P21Waf1/Cip1 is a potent inhibitor of cell cycle progression and functions by binding to and inhibiting cyclin-dependent kinases. Millimolar amounts of butyrate can induce cell cycle arrest in mammalian cells through induction of p21Waf1/Cip1 expression. In butyrate resistant variants isolated from HeLa cells, clones 5.1 and 7.5 express high levels of p21Waf1/Cip1, in regular growth medium and in medium containing butyrate. Despite this elevated levels of P21Waf1/Cip1, the cells continue proliferating, albeit at a slower rate than the parental HeLa cells. Western blot analyses showed that other cell cycle proteins were not up regulated to compensate for the elevated expression of this inhibitor. Instead, specific enzymatic assays showed that the cdk2/cyclin E activity in these clones was not inhibited by P21Waf1/Cip1, but remained active to allow the cells to continue to cycle in butyrate.

The eukaryotic Rho family of GTPases acts as central regulators of numerous processes, including the polarization of cell morphology, membrane transport, transcription, and MAPK pathway signaling. As GTPases, Rho proteins act as molecular switches which, in the GTP-bound form, transduce upstream signals to a variety of downstream effectors, thereby generating appropriate cellular responses. As central nodes of signaling, they are subject to strict regulation, and the regulation of the GTP-GDP cycle of Rho members has been well characterized. Rho GTPases participate in a variety of pathways, though in many cases the mechanisms are still poorly understood. This study examines the roles and regulation of two Rho GTPases in Saccharomyces cerevisiae, Rho5p and Cdc42p. First, we describe the regulation of Rho5p signaling by phosphorylation and ubiquitination, the first instance of post-translational regulation of a yeast Rho-type GTPase. This regulation is mediated by a module involving the Npr1p kinase and its inhibitor Msi1p. We also identify Rgd2p as the RhoGAP for Rho5p in vivo, and demonstrate a genetic interaction between RHO5 and STE50: a STE50 deletion combined with expression of an activated RHO5 allele results in osmotic sensitivity. Next, we describe a role for Rho5p in the activation of the cAMP-PKA pathway. Expression of an activated allele of RHO5 generates a number of phenotypes associated with activated cAMP-PKA pathway signaling, and also suppresses the lethality of a strain deleted for two other cAMP-PKA activators, Δras1 Δras2. A mechanism by which Rho5p may activate the pathway is suggested by the observed two-hybrid interaction between Rho5p and adeny / La famille eucaryote des GTPases Rho agit à titre de régulateur principal de nombreux processus biologiques, incluant la polarisation de la morphologie cellulaire, le transport membranaire, la transcription et la voie de signalisation MAPK. En tant que GTPases, les protéines Rho jouent un rôle de controlleurs moleculaires qui, sous la forme liée au GTP, transmettent les signaux en amont à une variété d'effecteurs en aval, générant ainsi les réponses cellulaires appropriées. Étant des acteurs principaux de la signalisation, les protéines Rho sont sujettes à une régulation précise. La régulation du cycle GTP-GDP par les membres de la famille Rho a été largement caractérisée. Cependant, les GTPases Rho participent à une variété de mécanismes qui, dans plusieurs cas, sont encore aujourd'hui sous-étudiés. Cette étude examine plus particulièrement les rôles et la régulation de deux GTPases Rho chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Rho5p and Cdc42p. Dans un premier temps, nous décrivons la régulation de la signalisation de Rho5p par la phosphorylation et l'ubiquitination, ceci étant le premier exemple de régulation post-traductionnelle d'une GTPase de type Rho chez la levure. Cette régulation est arbitrée par un module impliquant la kinase Npr1p et son inhibiteur MSi1p. Nous démontrons également une interaction génétique entre RHO5 et STE50. En effet, une délétion au niveau de STE50 combinée à l'expression d'un allèle activé de RHO5 résulte en une sensibilité osmotique. De plus, nous identifions Rgd2p comme étant le RhoGAP pour Rho5p in vivo. Dans un deuxième temps, nous décrivons un rôle pour Rho5p dans l'activation d

Apoptosis is an evolutionarily conserved form of programmed cell death that is essential for normal development, the maintenance of tissue homeostasis and the elimination of virus-infected and damaged cells. Mcl-1, a Bcl-2 family member, plays a critical pro-survival role in the development and maintenance of both normal and malignant tissues. Mcl-1 expression can be rapidly induced in response to survival factors through induction of Mcl-1 transcription. However, its levels are also tightly controlled by ubiquitin-dependent protein degradation by the 26S proteasome. This rapid protein turnover plays an essential role in the initiation of apoptosis following conditions of stress induced protein synthesis inhibition. Here I present the identification of a novel BH3-only Hect E3-ligase, LASU1 (now also known as Ureb-1, E3histone, ARF-BP1, Mule and HectH9). LASU1 interacted specifically with Mcl-1 via its BH3 domain, and ubiquitinated Mcl-1 in vitro. Furthermore, LASU1 was required for the proteasome-dependent degradation of Mcl-1 in HeLa cells as knock down of LASU1 by siRNA increased Mcl-1 levels. A competing BH3-ligand derived from Bim interacted with Mcl-1 and prevented its interaction with LASU1, causing elevation of the steady state levels of Mcl-1. This suggests that the unliganded form of Mcl-1 is particularly sensitive to LASU1-mediated degradation. Following SDS-PAGE, Mcl-1 resolves into two isoforms, with the small isoform being less sensitive to ubiquitin-mediated protein turnover. I found that this small isoform was the result of alternative translational initiation at Mcl-1 codon 38 (human) or 34 (mouse). This generated an N-terminally truncated Mcl-1 protei / L'apoptose est une forme de mort cellulaire programmée ayant été conservée évolutivement et qui demeure essentielle pour le développement normal, pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et l'élimination des cellules endommagées et de celles infectées par des virus. Mcl-1, une protéine membre de la famille Bcl-2, joue un rôle de survie déterminant dans le développement et le maintien des tissus tant sains que malins. En réponse aux facteurs de survie, l'expression de Mcl-1 peut-être rapidement induite par induction de la transcription de Mcl-1. Toutefois, son niveau demeure également régulé de façon étroite par l'activité protéolytique du système ubiquitine-protéasome 26S. Un renouvellement protéique rapide de la sorte joue un rôle essentiel dans l'initiation de l'apoptose suite à l'inhibition de synthèse de protéine induite par le stress. J'identifie ici une nouvelle ligase, LASU1, une E3 ligase de la famille HECT dite à BH3 seulement (BH3-only) (maintenant aussi appelée Ureb-1, E3histone, ARF-BP1, Mule et HectH9). LASU1 interagit de façon spécifique avec Mcl-1 par son domaine BH3 et Mcl-1 ubiquitinée in vitro. De plus, dans les cellules HeLa la dégradation de Mcl-1 par protéasome nécessita LASU1, son absence conduisant à l'augmentation des niveaux de Mcl-1 tel que cela fut observé dans nos expériences de knock-down de LASU1 par ARN interférents. Un ligand compétitif à BH3 dérivé de Bim interagit avec Mcl-1 et empêcha son interaction avec LASU1, augmentant ainsi les niveaux d'état stationnaire de Mcl-1. Ceci suggèrait que la forme non ligandé de Mcl-1 puisse être particulièrement sensible à la dégradation par l

Human carcinoembryonic antigen (CEA) is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Iinked cell surface glycoprotein which is overexpressed in several human cancers. CEA, and the CEA family members, non-specific crossreacting antigen (NCA) and biliary glycoprotein (BGP) are members of the immunoglobulin superfamily and all mediate homotypic adhesion. Ectopic expression of CEA in rat L6 and mouse C2 myoblasts can completely block myogenic differentiation. It is demonstrated here that CEA alone and in cooperation with avian v-Myc and human Bcl-2, can result in malignant cellular transformation, effects which are dependent on CEA's differentiation-blocking activity. Ectopic expression of v-Myc and c-Myc proteins in L6 transfectant cells were shown to induce programmed cell death (apoptosis) and surprisingly, myogenic differentiation, a novel function for Myc proteins. Induction of both of these cellular programs required the highly conserved subdomain, Myc homology box 2, in the Myc transactivation domain. L6 cells expressing v-Myc and Bcl-2 displayed reduced apoptosis, yet were limited in their transformation capacity owing to the persistence of v-Myc-induced differentiation. Cells expressing v-Myc Bcl-2, and CEA in combination were completely inhibited in executing their differentiation program, displayed an increased capacity to grow when deprived of anchorage to a substratum, and rapidly formed tumours in nude mice. Significantly, the critical prerequisite for the generation of transformed cells was the presence of CEA. / The structural requirements for the differentiation blocking activity of CEA were also investigated. Like CEA, GPI-linked NCA also inhibits myogenic differentiation, whereas a transmembrane family member, biliary glycoprotein, BGP has no effect. Using cDNA constructs encoding chimeric proteins of CEA, BGP, and a GPI-linked musclespecific isoform of human neural cell adhesion molecule, which accelerates differentiation, it is demonstrated that the differentiation-blocking activity of CEA absolutely requires the 32 C-terminal amino acid residues of CEA which form the signal sequence for GPI-membrane attachment.

Iron (Fe) is essential for the activity of many proteins and enzymes, such as [Fe-S] proteins, ribonucleotide reductase and innumerable other non-heme iron proteins as well as heme proteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. In mammals iron is transported in plasma by a glycoprotein, transferrin (Tf), which contains two specific high affinity Fe3+ binding sites. Physiologically, most cells in the organism acquire iron from Tf following its binding to a specific membrane protein, Tf receptor (TfR). / Iron regulatory proteins (IRP1 and IRP2) control the synthesis of TfR and ferritin by binding to iron-responsive elements (IREs) which are located in the 3' untranslated region (UTR) and the 5 ' UTR of their respective mRNAs. / In this study, I investigated various aspects of iron metabolism in inflammatory macrophages treated with NO donors or cytokines, since in activated macrophages NO is one of the major effector molecules produced by the enzyme called NO synthase. I stimulated RAW 264.7 cells (a murine macrophage cell line) with interferon-gamma (IFN-gamma) and lipopolysaccharide (LIPS), a treatment that induces NO synthase and NO production in these cells. I showed that LIPS and IFN-gamma increased IRP1 binding, but decreased RNA-binding of IRP2, followed by its degradation. Moreover, the decrease of IRP2 binding/protein levels was associated with a decrease in TfR mRNA levels and an increase in ferritin synthesis in LPS/IFN-gamma treated cells, and these changes could be prevented by inhibitors of inducible NO synthase. I also showed that IRP2 is a target for nitrosonium ion (NO+) which causes S-nitrosylation of this protein, leading to its degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. NO+-mediated IRP2 degradation was associated with a dramatic decrease in TfR mRNA levels and an increase in ferritin synthesis associated with an increase in iron incorporation into ferritin. These changes occurred without any change in the IRE binding activity of IRP1, strongly suggesting that IRP2 alone can play a key role in controlling iron metabolism. Importantly, the unique 73 amino acid region of IRP2 contains 5 cysteines, and I showed that mutation of one of these cysteine (Cys178) blocked the degradation of IRP2 in NO+-treated cells. Taken together, these observations suggest that S-nitrosylation represents a signal for IRP2 ubiquitination and consequent proteasomal degradation, and that this may be an important mechanism in controlling iron homeostasis in macrophages. (Abstract shortened by UMI.)

The cytoplasmic droplet, a small localized outpouching of cytoplasm of epididymal spermatozoa of unknown biological significance, contains numerous saccular elements as the near exclusive membranous component. These saccules were isolated by subcellular fractionation to raise antibodies, which immunolabeled not only saccules of the droplet in situ but also Golgi apparatus in somatic epithelial cells lining the epididymus. Immunocytochemical studies at the light and electron microscopic levels further revealed the saccular elements as the exclusive site of reactivity for Golgi apparatus markers TGN 38, $ alpha$ 2,6 sialyltransferase and $ beta$ 1,4 galactosyltransferase. The isolated droplet fraction was enriched in galactosyltransferase and sialyltransferase activities, and endogenous glycosylation assays identified the modification of several endogenous glycopeptides. In situ lectin binding assay on electron microscopy demonstrated D-galactose and N-acetyl galactosamine constituents in the saccules within the droplet and also in the adjacent plasma membrane. The glycosylating activities in the saccular elements may be related to plasma membrane modifications which occur during epididymal spermatoza maturation.

The ubiquitin-dependent ATPase, p97, extracts ubiquitinated protein from macromolecular complexes by utilizing ATP-driven conformational changes. Consequently, p97 facilitates essential cellular quality control processes upstream of the proteasome, including endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD) and ubiquitin fusion degradation (Ufd). Mutations in p97 are linked to an unusual muti-systemic disease (IBMPFD), involving skeletal muscle degeneration, Paget disease of bone, and fronto-temporal dementia, where the accumulation of ubiquitin-rich protein aggregates suggests impairment in p97-dependent activities. Interestingly, the accumulation of ubiquitin-rich aggregates is also well documented in common neurodegenerative diseases, such as Alzheimer Disease (AD). This thesis is focused on (i) understanding the structural and biochemical consequences of p97 mutations, and (ii) substantiating whether disruption of p97 cell biological function occurs in neurodegeneration. First, we employed a variety of biochemical and biophysical approaches to show that two p97 mutations, Arg155Pro and Ala232Glu, alter the conformational state and ATPase activity. We further demonstrated that these alterations were directly related to p97 protein aggregation in solution. Secondly, we identified p97 as a target of Caspase-6 (Casp6) proteolytic activity in AD and further demonstrated that the overexpression of a Casp6 cleaved p97 fragment compromises the ubiquitin-proteasome system (UPS). Finally, considering the role of IBMPFD-linked p97 mutations in activating caspases, we used simulation annealing modeling to provide evidence that structural defects in pathogenic p97 mutants enhanced p97 susceptibility to caspase-mediated processing. We further showed that p97 was indeed cleaved in dystrophic neurites and activated astrocytes of patients diagnosed with p97-linked fronto-temporal dementia (FTD). Collectively, this work identifies caspase-mediated cleavage of p97 as / La p97, une ATPase ubiquitine-dépendante, extrait des protéines ubiquitinées des complexes macromoléculaires en utilisant les changements conformationnels activés par l'ATP. Conséquemment, la p97 facilite les processus essentiels du contrôle-qualité cellulaire en amont du protéasome, incluant la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD) et la voie de dégradation des fusions ubiquitinées (Ufd). Les mutations dans la p97 sont liées à une maladie multisystémique inhabituelle (IBMPFD), impliquant comme effets la dégénération musculosquelettique, la maladie osseuse de Paget et la démence fronto-temporale, où l'accumulation d'aggrégats protéiques riches en ubiquitine suggère la perturbation des activités dépendantes à la p97. Il est intéressant de noter que cette accumulation d'aggrégats riches en ubiquitine est aussi bien démontrée dans les maladies neurodégénératives, telle que la maladie d'Alzheimer (MA). Cette thèse s'intéresse à (i) comprendre les conséquences structurales et biochimiques des mutations dans la p97, et (ii) confirmer si la pertubation de la fonction cellulaire biologique de la p97 s'observe dans la neurodégénération. D'abord, nous avons utilisé une variété d'approches biochimiques et biophysiques pour révéler que les deux mutations dans la p97, Arg155Pro et Ala232Glu, modifient l'état conformationnel et l'activité ATPase. Nous avons de plus démontré que ces altérations étaient directement liées à l'aggrégation protéique de la p97 en solution. Ensuite, nous avons identifié la p97 comme étant une cible de l'activité protéolytique de la Caspase-6 (Casp6) dans la MA et ainsi prouvé que la surexpression d'un fragment p97 clivé par la Casp6 compromet le système ubiquitine protéasome (UPS). Enfin, en tenant compte du rôle des mutations dans la p97 liées à l'IBMPFD dans les caspases activatrices, nous avons utilisé un modèle de simulation de l'appariement pour prouver que$

The greater wax moth, Galleria mellonella, is used extensively as a model to study innate immunity. The multicellular process of nodulation acts to isolate large numbers of small microbes (bacteria and yeasts) in the open circulatory system (hemocoel) of the insect and is directed by the main immune blood cell (hemocyte) types, the granular cells and the plasmatocytes. G proteins and their downstream products have been implicated in both early (hemocyte-microbe adhesion) and late (humoral) immune responses, however, their involvement in hemocyte-hemocyte interactions leading to nodule formation is not known. Herein, I treated hemocytes with an AB5 protein, whole cholera toxin (CTX), known to stimulate the Gαs subunit of heterotrimeric G proteins and is responsible for activating adenylate cyclase and elevating intracellular cAMP in mammalian neutrophils. CTX caused a bimodal increase in hemocytes per in vitro microaggregate and nodule frequency in vivo, wherein increasing high cholera toxin concentrations induced these effects, while low concentrations induced levels of hemocytes per in vitro microaggregate and nodule frequency similar to the highest concentration of CTX, but the hemocytes showed reduced substratum-related adhesion. CTX-dependent bacterial (Bacillus subtilis) removal from the insect hemocoel was inversely correlated with nodule frequency. The cholera toxin B-subunit was responsible for the effects of CTX at higher concentrations, while isolated cholera toxin A-subunit had no effect on the hemocytes. In vitro CTX-induced, hemocyte microaggregate formation was inhibited by RGD peptides, suggesting the involvement of integrins. Human integrin antibodies to αv, β3, α5, and β1 bound integrin-like molecules from unseparated, whole hemocyte lysates and labeled both the granular cells and plasmatocytes adhering to coverslips. The anti-α5 integrin labeled the junction between interacting granular cells and plasmatocytes, the frequency of this labeli / La fausse teigne de la cire, Galleria mellonella, est utilisée extensivement comme modèle pour etudier le système immunitaire inné. Le processus multicellulaire de nodulation isole de grandes quantités de microbes de petite taille (bacteries et levures) dans l'appareil circulatoire (hémocèle) de l'insecte et est controlé par les deux cellules sanguines immunitaires (hémocytes) principales: les cellules granulaires et les plasmatocytes. Les protéines G et leurs produits de réactions sont impliqués dans les réponses immunitaires precoces (l'adhésion hémocytes-microbes) et tardives (humorale), cependant, leur participation dans les intéractions hémocytes-hémocytes conduisant à la formation des nodules demeure inconnue. Ci-dessous, j'ai traité les hémocytes avec la protéine AB5, la toxine cholérique (CTX), reconnue pour sa stimulation des Gαs, une sous-unité des protéines G hétérotrimériques et est responsable de l'activation de l'adénylate cyclase et de l'augmentation de l'AMP cyclique intracellulaire dans les neutrophiles mammifère. La CTX a causé une augmentation bimodale du nombre d'hémocytes par micro-agrégats in vitro et de la fréquence des nodules in vivo. L'augmentation des concentrations élevées a induit une augmentation de ces paramètres, tandis que de faibles concentrations induit des taux d'hémocytes par micro-agrégats in vitro et de la fréquence de nodules in vivo semblables à ceux obtenus avec la concentration la plus élevée de CTX, bien que les hémocytes aient démontré une réduction d'adhérence au substrat. Le retrait CTX-dépendantes des bacteries (Bacillus subtilis) injecter dans l' hémocèle de l'insecte était inversement corrélé avec la fréquence des nodules. La sous-unité B de la CTX était responsable des effets obtenus aux concentrations plus élevées, alors que la sous-unité A de la CTX n'a eu aucune effet sur les hémocytes. La formation des micro-agrégats in vitro par la CTX était inh

TGF-β plays a dual role in cancer: In pre-malignant cells TGF-β inhibits tumor growth, but in malignant tumor cells it helps tumor progression. One of the most important effects of TGF-β is the induction of EMT, which allows epithelial cells to acquire mesenchymal traits, allowing tumors of epithelial origin to become malignant. Menin is a ubiquitous tumour suppressor protein that interacts with Smad3 of the TGF-β pathway, suggesting a role in the TGF-β pathway. There is a possibility that Menin may act as a factor for progression of cancer by participating in TGF-β signalling. To assess its effect in the TGF-β pathway, Menin was knocked down using specific siRNA and TGF-β function was tested. Results suggest knocking-down Menin decreases N-cadherin expression and alter its localization. The absence of Menin also affected TGF-β-induced migration, suggesting Menin may play an important role in TGF-β-induced tumour progression. / TGF-ß joue un double role dans la progression du cancer; dans les cellules pré-malignes, TGF-ß inhibe la croissance du cancer, cependant, dans les lignées plus invasives, TGF-ß promouvoit la progression du cancer. Un des effets les plus importants du TGF-ß est l'induction de la transition épithéliale à mésenchymale, permettant aux tumeurs d'origine épithéliale de devenir malignes. Menin est un suppresseur de tumeur omniprésent qui interagit avec Smad3, une protéine nécéssaire à la voix de signalisation du TGF-ß. Il est cependant possible que Menin agisse en tant que promoteur du cancer lorsqu'il s'intègre à la voix de signalisation du TGF-ß. Pour évaluer ses effets, l'expression de Menin a été réduite en utilisant des siRNA. Les résultats suggèrent que l'absence de Menin reduit l'expression de N-cadherine and altère sa localization. L'absence de Menin affecte aussi la migration induite par TGF-ß, suggérent que cette protéine joue un rôle important dans la progression tumorale induite par la cytokine.

The overexpression of several receptors and dysfunction of signal transduction pathways characterize the heterogeneity of many solid tumours. Targeted therapies against epidermal growth factor receptor (EGFR)-overexpressing tumours involve well tolerated EGFR inhibitors. However, the potency of these inhibitors is mitigated by several factors including mutations in signaling pathways and receptor heterogeneity. To circumvent this problem, we recently designed a novel strategy that seeks to synthesize molecules "programmed" to release an EGFR inhibitor and a cytotoxic DNA-damaging agent. This led to mixed EGFR-DNA targeting agents, termed "type I combi-molecules". Previous work demonstrated that these compounds: (1) inhibited EGFR and (2) damaged DNA. However, the correlation of their degradation, localization and distribution in the cell with their mechanism of action remained elusive. In this thesis, we designed a fluorescence-labeled combi-molecule AL237 "programmed" to release a blue fluorescent EGFR inhibitor and a green DNA targeting species. The results showed that AL237 blocked EGFR phosphorylation and downstream MAPK pathway, subsequently leading to downregulation of XRCC1 and ERCC1, two DNA repair enzymes. Following demonstration of the ability of AL237 to fully block the MAPK pathway, we studied its localization in the tumour cells by fluorescence microscopy. The results showed that the released quinazoline colocalized with EGFR in the perinuclear region and the green fluorescence was detected in isolated nuclei. This led to a model whereby combi-molecule entered the cell, bind to the EGFR at the plasma membrane to prevent signal transduction and abundantly localized in the perinuclear region from where the released alkylating species could diffuse to the nucleus. This mechanism explained the significantly high levels of DNA damaging species in the nuclei of cells expressing EGFR. Further studies exploiting AL237 fluorescence properties demonstrated that its potency did not depend on the P-gp status of the cells. The P-gp independence of AL237 effect was explained by its intracellular degradation that prevented the efflux of the intact structure. Further studies on combi-molecules that do not require hydrolysis to generate the two targeting species (type II combi-molecules) showed that they exhibited potency in the submicromolar range. Studies designed to elucidate the mechanism underlying the exquisite potency of ZR2008 showed that it induced significant levels of apoptosis, independently of the AKT status of the cells. A constant in its potency was its ability to block cells in G1/S and to downregulate the antiapoptotic protein survivin. Our findings suggest that pathways leading to the inhibition of survivin could be a major molecular determinant for the cytotoxicity of ZR2008. The results from this work in toto contributed to the elucidation of the mechanism of action of two classes of combi-molecules: type I and type II. / L'hétérogénéité de la plupart des tumeurs solides est caractérisée par la surexpression de plusieurs récepteurs et le disfonctionnement des voies de transduction des signaux. Les thérapies actuelles contre les tumeurs surexprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) utilisent des inhibiteurs de l'EGFR, agents relativement bien tolérés en clinique. Cependant, l'efficacité de ces inhibiteurs est atténuée par plusieurs facteurs tels que les mutations dans les voies de signalisation et par l'hétérogénéité des récepteurs. Pour palier ce problème, nous avons récemment conçu une stratégie basée sur la synthèse des molécules «programmées» pour libérer un inhibiteur de l'EGFR et un agent cytotoxique capable d'endommager l'ADN. Ces molécules, combinant des agents ciblant l'EGFR et l'ADN, sont dénommées «combi-molécules de type I». Les travaux réalisés précédemment au laboratoire ont démontré que ces composés (1) inhibent la phosphorylation de l'EGFR et (2) endommagent l'ADN. Cependant, la corrélation entre leur dégradation, leur localisation et leur distribution au sein de la cellule et leur mécanisme d'action n'a pas encore été élucidée. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons élaboré une combi-molécule, AL237, marquée d'un groupe fluorescent et « programmée» pour libérer un inhibiteur de l'EGFR fluorescant dans le bleu et une entité fluorescant dans le vert ciblant l'ADN. Les résultats ont démontré que AL237 bloque la phosphorylation de l'EGFR et de la voie de signalisation des MAP kinases, accompagnée par la réduction sousjacente de l'expression de XRCC1 et ERCC1: deux enzymes impliquées dans la réparation de l'ADN. Après avoir démontré la capacité de AL237 à bloquer entièrement la voie de signalisation des MAP kinases, nous avons étudié la localisation de cette molécule dans des cellules cancéreuses par microscopie en fluorescence. Les résultats ont montré que la quinazoline libérée est colocalisée avec l'EGFR dans la région périnucléaire et que le signal de fluorescence vert est détecté dans les noyaux isolés. Ces résultats mettent en valeur un modèle ou la combi-molécule entre dans la cellule, s'associe au REGF au niveau de la membrane plasmique, empêchant ainsi la transduction des signaux, puis se localise abondamment dans la région périnucléaire où les espèces alkylantes sont libérées et peuvent ainsi diffuser dans le noyau. Ce mécanisme permet d'expliquer la forte concentration d'espèces ciblant l'ADN observée dans les noyaux des cellules exprimant l'EGFR. D'autre part, des études utilisant les propriétés de fluorescence de AL237 ont démontré que la toxicité de cette molécule n'est pas affectée par la présence de la P-glycoprotéine (P-gp) dans les cellules. Cette observation peut être expliquée par le fait que, AL237 se dégrade intracellulairement en deux petites molécules empêchant ainsi l'efflux de la macrostructure intacte. Au cours de cette thèse, d'autres travaux ont été réalisés sur des combi-molécules, dites de type II, qui ne nécessitent pas d'hydrolyse pour générer les deux espèces actives et montrent une toxicité élevée à des concentrations submicromolaires. Les études élaborées pour élucider le mécanisme de l'exceptionnelle activité de ZR2008, une combi-molécule exemple de type II, ont montré qu'elle induit des niveaux significatifs d'apoptose indépendamment du statut d'AKT dans les cellules. Une constante dans son activité est sa capacité à bloquer les cellules dans les phases G1/S du cycle cellulaire et à inhiber le niveau de la survivine, une protéine antiapoptotique. Nos résultats suggèrent que les voies de signalisation, menant à l'inhibition de la survivine, pourraient jouer un rôle déterminant pour la cytotoxicité de ZR2008. En conclusion, les travaux de cette thèse ont contribué à l'élucidation des mécanismes d'action des deux classes de combi-molécules : type I et type II.