The Chicken anaemia virus protein apoptin is able to induce apoptosis specifically in human transformed cells independently of p53 through a mechanism that remains to be elucidated. Current evidence suggests that apoptin acts through inhibition of the anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), an E3 ubiquitin ligase required for mitosis, by binding to the subunit APC1. In this study, apoptin was found to induce dissociation and degradation of the APC/C by associating with other subunits in addition to APC1 (APC2, APC3/Cdc27 and APC7). The APC1 binding location was localized to the C-terminus, which was found to be implicated in the association with APC3/Cdc27 and APC7. Residues of apoptin forming a possible IR domain were found to be required for APC/C interaction. However, apoptin was not able to bind the TPR motifs 4-9 of APC3/Cdc27, which are known to interact with the IR domain of APC/C co-activator Cdh1. These results contribute to the understanding of apoptin action in transformed cells, which once fully defined could be exploited in the creation of novel chemotherapeutics. / La protéine apoptin issue du virus de l'anémie infectieuse du poulet est capable d'induire l'apoptose de cellules cancéreuses humaines de façon spécifique et indépendamment de p53 par un mécanisme encore inconnu. Il a été suggéré qu'apoptin agit en inhibant le complexe promoteur de l'anaphase (APC/C), une ubiquitine-ligase E3 requise pour la mitose, par sa liaison à la sous-unité APC1. Dans cette étude, apoptin a été trouvé capable d'induire la dissociation et la dégradation de l'APC/C par le biais de son interaction avec d'autres sous-unités en plus d'APC1 (APC2, APC3/Cdc27 et APC7). L'interaction avec APC1 a été localisée à la région C-terminale, et celle-ci a été trouvée impliquée dans l'association d'APC1 avec APC3/Cdc27 et APC7. D'autre part, les amino acides d'apoptin formant un possible domaine IR ont été trouvés essentiels dans son association à l'APC/C. Cependant, les motifs TPR 4-9 d'APC3/Cdc27, qui sont connus pour interagir avec le domaine IR du co-activateur de l'APC/C Cdh1, ne semblent pas être impliqués dans l'interaction avec apoptin. L'ensemble de ces résultats permettent d'éclaircir le mode d'action d'apoptin dans les cellules transformées qui, une fois complètement défini, pourrait être exploité dans la création de nouveaux traitements chimiothérapiques.

Microtubule-actin interactions underlie a diverse number of biological processes including cell motility, neuronal outgrowth, cellular wound healing, cell division and cortical flow. CRMPs (Collapsin Response Mediator Proteins) are a family of cytosolic phosphoproteins that play roles in regulating both actin and microtubule dynamics. The roles of the CRMP family of proteins in regulating these cellular processes have only been partially described. Our lab has been particularly interested in the function of the CRMP4 isoform because of its unique ability to complex with RhoA, a master regulator of the actin cytoskeleton. In this thesis we explore the function of CRMP4 in two biological processes that are dependent on actin and microtubule dynamics: mitosis (Chapter 2) and axon regeneration (Chapter 3 and 4). In Chapter 2, we identify CRMP4 as an important regulator of mitotic chromosomal alignment. We show that CRMP4 localizes to spindle microtubules during mitosis and that loss of CRMP4 disrupts chromosomal alignment, mitotic progression and spindle morphology. Furthermore, we demonstrate that these processes are dependent on CRMP4 phosphorylation, which may be important for recruitment of additional proteins to the mitotic machinery. In Chapter 3, we investigate the ability of an adeno-associated virus (AAV) encoding a CRMP4 antagonist C4RIP (CRMP4-RhoA inhibitory peptide) to enhance adult retinal ganglion cell (RGC) axon regeneration in an in vivo preclinical optic nerve injury model. We describe the inability of AAV-C4RIP to promote RGC regeneration and discuss the likelihood that AAV-mediated expression levels of C4RIP may be insufficient to promote regeneration. In Chapter 4, we describe the development and validation of cell permeable recombinant C4RIP (TAT-C4RIP) and discuss our data testing the effects of TAT-C4RIP on regeneration in vitro and in vivo. Together, these studies identify CRMP4 as an important regulator of mitosis, and describe our ongoing studies testing the effects of a CRMP4 antagonist on nerve regeneration. / Les interactions entre l'actine et les microtubules sont sous-jacentes à divers processus biologiques incluant la motilité cellulaire, le guidage neuronal, la cicatrisation cellulaire, la division cellulaire et la circulation corticale. Les protéines CRMPs (Collapsin Response Mediator Protein) sont une famille de phosphoprotéines cytosoliques jouant un rôle dans la régulation de la dynamique de l'actine et des microtubules. Cependant, cette régulation du cytosquelette par les CRMPs n'a été que partiellement décrite. Notre laboratoire s'intéresse à la fonction de l'isoforme CRMP4 en raison de sa capacité unique d'interagir avec RhoA, un régulateur important du cytosquelette d'actine. Dans cette thèse, nous explorons la fonction de CRMP4 dans deux processus biologiques qui dépendent de la dynamique de l'actine et des microtubules: la mitose (chapitre 2) et la régénération des axones (chapitre 3 et 4). Dans le chapitre 2 sera présentée notre identification de CRMP4 en tant que régulateur important de l'alignement chromosomique durant la mitose. Nous démontrons que, pendant la mitose, CRMP4 se situe sur les fuseaux mitotiques formés de microtubules et que la perte de CRMP4 perturbe l'alignement chromosomique, la progression de la mitose et la morphologie des fuseaux. En outre, nous démontrons que ces processus sont dépendants de la phosphorylation de CRMP4. Ceci pourrait être crucial pour le recrutement de protéines supplémentaires nécessaire pour la mitose. Dans le chapitre 3, nous étudions la capacité d'un virus adéno-associé (AAV) codant pour l'antagoniste de CRMP4, nommé C4RIP (CRMP4-RhoA inhibitory peptide), de favoriser la régénération de l'axone de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) chez l'adulte. Pour cela, nous utilisons un modèle in vivo de traumatismes du nerf optique chez le rat adulte. Nous décrivons l'incapacité des virus AAV-C4RIP de favoriser la régénération des RGCs et discutons de la probabilité que les niveaux de AAV-C4RIP exprimés puissent être insuffisants afin de favoriser la régénération. Le chapitre 4, quant à lui, est consacré à la description du développement et de la validation de la protéine recombinante TAT-C4RIP qui a le potentiel de traverser la membrane cellulaire. Nous y discutons les données concernant les effets de TAT-C4RIP sur la régénération in vitro et in vivo. Dans l'ensemble, ces études caractérisent CRMP4 comme important régulateur de la mitose et décrivent une nouvelle méthode de purification pour des protéines perméables à la membrane cellulaire.

Spermatogonial stem cells (SSCs) are the foundation of spermatogenesis. These cells have the unique ability to self-renew, to maintain a reserve of undifferentiated germ cells, and differentiate to continuously support long-term spermatogenesis. Thus, SSCs are important cells for male fertility restoration technologies. SSCs are maintained in a specialized microenvironment, in contact with testicular somatic cells and other germ cells. Communication amongst this cell society is believed to balance the SSC fate decision to self-renew or differentiate, to avoid over-proliferation or stem cell depletion. However, the secreted factors mediating this communication network are not completely known. Wnt signalling has been shown to direct cell specification during embryogenesis and regulate the fate decision of various stem cell types. Therefore, in this thesis, I characterize a role for Wnt signalling pathways in SSC fate regulation. In order to study SSCs under defined conditions, I relied on a culture system in which SSCs proliferate as distinct germ cell accumulations, which I term "clusters". In Manuscript 1, I examined this culture in depth and characterized cluster-formation as a reliable in vitro assay for SSC activity. I showed that clusters can be clonally-derived attesting to an ability to quantify cluster-forming cells by counting cluster numbers. Furthermore, I determined that cluster numbers correlated with SSC numbers, as determined by spermatogonial transplantation. Thus, cluster-formation appears to be an in vitro attribute of SSC activity. Clusters are composed of both SSCs and differentiated germ cells indicating that self-renewal and differentiation events occur in vitro. Importantly, cluster formation and SSC maintenance in vitro requires the use of embryonic fibroblasts as a feeder cell layer. Therefore, I screened these feeder cells for potential factors that might support SSC self-renewal and I detected the expression of various Wnt molecules. In Manuscript 2, I defined Wnt5a as a paracrine factor that supports SSC self-renewal. I found that Wnt5a activates a non-canonical Wnt/c-jun-N-terminal kinase pathway and blocks cell death in vitro. Additionally, I detected Wnt5a in testicular somatic cells and Wnt5a receptors on clusters and SSCs, indicating that Wnt5a may act directly on SSCs in vivo. Interestingly, using a transgenic reporter mouse line to detect canonical Wnt (β-catenin) signalling, I observed a subset of β-catenin signalling cells in clusters. Transplantation of these β-catenin signalling cells showed they did not have SSC activity but appear to be committed progenitor cells. In Manuscript 3, I found that the addition of Wnt3a to culture specifically activated the β-catenin pathway in a subset of cluster cells, which showed reduced SSC activity indicating they were committed progenitors. Under feeder-free conditions, Wnt3a induced cluster formation, which indirectly led to an increase in SSC maintenance. Thus, these results provide evidence that committed progenitors can contribute to the niche regulation of SSCs. Finally, in a preliminary study I performed gene expression profiling comparing β-catenin signalling to non-signalling cells to identify molecular differences in committed cells. I identified Delta-like homolog 1 as a potential factor that could induce SSC differentiation, indicating that committed cells have the capacity to regulate SSC fate. Therefore, this thesis work characterizes a role for Wnt pathways in the communication between SSCs and the testicular niche microenvironment, which properly regulates the SSC fate decision. / L'intégrité de la spermatogenèse repose sur l'autorenouvellement et la différenciation des cellules souches germinales (CSGs). Dans le testicule, les CSGs coexistent avec d'autres cellules, germinales et somatiques, et les interactions entre ces différents types cellulaires sont essentielles au développement d'un microenvironnement propice à la maintenance des CSGs et à l'induction de la spermatogenèse. La coordination des communications intercellulaires survenant au sein de ce microenvironnement (niche) est cruciale. Les signaux cellulaires spécifiques impliqués dans ce réseau de communication intercellulaire régulant la destinée cellulaire des CSGs demeurent par contre méconnus. La signalisation Wnt est également impliquée dans la régulation de la destinée cellulaire de plusieurs types de cellules souches. Afin de déterminer le rôle de la voie de signalisation Wnt dans la régulation de la destinée cellulaire des CSGs, j'ai utilisé un système de culture défini dans lequel les CSGs prolifèrent et forment des agrégats de cellules germinales isolés et distincts. J'ai tout d'abord établi la validité de ce système de culture pour l'évaluation de l'activité biologique des CSGs en démontrant que les agrégats forment par dérivation clonale, attestant ainsi que le nombre d'agrégats reflète le nombre initial de cellules ayant le potentiel de former des agrégats. J'ai également démontré une corrélation entre le nombre d'agrégats et le nombre de CSGs en utilisant une méthode de transplantation testiculaire de cellules spermatogoniales. Le potentiel de formation d'agrégats in vitro apparaît donc comme une fonction intrinsèque des CSGs. Les agrégats sont constitués non seulement de CSGs mais aussi de cellules germinales différenciées, démontrant la capacité d'autorenouvellement et de différenciation des CSGs in vitro. Puisque la maintenance des CSGs et la formation d'agrégats in vitro requièrent la présence d'une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires, j'ai analysé les facteurs produits par ces fibroblastes et identifié plusieurs molécules de la famille Wnt susceptibles de jouer un rôle dans la régulation de l'autorenouvellement des CSGs. Mes résultats démontrent que Wnt5a agit comme facteur de signalisation intercellulaire de type paracrine stimulant l'autorenouvellement des CSGs. Wnt5a active la voie de signalisation non canonique Wnt/JNK et inhibe l'apoptose in vitro. De plus, j'ai trouvé que Wnt5a est présent dans les cellules somatiques testiculaires alors que les récepteurs pour Wnt5a sont exprimés par les agrégats et les CSGs, suggérant un rôle pour Wnt5a dans la régulation des CSGs in vivo. Par le biais de l'utilisation d'une lignée transgénique rapportant l'activité de la voie de signalisation canonique Wnt (β-caténine), j'ai détecté l'activation de la voie β-caténine dans un sous-ensemble de cellules présentes dans les agrégats. La transplantation testiculaire de ces cellules a révélé que ces cellules ne sont pas des CSGs mais plutôt des progéniteurs spermatogoniaux. J'ai également démontré que l'addition de Wnt3a en culture active la voie de signalisation β-caténine spécifiquement dans les progéniteurs spermatogoniaux. En l'absence de couche nourricière de fibroblastes, Wnt3a induit la formation d'agrégats et promeut la maintenance des CSGs. Ces résultats suggèrent donc que les progéniteurs spermatogoniaux contribuent à la régulation de la niche nécessaire à la maintenance des CSGs. Finalement, j'ai effectué une analyse par micropuce ADN afin de comparer l'expression génique entre les cellules positives et négatives pour l'activation de signalisation β-caténine afin d'identifié des gènes spécifiques pour les progéniteurs spermatogoniaux. Collectivement, mes résultats caractérisent le rôle des molécules de la famille Wnt dans la communication intercellulaire qui survient entre les CSGs et autres cellules avoisinantes présentes dans la niche testiculaire impliqué dans la régulation de la destinée cellulaire des CSGs.

Using proteomics and immunofluorescence we demonstrated epidermal growth factor (EGF) induced recruitment of extrinsic V1 subunits of the vacuolar (H+)-ATPase (vATPase) to rat liver endosomes (ENs). This was accompanied by reduced vacuolar pH. Bafilomycin, an inhibitor of vATPase, inhibited EGF-stimulated DNA-synthesis and mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) activation as indicated by a decrease in 4E-BP1 phosphorylation, and p70S6K phosphorylation and kinase activity. There was no corresponding inhibition of EGF-induced Akt and Erk activation. Chloroquine, a neutralizer of vacuolar pH, mimicked bafilomycin's effects. Bafilomycin did not inhibit the association of mTORC1 with Raptor nor did it affect AMPK activity. Rather, the intracellular concentrations of essential but not non-essential amino acids, were decreased by bafilomycin in EGF-treated primary rat hepatocytes. Cycloheximide, a translation elongation inhibitor, prevented the effect of bafilomycin on amino acids levels and completely reversed its inhibition of EGF induced mTORC1 activation. In vivo administration of EGF stimulated the recruitment of Rheb but not mTOR to endosomes and lysosomes. This was inhibited by chloroquine treatment. Our results suggest a role for vacuolar acidification in EGF signaling to mTORC1. / A l'aide des techniques de Protéomique et d'immunofluorescence, nous avons démontré le recrutement des sous-unités extrinsèques V1 de l'(H+)-ATPase (vATPase) par les endosomes du foie de rat suite à une stimulation à l'EGF (Epidermal Growth Factor). Ce recrutement s'accompagne d'une réduction du pH vacuolaire. L'utilisation de la Bafilomycine, un inhibiteur de la vATPase, inhibe la synthèse d'ADN et de l'activation de mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1), indiqués par la diminution de la phosphorylation de 4E-BP1, et de la phosphorylation et de l'activité enzymatique de p70S6k. Toutefois, nous n'avons pas observé d'inhibition de l'activation de Akt et de Erk également induites par l'EGF. La Chloroquine, un neutralisateur du pH vacuolaire, imite les effets vus avec la Bafilomycine. Dans des hepatocytes primaires de rat traités avec l'EGF, la Bafilomycine n'inhibe pas l'association de mTORC1 avec Raptor, pas plus qu'elle n'affecte l'activité de AMPK, par contre elle diminue les concentrations intracellulaires des acides aminés essentiels, mais pas des acides aminés non-essentiels. La Cycloheximide, un inhibiteur de l'élongation de la traduction, prévient les effets de la Bafilomycine sur les niveaux d'acides aminés, et renverse complètement son effet inhibiteur sur l'activation de mTOR induite par l'EGF. De plus, l'administration d'EGF in vivo induit le recrutement de Rheb dans les endosomes et les lysosomes, mais pas celui de mTOR, et cette induction est inhibée par l'administration de Chloroquine. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent donc un rôle pour l'acidification vacuolaire dans la signalisation de l'EGF.

PGC-1alpha is a key factor controlling mitochondrial biogenesis. In this thesis, we demonstrate that PGC-1alpha is also a central regulator of the intrinsic properties of mitochondria. Using mitochondria isolated from muscle tissues of MCK- PGC-1alpha Tg mice that ectopically express PGC-1alpha under the control of the muscle creatine kinase promoter, we observed significant changes in their intrinsic properties compared with wild-type controls. The results illustrate that PGC-1alpha changes the respiratory and ROS generation capacities of mitochondria, while maintaining their topology/sidedness of ROS production. Additionally, PGC-1alpha did not alter the fraction of electrons escaping the respiratory chain to react with oxygen during oxygen consumption, ensuring a tight coupling between the respiratory and ROS generation capacities of mitochondria. These changes in the intrinsic properties of mitochondria upon ectopic expression of PGC-1alpha were accompanied by modifications in the expression of several components of the respiratory chain. Together, these data reveal that PGC-1alpha does not only change the number of mitochondria in cells but also the intrinsic properties of individual mitochondria within the cell. / PGC-1alpha est un facteur clé contrôlant la biogénèse mitochondriale. Dans cette thèse, nous démontrons que PGC-1alpha est aussi un régulateur important des propriétés intrinsèques des mitochondries. Utilisant des mitochondries isolées de tissus musculaires de souris transgéniques MCK-PGC-1alpha qui expriment ectopiquement PGC-1alpha sous le contrôle du promoteur de la créatine kinase musculaire, nous avons observé des changements significatifs à leurs propriétés intrinsèques comparativement à des mitochondries de souris sauvages. Spécifiquement, nous démontrons que PGC-1alpha change les capacités respiratoires et génératrices d'espèces réactives oxygénées (ROS) des mitochondries, bien qu'il maintienne leur topologie de production de ROS. De plus, PGC-1alpha n'altère pas la fraction d'électrons qui s'échappent de la chaine respiratoire pour ensuite réagir avec l'oxygène durant le processus de consommation d'oxygène, assurant un couplage étroit entre les capacités respiratoires et génératrices de ROS des mitochondries. Ces changements des propriétés intrinsèques des mitochondries suivant l'expression ectopique de PGC-1alpha ont été accompagnés de modification de l'expression de plusieurs composantes de la chaine respiratoire. Ensemble, ces données révèlent que PGC-1alpha change non seulement le nombre de mitochondries dans les cellules, mais aussi les propriétés intrinsèques des mitochondries individuelles.

Carcinoembryonic antigen (CEA) is a cell surface protein attached to the membrane by a glycophosphatidylinositol (GPI) anchor, a common modification of cell surface proteins. CEA is overexpressed in many human cancers, and plays a role in tumor progression through its ability to activate certain integrins, thereby blocking cellular differentiation, inhibiting anoikis, and disrupting normal tissue architecture. Previous work established that the CEA GPI anchor contains important and specific information directing these functions, which served as the basis for an investigation of the underlying mechanisms involved. The ability of the GPI anchor to determine protein function was examined using a chimera that consisted of the CEA GPI anchor attached to neural cell adhesion molecule (NCAM) self-adhesive external domains; this chimera, NCB, possessed CEA-like, rather than NCAM-like, functions. The CEA anchor targets the protein to specific domains on the cell surface, resulting in an association with specific signaling molecules. This targeting was employed to modify CEA function, as the presence of a protein with non-functional external domains but the same anchor led to a complete and specific loss of biological function of the CEA-like protein. GPI anchor addition is determined by a specific carboxy-terminal signal sequence, which we hypothesized contained information directing the addition of a particular GPI anchor with functional specificity. To identify this signal, chimeras were generated exchanging amino acids in this signal sequence between CEA and NCAM, a protein with different functional properties. A stretch of 6 amino acids within the signal sequence was found to be necessary and sufficient for the addition of the CEA-specific anchor. Since this region is well conserved, but not identical, in the CEA family members CC6 and CC7, we examined whether these proteins were also attached to the same GPI anchors. Surprisingly, while the anchors of these protein / L'antigène carcinoembryonnaire humain (CEA) est un membre d'une famille de protéines de surface cellulaire fixées à la membrane par un ancrage glycophosphatidylinositol (GPI), une modification commune des protéines de la membrane plasmique. CEA est surexprimé dans plusieurs cancers humains et joue un rôle dans la progression tumorale par sa capacité à activer certaines intégrines, bloquant de ce fait la différentiation cellulaire et l'anoikis, et perturbant l'architecture tissulaire normale. Plusieurs recherches antérieures ont établi que l'ancre GPI de CEA contient de l'information importante et spécifique dirigeant ces fonctions. Ces travaux ont servi de base pour l'étude biologique et moléculaire des mécanismes impliqués. Afin de démontrer les fonctions biologiques de CEA, nous avons étudié les capacités de l'ancre GPI à modifier la fonction des protéines en utilisant une protéine hybride (NCB) composée de l'ancre GPI de CEA attachée aux domaines externes auto-adhésifs de la molécule d'adhésion cellulaire neuronale (NCAM). La protéine chimérique NCB possède des fonctions similaires à CEA. L'ancre de CEA cible la protéine à des domaines spécifiques de la surface cellulaire, ce qui mène à l'association de la protéine avec des éléments de signalisation spécifiques. Ce ciblage a été utilisé pour modifier la fonction de CEA, car la présence d'une protéine dont les domaines extracellulaires sont non fonctionnels, mais dont l'ancre est la même, a causé la perte complète et spécifique des fonctions biologiques de NCB. L'ajout d'ancres GPI est déterminé par une séquence spécifique située à l'extrémité carboxyle-terminale. Nous avons présumé que cette séquence contiendrait l'information nécessaire à l'addition sélective d'une ancre GPI de fonction spécifique. Afin d'identifier ce signal, des protéines hybrides ont été produites en échangeant des acides aminés entre CEA et NCAM, deux protéines de fo

Netrin-1 is a bifunctional chemotropic cue that attracts or repels different classes of axons through the Deleted in Colorectal Cancer (DCC) and the UNC5 receptors (UNC5a, b, c and d). DCC is implicated in mediating both responses whereas UNC5 receptors are strictly involved in the repulsive events. The intracellular molecular mechanisms underlying axon growth and guidance are still unclear but it is known that this process requires remodeling of the actin cytoskeleton. There is now compelling evidence that Rho GTPases, in particular RhoA, Rac1 and Cdc42, are important signaling elements within the neuronal growth cone and we hypothesize that they link netrin-1-mediated UNC5a signaling to cytoskeletal remodeling and repulsion. In the first part of this thesis, we have demonstrated that overexpression of UNC5a or a mutant lacking the cytoplasmic tail of the receptor in N1E-115 neuroblastoma cells expressing netrin-1, stimulated the formation of neurites in a netrin-1-dependent manner. Rho GTPase activation assays in COS-7 cells expressing UNC5a also showed a transient 1.5-, 2- and 9-fold increase in the levels of activated Rac1, Cdc42 and RhoA, respectively, after two minutes of netrin-1 stimulation. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) in N1E-115 cells revealed that UNC5a strongly activated RhoA at neurite tips and activated Rac1 in the absence of its cytoplasmic domain, suggesting the presence of a signaling partner. These results demonstrate that Rho GTPases are important signaling components of the netrin-1 receptor UNC5a. In the second part, we have investigated the implication of Rac1, Cdc42 and RhoA in the netrin-1-mediated inhibitory effect of embryonic mouse dorsal root ganglia (DRG) axons. We found that netrin / Les nétrines sont des facteurs chémotropiques qui attirent ou repoussent différentes classes d'axones en agissant via les récepteurs DCC et UNC5 (UNC5a, b, c et d). DCC est impliqué dans l'attraction et dans la répulsion du cône de croissance tandis que les récepteurs UNC5 sont impliqués seulement dans la répulsion. Les mécanismes intracellulaires régissant le guidage axonal sont encore très peu connus. Cependant, il est clair que le mouvement dynamique du cône de croissance via le remodelage de son cytoskelette d'actine est requis durant les événements de guidage. Les activités des GTPases Rho, en particulier RhoA, Rac1 et Cdc42, font parties des mécanismes moléculaires qui régissent la migration axonale et nous croyons que ces protéines jouent un rôle primordial durant les événements de répulsion induits par le récepteur UNC5a. Dans la première partie de ce mémoire, nous avons démontré que UNC5a ainsi qu'un mutant tronqué de son domaine cytoplasmique induisent la formation de neurites dans les cellules murines de neuroblastomes, suivant la liaison de la nétrine-1. De plus, UNC5a augmente de 1.5, 2 et 9 fois le niveau d'activation de Rac1, Cdc42 et RhoA, respectivement, après deux minutes de stimulation avec la nétrine-1 dans les fibroblastes. Nous démontrons également par « Fluorescence Resonance Energy Transfer » (FRET) que UNC5a active fortement RhoA à l'extrémité de la neurite et active également Rac1, lorsque tronqué de son domaine cytoplasmique, suggérant la possibilité que le récepteur agisse via un partenaire. Ces résultats indiquent que les GTPases Rho sont des éléments majeurs de la signalisation de la nétrine-1 et de son récepteur UNC5a. Dans la seconde partie, nous

The lifelong process of spermatogenesis is supported by spermatogonial stem cells (SSCs). Because of their ability to self-renew and produce differentiated cells that transmit genetic information to the next generation, SSCs are an important target cell population to restore male fertility. Pup (6-8 days old) and adult mouse SSCs are believed to possess different characteristics. In order to determine if there is a difference in biological activity of SSCs, in Aim 1, I evaluated the self-renewal and differentiation pattern of pup SSCs and compared it to adult SSCs. Using serial transplantation, I showed that pup SSCs preferentially commit to differentiation during the first month after transplantation compared to adult SSCs. This difference in biological activity of pup and adult SSCs may be due to age-dependent and age-independent effects. To investigate the age-dependent effect, in Aim 2, I used immunomagnetic cell sorting to evaluate the expression pattern of cell-surface molecules on pup and adult SSCs. Transplantation of selected cells showed that pup SSCs preferentially express glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family receptor alpha 1, a GDNF receptor, compared to adult SSCs, indicating an age-dependent difference in cell-surface molecule phenotype. In Aim 3, I investigated the age-independent effect of cell cycle activity on SSC commitment to self-renewal and differentiation, based on the fact that pup SSCs are known to cycle more actively than adult SSCs. To investigate the fate decision of cycling SSCs, I used an SSC culture system, which allows for expansion of SSCs in the presence of GDNF and fibroblast growth factor 2 (FGF2). Transplantation of SSC cultures temporally exposed to a retroviral vector carrying the LacZ gene showed a ~100-fold increase in the number of SSCs that divided in the presence of GDNF and FGF2. However, this increase in cell cycle activity stimulated SSCs to produce differentiating cells at the expense of their o / Les cellules souches germinales (CSGs) sont responsables de la production à vie de spermatozoïdes et constituent le seul type cellulaire pouvant s'autorenouveler et contribuer au patrimoine génétique de notre progéniture et représentent donc une cible idéale pour restaurer la fertilité masculine. Il est généralement accepté que les CSGs pré-pubères (6 à 8 jours) et adultes possèdent des caractéristiques distinctes. Pour déterminer si leur activité biologique est différente, j'ai évalué leur potentiel d'autorenouvellement et de différenciation par transplantation séquentielle. Contrairement aux CSGs adultes, les CSGs pré-pubères empruntent préférentiellement la voie de différenciation le premier mois post-transplantation. Cette différence entre les CSGs adultes et pré-pubères pourrait découler de facteurs reliés à l'âge. Afin d'éxaminer l'influence de l'âge sur leur activité biologique, j'ai utilisé une approche d'immunosélection cellulaire par tri magnétique pour évaluer l'expression de protéines membranaires des CSGs adultes et pré-pubères. La transplantation des cellules sélectionnées a montré que GFR alpha 1, un récepteur pour GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor), est préférentiellement exprimé sur les CSGs pré-pubères, démontrant un effet de l'âge sur le phénotype membranaire des CSGs. Puisque les CSGs pré-pubères se divisent plus activement que les CSGs adultes, j'ai avons ensuite déterminé l'effet de l'activité du cycle cellulaire sur le potentiel d'autorenouvellement et de différenciation des CSGs. Pour évaluer le rôle du cycle cellulaire sur la détermination de la destinée des CSGs, j'ai utilisé un système de culture qui permet l'expansion infinie des CSGs en présence des facteurs de croissance GDNF et FGF2 (fibroblast growth factor 2). Les CSGs ainsi cultivées ont été transduites par un vecteur rétroviral contenant le gène rapporteur LacZ et soumises à une transplant

Sulfated Glycoprotein-1 (SGP-1) secreted by Sertoli cells is a homologue of human prosaposin known to be processed into four 15 kDa saposins (A,B,C and D). Saposins activate lysosomal enzymes which break down membrane glycolipids. The objectives of the present investigation were to examine the developmental expression of SGP-1 and its targeting to lysosomes of Sertoli cells, to characterize the lysosomal form(s) of SGP-1, to examine SGP-1's delivery to Sertoli cells phagosomes and finally to assess the effects of androgens on SGP-1 expression. / SGP-1 exists in two forms, a 65 kDa and a 70 kDa form. Labeling experiments demonstrated that the 65 kDa form of SGP-1 is synthesized first then post-translationally modified to the 70 kDa form. Western blot analysis of purified Sertoli cell lysosomes revealed a 65 kDa protein and 15 kDa proteins. The latter were isolated and shown to be saposins which were possibly derived from the 65 kDa precursor. Immunocytochemical studies using anti SGP-1 antibodies demonstrated that lysosomes deliver SGP-1 or/and saposins to phagosomes containing residual bodies. Thus, besides a secretory route of SGP-1 there appears to be a lysosomal pathway that may play a significant role in the hydrolysis of glycolipids of spermatid membranes present in phagocytosed residual bodies. Permeabilization of purified Sertoli Golgi fractions revealed that the 65 kDa protein is strongly associated with Golgi membrane. This association was resistant to low pH, resistant to excess free mannose 6-phosphate and independent of N-linked glycosylation, but sensitive to EDTA treatment. In contrast, the 70 kDa form of SGP-1 was released from permeabilized Golgi Fractions at pH 7.4 and 5.4 but retained at pH 6.4 indicating that it is a soluble protein with biochemical characteristics of a regulated secretory protein. In vivo treatment with tunicamycin resulted in an increase in the density of lysosomal SGP-1 suggesting that N-linked carbohydrate residues are not essential for the targeting of this protein to the lysosomes of Sertoli cells. In contrast, in the nonciliated cells of the efferent duct, tunicamycin treatment resulted in a significant reduction in the labeling density of lysosomal SGP-1 suggesting a sugar dependent lysosomal transport mechanism. / Thus, this study demonstrates a unique lysosomal form of SGP-1 (65 kDa). The targeting of the 65 kDa form to the lysosomes and eventually to the phagosomes involves an early association with Golgi membranes independent of mannose 6-phosphate receptors. The trafficking of the 70 kDa form of SGP-1 to the tubular lumen may depend on its selective segregation into secretion granules within the Golgi apparatus of Sertoli cells. Finally, the expression of SGP-1 by Sertoli cells is modulated by androgens.

The production of fully functional spermatozoa requires, upon the successful completion of spermatogenesis, a minimal migration through the highly regulated and specialized lumenal microenvironment created by the epithelial cells lining the efferent ducts and epididymis. The cells of each region contain the subcellular machinery necessary for protein synthesis and secretion, as well as that necessary for reciprocating the latter by way of endocytosis. The present study details the expression of two proteins, osteopontin and cathepsin A, in the testis, efferent ducts and epididymis of the rat. In accordance with known epididymal and testicular dependence on androgens, the effects of testicular factors on each protein's expression were observed. Osteopontin and cathepsin A each exhibited cell- and region-specific distribution in all the tissues but only osteopontin expression was dependent on testicular factors. The results suggest osteopontin and cathepsin A are used by the epithelial cells of the testis, efferent ducts and epididymis to assist in the production of an environment suitable for sperm maturation.