link between endocytosis, signaling and actin cytoskeleton dynamics and provide the basis for further investigation of the role of this protein complex. / Second, we used subcellular proteomics to identify novel components of brain-derived CCVs. Among these was an ENTH domain-containing protein, which we named enthoprotin. Further work demonstrated that enthoprotin localizes to CCVs, interacts with clathrin adaptors AP-1 and GGA2 at the TGN, and stimulates clathrin assembly in vitro. Altogether, our data suggest a role for enthoprotin in clathrin coat assembly on internal membranes. Analysis of the enthoprotin protein sequence led to the discovery of two peptide motifs responsible for interactions with AP-1 and GGA2. We used alanine-scan mutagenesis and nuclear magnetic resonance to biochemically and structurally characterize the high-affinity site responsible for the interaction between enthoprotin and the TGN adaptors. This experimental approach, coupled to alignments, allowed us to deduce an AP-1/GGA-binding consensus motif that can be used towards the identification of novel TGN adaptor-binding partners. Altogether, my doctoral research contributed to furthering knowledge of the mechanisms that underlie clathrin-mediated membrane budding.

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of cell-surface receptors. They transduce the signals mediated by a diverse range of signalling molecules, including ions, amines, and peptides, as well as photons, to mediate intracellular functions. These receptors play a fundamental role in many physiological responses such as cardiovascular functions. To remain responsive to their environment, cells must find a way to rapidly desensitize and resensitize their activated GPCRs. Desensitization of receptors, for instance, involves the phosphorylation of receptors by G protein-coupled receptor kinase (GRKs) followed by the recruitment of betaarrestin. This interferes with the binding of the G protein (the signalling effector). betaarrestin then targets the receptors to the clathrin endocytosis pathway, and serves as an adaptor linking receptors to other signalling pathways. Internalization of receptors serves not only to remove desensitized receptors from the plasma membrane, but also to engage receptors in the resensitization pathway. / The internalization of Angiotensin II (Ang II) type 1 receptor (AT1R) is controversial and poorly described. Therefore, our laboratory studies the mechanisms behind AT1R internalization. The agonist-induced internalization of AT1R begins with the formation of a complex including betaarrestin, the clathrin adaptor AP-2, and the tyrosine protein kinase, c-Src. In turn, this c-Src recruitment regulates the clathrin-mediated internalization of AT1R by controlling the formation of endocytic complexes during endocytosis. Indeed, the recruitment of c-Src is involved in the dissociation of AP-2 during receptor internalization. Based on our evidence that AP-2 and c-Src can be found in the same complex, we suggested that AP-2 could be phosphorylated by c-Src. Indeed, we found that Ang II induced the c-Src-mediated tyrosine phosphorylation of the beta-subunit of AP-2 (beta2-adaptin). We were able to map one of the tyrosines in beta2-adaptin and assess its role in regulating the binding of its principal partner: betaarrestin. The phosphorylation state of beta2-adaptin dictates its association profile with betaarrestin: when phosphorylated it reduces its binding to betaarrestin. Finally, we proposed a model for AT1R internalization. Overall, these studies are significant because they allow a better understanding of the underlying mechanism that regulates the initial steps of clathrin-coated vesicle endocytosis of AT1R.

The prevalence of obesity is rapidly increasing in affluent countries and in many urban areas of the developing world. Epidemiologic studies have associated obesity with increased burden of many cancer types but the mechanisms by which obesity induces transformation or promotes neoplastic growth remain to be fully elucidated. Possible mediators include insulin, free fatty acids, increased bio-availability of steroid hormones and inflammation. It is important to gain better understanding of the relationship between these diseases as new insights may provide new opportunities for cancer prevention and treatment. Metformin, a biguanide, is a drug often prescribed for treatment of type II diabetes. Recent retrospective epidemiologic data comparing diabetics taking metformin to diabetics taking other therapies suggests that metformin may reduce the risk of developing cancer or the risk of dying from cancer. These data contribute to the rationale for research to study the physiologic links between cancer and diabetes. Preliminary laboratory work has shown that metformin is an indirect activator of AMPK via its inhibitory action on oxidative phosphorylation in the mitochondria. AMPK is a sensor of cellular energy supply and activation of this serine/threonine kinase leads to inhibition of gluconeogenesis in the liver and reduced cell proliferation in transformed cells. We wished to expand these studies by using an in vivo model of cancer and diet-induced hyperinsulinemia in order to determine if metformin has anti-neoplastic action and if so, if the indirect (insulin lowering) systemic action of metformin or the direct AMPK mediated effect on neoplastic cells is responsible. We used mouse models of diet induced hyperinsulinemia by providing a high energy/high fat diet and a control diet ad lib in order to induce the desired metabolic phenotypes. As described in Chapter II, our results reveal that metformin attenuated the stimulatory effect of the high energy diet on growth of LLC1 carcinoma in vivo while having no effect on tumor growth in mice consuming a control diet. This suggested that the indirect, insulin lowering, effects of metformin played an important role in the attenuation of tumor burden, and these effects might be independent of AMPK activation in neoplastic cells. In Chapter III we show that the effects of diet and metformin on tumor growth described in Chapter II are reproducible in another cell line, MC38 colon carcinoma. In addition to the observed effects of metformin on tumor growth, we report that metformin reduced the cleavage of SREBP-1 and the expression of fatty acid synthase in MC38 colon carcinoma. The results presented in Chapters II and III did not separate the 'direct' from the 'indirect' effects of metformin on the attenuation of tumor growth. We address this problem in Chapter IV where we present data from an experiment that allowed us to study these effects independently by using cancer cell lines engineered to be insensitive to the 'direct' AMPK-mediated effects of metformin, grown in mice that were sensitive to metformin. We used shRNA to the decrease expression of LKB1 in two cancer cell lines and observed that these cells were resistant to metformin in vitro but were sensitive to metformin in vivo when grown in animals on either a high fat or control diet. Further analysis revealed that the loss of LKB1, a known tumor suppressor and activator of AMPK, may sensitize transformed cells to metformin under conditions of energy stress. / La fréquence d'apparition du nombre de personnes atteintes d'obésité augmente rapidement dans les pays riches ainsi que dans plusieurs zones urbaines des pays en voie de développement. L'augmentation du nombre de certains cancers est associée à l'obésité dans plusieurs études épidémiologiques mais le mécanisme par lequel l'obésité induit ou favorise l'apparition des tumeurs demeure encore à élucider. L'insuline, les acides gras, l'augmentation de la biodisponibilité des hormones stéroïdes ainsi que l'inflammation sont considérés comme des déclencheurs potentiels. De meilleures connaissances sur les interrelations entre ces maladies pouvant conduire a de nouvelles découvertes sur la prévention et le traitement du cancer, il est important de poursuivre les études sur ce sujet. La metformine, un biguanide, est un médicament généralement prescrit pour le traitement du diabète de type II. Une rétrospective de données épidémiologiques suggère que les patients traités avec la metformine présentent une diminution du risque de développer un cancer et du risque de décès lies à un cancer comparativement a des patients diabétiques recevant un autre traitement. Ces résultats sont à la base de plusieurs études sur les liens physiologiques existant entre le cancer et le diabète. Nos études préliminaires ont démontré que la metformine est un activateur indirect de l'AMPK par le biais de son action inhibitrice sur le mécanisme de phosphorylation oxydative dans les mitochondries. L'AMPK est un senseur du niveau d'énergie disponible pour la cellule et l'activation de cette sérine/thréonine kinase conduit à l'inhibition de la gluconéogenèse dans le foie ainsi qu'à la diminution de la prolifération des cellules transformées. Nous avons par la suite poursuivit ce travail grâce à l'étude d'un modèle animal composé de souris soumises a un régime contrôle ou hypercalorique dans le but d'induire un phénotype métabolique d'hyperinsulinisme. Ce modèle in vivo avait pour but de déterminer si les différences du taux d'apparition de cancer observées sont dues au mécanisme systémique (diminution du taux d'insuline) de ce médicament ou aux conséquences de son action au niveau l'AMPK dans les cellules néoplasique. Tels que décrits dans le chapitre II, nos résultats démontrent que contrairement aux souris du groupe contrôle, la metformine atténue la croissance tumorale stimulée par le régime hypercalorique. Ceci suggère que l'effet indirect de la metformine sur la diminution du taux d'insuline joue un rôle important dans la régression de la taille des tumeurs, indépendamment de l'activation de l'AMPK dans les cellules néoplasiques. Dans le chapitre III, nous avons démontrés que les effets sur la croissance tumorale, décrits dans le chapitre II, d'un régime hypercalorique et de la metformine sont reproductibles dans un autre modèle de lignée cellulaire, les cellules MC38 issues de carcinome de cancer du colon. En plus de son rôle au niveau de la voie de signalisation de l'insuline, nous avons observé que la metformine diminue le clivage de la protéine SREBP-1 et l'expression de l'enzyme acide gras synthase par les cellules MC38. Les résultats présentés dans les chapitres II et III ne nous permettent cependant pas de faire la distinction entre les effets directs et indirects de la metformine. Dans le chapitre IV, nous avons utilisé des shRNA dirigés contre la protéine LKB1, un suppresseur de tumeur et activateur de l'AMPK, dans deux lignées cellulaires et observé que ces cellules sont résistantes à la metformine in vitro. En revanche, ces cellules sont sensibles à ce médicament in vivo lorsqu'elles sont injectées dans les animaux, qu'ils soient ou non soumis à un régime hypercalorique. D'autres analyses ont révélé que la perte de la protéine LKB1 peut, dans des conditions de stress énergétique, sensibiliser à la metformine les cellules transformées.

Angiogenesis is a tightly regulated process by which new blood vessels are formed from pre-existing blood vessels. It is a complex process modulated by a multitude of pro- and anti-angiogenic factors, some of which naturally include members of the extracellular matrix (ECM) due to the high degree of tissue remodeling necessary in angiogenesis. Fibulin-5 (DANCE, EVEC) is an integrin- and elastin-binding ECM protein that is highly expressed in blood vessels during development, is up-regulated upon vascular injury and is involved in the regulation of the transition of vascular SMCs from a quiescent to proliferative state. Recently, Fbln5-/- mice have been shown to have an increase in cutaneous blood vessels, increased migration and proliferation of endothelial cells (ECs) and a 30-fold increase in angiopoietin-1 (Ang-1) expression in vascular SMCs, which is a potent promoter of angiogenesis. In the present study, we sought to investigate the molecular mechanism(s) by which fibulin-5 might act as a negative regulator of angiogenesis, with a focus on the modulation of Ang-1 activity in ECs. We used solid-phase binding assays to determine the direct physical interactions that fibulin-5 might have with Ang-1 and its receptor Tie-2. We used solid-phase binding assays to determine the cell surface molecules that fibulin-5 might bind and confirmed an RGD dependency of fibulin-5 for integrin binding and showed a high affinity for heparin, suggesting a potential interaction with cell surface heparan-sulfate proteoglycans. We also sought to understand the downstream signaling mechanism of fibulin-5 and established a novel Akt-dependent pathway by which fibulin-5 can act as an anti-angiogenic molecule. / L'angiogenèse est un processus finement régulé par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins se forment dans les vaisseaux sanguins préexistants. Il s'agit d'un processus complexe modulé par une multitude de facteurs pro-et anti-angiogéniques, qui incluent naturellement les membres de la matrice extracellulaire (MEC) en raison du degré élevé de remodelage tissulaire nécessaire dans l'angiogenèse. La Fibulin-5 (DANCE, EVEC) est une protéine de la MEC liant les intégrines et l'élastine. Elle est fortement exprimée dans les vaisseaux sanguins au cours du développement, est régulée à la hausse lors de lésion vasculaire et est impliquée dans la régulation de la transition des cellules musculaires lisses (CML) vasculaires d'un état de repos à un état de prolifération. Récemment, les souris Fbln5 -/- ont montré une augmentation de vaisseaux sanguins cutanés, une augmentation de la migration et de la prolifération des cellules endothéliales (CEs) et une augmentation de 30 fois de l'expression de l'angiopoïétine-1 (Ang-1) dans les CML vasculaires, un promoteur puissant de l'angiogenèse. Dans la présente étude, nous avons étudié le(s) mécanisme(s) moléculaire(s), par le(s)quel(s) la fibuline-5 pourrait agir comme un régulateur négatif de l'angiogenèse, plus précisément, sur la modulation de l'activité Ang-1 dans les CEs. Nous avons utilisé des essais de liaison en phase solide afin de déterminer les interactions physiques directes que la fibuline-5 pourrait avoir avec l'Ang-1 et son récepteur Tie-2. Nous avons également utilisé des essais de liaison en phase solide pour enquêter sur les molécules de surface cellulaire pouvant lier la fibuline-5 et nous avons confirmé que le motif RGD de la fibuline-5 sert à la liaison aux intégrines. De plus, la fibuline-5 a une grande affinité pour l'héparine, suggérant une interaction potentielle avec la surface cellulaire par les protéoglycanes héparane-sulfate. Nous avons également cherché à comprendre le mécanisme de signalisation en aval de la fibuline-5 et nous avons établi une nouvelle voie dépendante d'Akt dans laquelle la fibuline-5 agit comme une molécule anti-angiogénique.

The Bcl2 family proteins are central regulators of apoptosis; the primary form of physiological cell death. Furthermore, inappropriate activation or silencing of Bcl2 family members has been associated with cancer development and treatment resistance. These proteins therefore represent attractive therapeutic targets, and, in consequence, an increased understanding of the roles played by Bcl2 proteins will be important for the development and implementation of targeted therapies. Although best characterized with respect to their role at the mitochondria, it is now evident that Bcl2 proteins also function at the endoplasmic reticulum (ER). The focus of this thesis is on the role of Bcl2 proteins at the ER, specifically with respect to cell death initiated by the ER localized proteins Bik and p20Bap31. Bik and p20Bap31 were previously shown to initiate similar proapoptotic pathways, characterized by an early release of ER calcium stores, and inhibitable by Bcl2. The results of the current study are two-fold: first, using ER-targeted Bak and Bcl2 (Bakb5 and Bcl2b5) in a Bak/Bax deficient background, I have shown that Bik can disrupt an interaction between Bak and Bcl2 at the ER. Furthermore, Bik could overcome the protective effect of Bcl2b5 with respect to Bakb5. This finding provides the first direct evidence for regulation of cell death via binary interactions between Bcl2 family members at the ER. The second part of this study was designed to determine the roles of Bax/Bak and ER-restricted Bcl2 in the p20Bap31-initiated pathway. Using E1A/DNp53 transformed wild-type and Bax/Bak double knockout baby mouse kidney epithelial cells, I have shown that ectopic expression of p20Bap31, but not of Bik, can initiate a paraptosis-like form of non-apoptotic, Bax/Bak independent, cell death. Of particular importance, cell death could be delayed by Bcl2b5, in the absence of Bax/Bak; pointing to a novel, Bax/Bak independent, prosurvival role for Bcl2 at the ER. In summary, this study demonstrates the ability of Bcl2 family members to regulate cell death through binary interactions at the ER, and of Bcl2 to inhibit cell death in a Bax/Bak independent manner. Furthermore, a novel non-apoptotic cell death pathway initiated by p20Bap31 expression is identified. / La famille de protéines Bcl2 a une importance fondamentale dans le contrôle de l'apoptose; la forme principale de mort cellulaire physiologique. De plus, le développement de cancers et la résistance aux thérapies sont associés à l'activation ou la suppression de membres de la famille Bcl2. Cette famille de protéines représente une cible thérapeutique intéressante et par conséquent, une connaissance approfondie des rôles des protéines Bcl2 sera important pour amener et exécuter des thérapies ciblées. Tandis que le rôle de ces protéines à la mitochondrie est bien caractérisé, une fonction des protéines Bcl2 au niveau du réticulum endoplasmique (RE) est maintenant évidente. Cette thèse porte sur le rôle des protéines Bcl2 au niveau du RE, particulièrement concernant l'apoptose initiée par Bik et p20Bap31, deux protéines qui sont localisés au RE. Les voies de signalisation proapoptotique qui sont initiées par Bik et p20Bap31 sont caractérisées par une libération précoce d'une réserve de calcium du RE et sont inhibées par Bcl2. Les résultats de l'étude présente portent sur deux domaines: premièrement, en empruntant des formes de Bak et Bcl2 qui sont ciblées au RE (Bakb5 et Bcl2b5) sur un fond déficient en Bak et Bax, je démontre que Bik est capable de perturber l'interaction entre Bak et Bcl2 au RE. En outre, Bik peut surmonter l'effet protectrice contre l'apoptose de Bcl2b5 par rapport à Bakb5. Ce sont les premières évidences qu'une interaction binaire entre des membres de la famille Bcl2 au RE peut contrôler la mort cellulaire. La deuxième partie de cette étude était conçu pour déterminer le rôle de Bax/Bak et Bcl2 localisé uniquement au RE, dans la voie de signalisation initiée par p20Bap31. En utilisant des cellules provenant de l'épithélium rénale de souris nouveau-nés transformées par E1A/DNp53, soit de souche sauvage ou avec double knockout des gènes Bax et Bak, je démontre que l'expression ectopique de p20Bap31, mais non pas de Bik, peut initier une forme de mort cellulaire non-apoptotique indépendante de Bax/Bak qui ressemble la paraptose. Un résultat d'importance primordiale est qu'un délai de mort cellulaire attribué à Bcl2b5 s'avère dans l'absence de Bax et Bak, ce qui suggère un rôle pro-survie inattendu de Bcl2 au RE indépendant de Bax/Bak. Cette étude démontre une capacité de contrôler la mort cellulaire des membres de la famille Bcl2 par des interactions binaires au RE et une fonction inhibitrice de Bcl2 sur la mort cellulaire indépendante de Bax/Bak. De plus, une nouvelle voie de signalisation de mort cellulaire non-apoptotique initiée par p20Bap31 est identifiée.

Oocytes contain a large stock of mitochondria. These are essential because, following fertilization, the embryo does not resume mitochondrial DNA (mtDNA) replication until near the time of implantation; therefore, a large stock is essential to ensure that each blastomere inherits a sufficient number of mitochondria. However, the timing and control of mtDNA accumulation in oocytes are poorly understood. We have developed a PCR-based assay that enables the mtDNA content of individual mouse oocytes to be measured. We report that the quantity of mtDNA increases progressively during oocyte growth, reaching ~175,000 copies per cell. When oocytes reach full-size, however, mtDNA ceases to accumulate suggesting that accumulation of mtDNA is closely correlated with oocyte growth. To investigate the mechanism of accumulation, we analyzed mtDNA content in mouse oocytes grown in vitro. As in vivo, we found that mtDNA content increased during oocyte growth in vitro. Unexpectedly, although oocytes did not grow to the same size in vitro as in vivo, the mtDNA accumulated to the same extent under both conditions. This suggests that mtDNA accumulation is mechanistically uncoupled from oocyte growth. To test this, we incubated growing oocytes in the presence of LY294002, an inhibitor of phosphoinosotide-3 kinase, or in the absence of the surrounding granulosa cells. As expected, oocyte growth was inhibited under both conditions. In contrast, mtDNA accumulated in the oocytes despite the growth inhibition. These results indicate that the accumulation of mtDNA is independent of increase in size during oocyte growth. We then examined the expression of nuclear-encoded genes required for mtDNA replication. The amount of Tfam, Polga, and Polgb increased co-coordinately with oocyte growth. However, their quantity subsequently declined in fully grown oocytes. We propose that mtDNA ceases to accumulate in fully grown oocytes owing to the loss of the mRNAs encoding these essential components of the replication machinery. Thus, these mRNAs may be limiting factors that determine the rate and extent of mtDNA accumulation during oogenesis. We also evaluated the ATP content during oogenesis as a function of mtDNA activity. Growing oocytes showed a higher ATP content than fully grown oocytes and as oocytes developed toward meiotic maturation ATP level significantly decreased. These results suggest that growing oocytes may have increased energy needs than the subsequent developmental stages. / Durant sa croissance, chaque ovocyte doit accumuler un grand nombre de mitochondries, essentielles pour le développement embryonnaire ultérieur. Après la fécondation, le stock de mitochondries ovocytaire doit être suffisant pour assurer les divisions successives de chaque blastomère de lèmbryon puisque que la reprise de la réplication de làDN mitochondrial (mtDN ne s`observe quàvant l`implantation. Les mécanismes régulant làccumulation de mtDNA durant la croissance ovocytaire et les étapes de celle-ci sont cependant encore mal connus. Dans ce travail, nous avons mis au point une technique PCR permettant de mesurer la quantité de mtDNA dans un seul ovocyte. Les résultats montrent que la quantité de mtDNA augmente progressivement pendant la croissance ovocytaire pour atteindre environ 175000 copies par cellule. Lorsque l`ovocyte atteint sa taille finale, làccumulation de mtDNA sàrrête, suggérant une corrélation entre la croissance et làccumulation de mtDNA. Nous avons ensuite vérifié cette hypothèse en mesurant la quantité de mtDNA pendant la croissance ovocytaire in vitro dans différentes conditions. De la même manière, nous avons observé une accumulation de mtDNA durant la croissance ovocytaire in vitro. Cependant, bien que la croissance ovocytaire soit moindre in vitro comparée à celle obtenue in vivo, la quantité de mtDNA accumulée est comparable dans les deux conditions. Lorsque les ovocytes sont mis en culture en présence dùn inhibiteur de la phosphoinosotide-3 kinase (LY294002), ou en làbsence de cellule de la granulosa, la croissance ovocytaire in vitro est inhibée mais làccumulation de mtDNA est maintenue. Ces résultats montrent que làccumulation de mtDNA est indépendante de la croissance ovocytaire. Nous avons ensuite analysé lèxpression des gènes nucléaires essentiels à la réplication de mtDNA. Lèxpression des ARNm de Tfam, Polga, et Polgb augmente parallèlement à la croissance ovocytaire mais diminue lorsque l`ovocyte a atteint sa taille finale. Ces résultats suggèrent que làrrêt de làccumulation de mtDNA en fin de croissance ovocytaire est liée à làrrêt de la transcription des gènes essentiels à sa réplication. La présence dàRNm de ces différents gènes pourraient être le facteur limitant la régulation de làccumulation de mtDNA dans l`ovocyte durant sa croissance. Nous avons également évalué la quantité dàTP dans les ovocytes. Les ovocytes en croissance sont plus riches en ATP que les ovocytes ayant atteints leur taille définitive et la quantité dàTP chute lors de la maturation méiotique de l`ovocyte. Ces résultats suggèrent que les ovocytes en croissance ont un besoin énergétique supérieur comparé á ceux á des stades ultérieurs.

The mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling pathways play key roles in mediating inflammatory responses. Asthma is a disease characterized by excessive inflammation and the mainstay of treatment is the use of glucocorticoids which, among other effects, control the activity of p38 MAPK. Human airway smooth muscle (HASM) cells contribute to the pathology of asthma as they regulate bronchomotor tone, proliferate, migrate and secrete inflammatory cytokines. I investigated these processes in HASM using MAPK inhibitors and the glucocorticoid dexamethasone. Following TNFα stimulation, HASM cell production of GM-CSF, IL-1β, IL-33 and CXCL8 were ERK1/ERK2 dependent; all but CXCL8 were diminished by dexamethasone. Neutrophil migration in response to conditioned media from HASM cells was also ERK1/ERK2 dependent. CXCL12 displayed chemotactic activity for HASM which was shown to express the CXCR4 receptor. HASM migration was partially p38 MAPK dependent. These results highlight the potential for important and divergent roles for the MAPKs in HASM in refractory asthma. / L'asthme est une maladie inflammatoire dont les glucocorticoïdes constituent le principal traitement via le contrôle de la voie p38 MAPK. Les cellules musculaires lisses bronchiques (CLM) jouent un rôle clé dans la physiopathologie de l'asthme notamment dans le remodelage des voies aériennes via leur capacité à proliférer, migrer et sécréter des médiateurs inflammatoires. La stimulation des CLM avec du TNFα entraine une activation des voies MAPK ERK et p38, induisant l'expression des gènes GM-CSF, IL-1β, IL-33 et CXCL8. L'activation de la voie MAPK ERK est importante dans la migration des neutrophiles exposée à du milieu conditionné provenant de CLM stimulées par TNFα via son rôle sur l'expression de CXCL8. En contrepartie, la voie p38 MAPK joue un rôle important dans la migration des CLM en réponse à CXCL12, un chimiokine élevée dans les bronches de patients asthmatiques. Ces résultats ont mis en évidence un rôle important et divergeant des MAPKs dans les CLM dans la pathophysiologie de l'asthme sevère.

Rab GTPases are crucial regulators of all aspects of membrane trafficking in eukaryotic cells. Rabs switch between active, GTP-bound, and inactive, GDP-bound forms, a factor central to their ability to control the correct spatial and temporal recruitment of effector proteins that mediate the various steps involved in intracellular trafficking. The activation of Rabs is mediated via guanine nucleotide exchange factors (GEFs) which exchange GDP for GTP on the Rab, while inactivation is via GTPase activating proteins which increase the rate of hydrolysis of GTP to GDP. The general objective of this doctoral research was the study of a family of novel proteins containing a new class of Rab GEF, the DENN domain. The DENN (differentially expressed in normal and neoplastic cells) domain is a common, evolutionarily ancient being present in S. pombe and conserved protein module found in 18 different proteins in humans. The first function ascribed to a DENN domain came with our discovery that the DENN domain of connecdenn 1 is a GEF for Rab35, a GTPase involved in regulating endosomal trafficking and actin dynamics. We found that there are two novel members of the connecdenn family, connecdenn 2 and 3. Via their DENN domains, the connecdenns all act as GEFs for Rab35 with distinctly different rates of activity.While the N-terminal DENN domain of the connecdenns are well conserved, the C-terminal half of the connecdenns share little sequence homology. We therefore sought to characterize the function of connecdenn 2 and 3, specifically why has a family of three different GEFs targeting Rab35 evolved, and what roles do the divergent C-termini of the connecdenns have in regulating the activation of Rab35. We found that like connecdenn 1, loss of connecdenn 2 results in an enlargement and perinuclear clustering of early endosomes, consistent with the role of Rab35 in regulating endosomal recycling routes. Furthermore, connecdenn 2 is also a component of clathrin-coated vesicles, however we found that connecdenn 2 contains a new motif to bind to the clathrin adaptor AP-2 using a distinct site on AP-2 compared to that utilized by connecdenn 1. Interestingly, connecdenn 3 contains a unique C-terminal motif to bind actin, and is therefore able to activate Rab35 for its role in regulating actin dynamics. Together, these results demonstrate how proteins containing a common GEF domain can control a Rab towards very different cellular functions.Globally, this doctoral project revealed new insights into the regulation of intracellular membrane trafficking events by the identification and characterization of proteins containing a new class of Rab GEF, the DENN domain. / Les GTPase Rab sont des régulateurs cruciaux de tous les aspects du trafic membranaire dans les cellules eucaryotes. Les Rabs existent sous deux états, une forme active quand elles sont liées au GTP, et une forme inactive quand elles sont liées au GDP. Cette capacité d'échange est essentielle pour leur permettre de contrôler spatialement et temporellement le recrutement de protéines effectrices, qui vont coordonner toutes les étapes du trafic intracellulaire. L'activation des Rabs se fait par les facteurs d'échange de nucléotide guanine (GEF), qui vont échanger le GDP de la Rab pour le GTP, alors que l'inactivation se fait par les protéines d'activation de la GTPase (GAP), qui vont accélérer le taux d'hydrolyse du GTP en GDP. L'objectif général de cette thèse de doctorat était d'étudier une nouvelle classe de GEF, la famille de protéines possédant un domaine DENN. Le domaine DENN (« differentially expressed in normal and neoplastic cells ») est un module de protéine commun, présent chez S. pombe, et bien conservé au cours de l'évolution. Chez l'homme, il est présent dans 18 protéines différentes. Au laboratoire, nous avons décrit pour la première fois une fonction pour un domaine DENN. Nous avons mis en évidence que via son domaine DENN, la protéine connecdenn 1 est une GEF pour Rab35, une GTPase qui intervient dans la régulation du trafic endosomal ainsi que dans la régulation de la dynamique de l'actine. Nous avons également identifié deux autres membres de la famille connecdenn : les protéines connecdenn 2 et 3, et nous avons mis en évidence que via leur domaine DENN, toutes les connecdenns sont des GEFs pour Rab35, avec toutefois un taux d'activité spécifique à chaque membre. Bien que la partie N-terminale de leurs domaines DENN soient bien conservées, les séquences de la moitié C-terminale des connecdenns ont très peu d'homologie entre elles. Nous avons donc cherché à caractériser la fonction des connecdenn 2 et 3. Nous voulions particulièrement déterminer pourquoi une famille contenant trois différentes GEFs pour Rab35 a ainsi évolué, et quel est le rôle de leur parties C-terminales divergentes dans la régulation de l'activation de Rab35. Nous avons trouvé que comme pour connecdenn 1, une inhibition de l'expression de connecdenn 2 cause un élargissement des endosomes précoces ainsi que leur regroupement autour du noyau, ce qui est consistant avec le rôle de Rab35 dans la régulation des voies de recyclage au niveau des endosomes. De plus, connecdenn 2 est également une composante des vésicules mantelées de clathrine, mais nous avons trouvé que connecdenn 2 contient un nouveau motif pouvant interagir avec l'adaptateur de clathrine AP-2, et qu'elle se lie à un site d'AP-2 différent de ceux utilisés par connecdenn 1. Enfin, de manière intéressante, connecdenn 3 contient un motif unique d'interaction avec l'actine, et est donc est capable d'activer Rab35 pour qu'elle intervienne dans la régulation de la dynamique de l'actine. Ensemble, ces résultats démontrent comment différentes protéines possédant un domaine GEF commun peuvent contrôler spécifiquement les différentes fonctions d'une même Rab dans la cellule. Globalement, ce projet de doctorat a permis d'illustrer de nouveaux mécanismes de régulation du trafic des membranes intracellulaires par l'identification et la caractérisation de protéines présentant une nouvelle classe de domaine GEF pour les Rabs, le domaine DENN.

Abstract:Signal transduction is an essential mechanism through which information generated by environmental cues can modulate cellular functions and genetic programs. The so-called canonical Wnt/β-catenin pathway has long been known for its critical role in regulation of cell proliferation and differentiation. The key mechanism in this pathway is phosphorylation of β-catenin, but the precise mechanism of its regulation remains poorly understood. This study aims, for the first time, to directly investigate the activity of the core complex responsible for phosphorylation of β-catenin. This complex is built on a scaffold protein called Axin, and is thought to include at least two types of kinases, casein kinase 1 (CK1) and glycogen synthase 3 (GSK3). I have established and optimized an in vitro kinase assay that allowed me to dissect various aspects of β-catenin phosphorylation, including sensitivity of the endogenous activity to various inhibitors, identification of distinct cellular pools with different properties, localization of the activities in subcellular compartments. I have discovered an interesting effect of stimulation of the pathway by secreted Wnt: indeed, β-catenin phosphorylation seems to be regulated differently at short times after the start of stimulation and at later times. I have obtained a preliminary identification of the subcellular compartment where the long term regulation may take place and set the conditions for future detailed investigation of these regulatory events. My results demonstrate that β-catenin degrees of regulation vary with the levels of β-catenin, with the complex location and composition, both in stimulated and non-stimulated cells. These findings highlight the complex and fine tuning controlling this central process in Wnt signaling. / La transduction de signal est un procédé fondamental qui permet aux cellules de moduler leur programme génétique et leurs fonctions en réponse à l'information qu'elles recoivent de l'environnement extra-cellulaire. La voie de signalisation canonique des protéines Wnt/Béta-caténine est connue pour son rôle crucial dans la régulation de la prolifération et de la différentiation des cellules. L'évènement majeur de cette voie est la phosphorylation de la β-caténine, mais le méchanisme de sa régulation n'a pas encore été précisément éllucidé. La présente étude constitue, pour la première fois, une investigation de l'activité du complexe protéique responsable de la phosphorylation de la β-caténine. Ce complexe, qui repose sur une protéine d'échafaudage appelée Axin, comprend au moins deux kinases : la caséine kinase 1 (CK1) et la glycogène synthase 3 (GSK3). J'ai établi et optimisé un essai kinase in vitro afin de pouvoir étudier différents aspects de la phosphorylation de la β-caténine, notamment son degré de sensibilité à divers inhibiteurs, la localisation cellulaire de son activité, ou encore l'identification de plusieurs « pools » de β-caténine à propriétés distinctes. J'ai découvert que, suite à la stimulation par Wnt de la voie « Wnt/ β-caténine », la phosphorylation de la β-caténine semble être régulée différemment au cours du temps. J'ai également abouti à une identification préliminaire du compartiment cellulaire dans lequel la β-caténine pourrait être régulée à long terme. Mes résultats démontrent que le degré de régulation de la β-caténine varie, à la fois dans les cellules stimulées et non stimulées par Wnt, en fonction de l'abondance de la protéine, de sa localisation, et de la composition du complexe dont elle fait partie. Ces trouvailles soulignent la complexité du contrôle d'un évènement majeur de la voie de signalisation Wnt.

A variety of studies were conducted in model and biological membrane systems to examine the phenomenon of putative 'lipid raft' microdomains in the plasma membrane of mammalian cells. The studies focused on understanding the physical properties of lipid rafts, and how these properties influence the partitioning of lipids and lipidated proteins into raft-like membrane domains; and finally, how lipid raft properties play a role in mediating T-cell signaling. / The model membrane system employed in the majority of our studies utilized a fluorescence-quenching assay that could directly monitor the partitioning of various lipidated molecules into liquid-ordered, raft-like domains in membrane vesicles exhibiting liquid-ordered/liquid disordered phase coexistence. The use of this system allowed us to determine that lipids consisting of long, saturated lipid chains partitioned more favorably into lipid-raft like domains compared to that of lipids consisting of unsaturated lipid chains, and that the headgroup structure of sphingolipids can affect their ability to partition into liquid-ordered domains. Combining our model membrane studies with cellular studies, we were then able to show that peptide sequences containing saturated N-myristoyl/S-acyl lipid modifications similar to those found in proteins such as Src tyrosine kinases, and the Galpha subunit, preferentially partitioned into liquid-ordered raft-like domains; compared to that of peptide sequences consisting of S-acyl/S-farnesyl lipid modifications, similar to those found in the Ras family of proteins, which partitioned greatly with the liquid-disordered membrane phase. / In our last study, we incorporated polyethyleneglycol (PEG) lipid conjugates into the plasma membrane of Jurkat T-cells as a novel means to study lipid raft involvement in T-cell signaling. Crosslinking of both fully saturated PEG lipid conjugates and fully unsaturated PEG lipid conjugates invoked early events in T-cell activation, leading us to believe that lipid rafts per se may not be specifically involved in mediating T-cell signaling events during crosslinking of endogenous outer plasma membrane proteins.