El present treball estudia el desenvolupament d'un procés per a l'obtenció d'una vacuna recombinant per a la protecció de les aus de les explotacions agropecuàries de la malaltia de Gumboro o IBD (Infectal Bursal Disease). El treball planteja estudiar diferents sistemes alternatius, fonamentalment dissenyats al voltant de diferents sistemes biològics, per tal de poder-ne fer, al final del mateix, una comparació en termes de valoració econòmica i en termes de viabilitat tecnològica, donat que aquests dos tipus d'estudis són els elements essencials a l'hora d'establir un bioprocés.El primer sistema analitzat consisteix en l'obtenció del virus IBD a partir de la infecció de cèl·lules Vero. Es tracta d'un sistema de producció d'una vacuna convencional, i que normalment requereix d'una posterior atenuació dels virus obtinguts per a la seva preparació. Aquesta aproximació està relativament estandarditzada, ja que s'aplica per a la producció de diferents tipus de vacunes, i de cara a aquest treball esdevé el sistema de referència. En els capítols següents, s'analitzen tres alternatives al procés anterior per a la producció de vacunes recombinants,en que l'agent vacunal ja no consisteix en el propi virus, sinó en una proteïna de l'embolcall del mateix virus, VP2, que ha estat identificada com a responsable de provocar una resposta immunològica adequada en els animals. S'analitza doncs, la possibilitat d'obtenir VP2 recombinant, fet que permetria desenvolupar vacunes més segures tant en la manipulació del procés com del producte en sí, i en la seva aplicació. El Capítol 5 es dedica a l'expressió de VP2 mitjançant un baculovirus recombinant mitjançant la infecció de cultius de cèl·lules d'insecte (Sf9).En el Capítol 6, s'estudia l'expressió de VP2 en cèl·lules bacterianes (Escherichia coli) i en llevats (Pichia pastoris). Tot i els esforços que s'han dut a terme en aquests sistemes només han permès expressar VP2 en E.coli mitjançant una proteïna de fusió, però sense aconseguir obtenir clons estables. Així doncs, per tal de poder valorar el potencial que podria oferir aquestes opcions, i fins i tot ajudar a valorar la necessitat de treballar-hi en més profunditat, el treball analitza i desenvolupa el sistema d'expressió basat en E.coli i P.pastoris emprant una altra proteïna recombinant com a model, ?-galactosidasa. Els sistemes de cultiu per a l'obtenció de ?-galactosidasa s'analitzen en els Capítol 7 (P.pastoris) i el Capítol 8 (E.coli). Encara que no s'hagi pogut expressar la proteïna inicialment desitjada, les dades obtingudes en aquests capítols permeten obtenir informació rellevant sobre aquests tipus de cultius, permetent realitzar l'estudi d'alternatives de bioprocés plantejat com a objectiu principal del treball.Finalment, el Capítol 9 planteja una síntesi de tot el treball, comparant les quatre alternatives de producció. La comparació és duu a terme mitjançant el plantejament d'un bioprocés a escala industrial per cada cas, dimensionant-lo en funció d'un escenari de producció comú i emprant les dades experimentals obtingudes en els respectius capítols pels diferents sistemes, i per acabar, la seva conseqüent valoració en termes econòmics. La vàlua d'aquesta anàlisi és permetre identificar la potencialitat de cadascun dels quatre bioprocessos, aportant elements molt interessants de cara a possibles preses de decisió sobre la seva possibilitat d'implementació. / In the present work, the development of a production process for a recombinant vaccine against IBD (Infectal Bursal Disease), a disease that affects industrial hens and chickens, has been studied. Based on different biological systems we investigated alternative systems in order to compare them in terms of economical valuation and technical viability, two important criteria that have to be considered when establishing a bioprocess in industrial scale. The first approach undertaken was the propagation of the IBD virus by infection of Vero cells, a conventional method for vaccine production that usually requires a subsequent attenuation of the virus obtained. Since this kind of system is a relatively standardised one and already applied to the production of many different types of viruses in industrial scale, it was chosen as a reference system. The following chapters deal with the analysis of three alternative processes of recombinant vaccine production compared to the reference system. In these alternative systems the viral agent is not the virus itself, but one of its capsid proteins, VP2, that has been identified to evoke an adequate immunological response in animals. For this reason obtaining a recombinant VP2 protein would permit the development of vaccines with enhanced safety regarding process manipulation, the protein itself and its application. Chapter 5 describes the production of VP2 in the baculovirus and insect cell (Sf9) expression system.In Chapter 6, the expression of VP2 in both bacteria (E. coli) and yeast (P. pastoris) was studied. In spite of efforts to produce VP2 in both systems, it was only shown to be produced in E.coli with the help of a fusion protein. However, this was without obtaining stable clones. In order to analyse the production potential of using these expression systems, a new strategy was developed utilising ?-galactosidase as a model protein instead. The cultivation systems for the expression of ?-galactosidase are described in Chapter 7 (P. pastoris) and Chapter 8 (E.coli). Although expression of the primary desired protein was not possible, , the data obtained gave relevant information regarding this kind of production bioprocesses and may facilitate in establishing a comparative analysis of these alternative expression systems.Finally, Chapter 9 gives an overview of the study by comparing the four production strategies previously described. The comparative study was based on a large scale industrial bioprocess design. To define the industrial facility dimension, 10% of the annual demand of this vaccine in Europe was assumed in the implemention of our experimental data. The economical analysis of the feasibility ought to permit to describe the hotspots and the advantages of each alternative production system, and to overcome bottlenecks in further studies.

El desenvolupament de bioprocessos productius reproduïbles i escalables s'ha convertit en un dels colls d'ampolla a mesura que es consolida l'obtenció de proteïnes recombinants. Per poder superar-ho, la FDA i la EMEA han posat en marxa la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que cerca el desenvolupament de processos productius eficients i controlats i que serveix de marc pel desenvolupament del present treball.El treball desenvolupat te com a objectiu el desenvolupament i implementació d'eines que permetin monitoritzar i controlar els processos de producció amb el llevat metilotròfic P. pastoris. Aquest objectiu es materialitza en forma de un desenvolupament d'eines per la correcta monitorització de paràmetres i variables associats al procés productiu, com són el desenvolupament d'un sistema automàtic de presa de mostra, el desenvolupament d'eines per a l'eliminació d'interferències per un sensor en línea de metanol, el desenvolupament d'un sistema en línea de compostos amínics i el desenvolupar un software sensor que permeti determinar en línea la velocitat específica de creixement de P. pastoris en base a un algoritme d'identificació RLS. A més a més, s'ha implementat un sistema de control per a poder analitzar l'efecte de la concentració de metanol en una soca de fenotip Mut+ de P. pastoris sobre la productivitat del procés productiu i posteriorment s'ha avaluat l'efecte de la utilització de substrats mixtes per a la producció de proteïnes recombinants pels fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris.Paraules clauDiscontinu alimentat, Pichia pastoris, substrats mixtes, bioprocés, control, optimització, RLS / El desarrollo de bioprocesos productivos reproducibles y escalables se ha convertido en uno de los cuellos de botella a medida que se consolida la obtención de proteínas recombinantes. Para poder superarlo, la FDA y la EMEA han puesto en marcha la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que busca el desarrollo de procesos productivos eficientes y controlados y que sirve de marco para el desarrollo del presente trabajo.El trabajo desarrollado tiene como objetivo el desarrollo e implementación de herramientas que permitan monitorizar y controlar los procesos de producción de la levadura metilotrófica P. pastoris. Este objetivo se materializa en forma de un desarrollo de herramientas para la correcta monitorización de parámetros y variables asociadas al proceso productivo, como son el desarrollo de un sistema automático de toma de muestra, el desarrollo de herramientas para la eliminación de interferencias para un sensor en línea de metanol, el desarrollo de un sistema en línea de medida de la concentración de compuestos amínicos y el desarrollo de un software sensor que permita determinar en línea la velocidad específica de crecimiento de P. pastoris en base a un algoritmo de identificación RLS. Además, se ha implementado un sistema de control para poder analizar el efecto de la concentración de metanol en una cepa de fenotipo Mut+ de P. pastoris sobre la productividad del proceso productivo y posteriormente se ha evaluado el efecto de la utilización de sustratos mixtos en la producción de proteínas recombinantes para los fenotipos Muts y Mut+ de P. pastoris.Palabras ClaveDiscontinuo alimentado, Pichia pastoris, substratos mixtos, bioproceso, control, optimización, RLS / The development of reproducible and scalable productive bioprocesses has become one of the bottlenecks for the production of recombinants proteins. In order to overcome it, the FDA and the EMEA have started off the Process Analytical Technologies (PAT). That initiative looks for the development of efficient and controlled productive processes and is in this concept where the present work is framed.The goal of this experimental work is the development and implementation of tools that allow monitorization and control of P. pastoris production processes.This goal is materialized with the creation and implementation of tools for the correct monitorization of parameters and state variables of the productive process, such as the development of an automatic sampling system, the development of tools for the elimination of interferences of an on-line methanol sensor, the development of an amine compounds analyzer and the development of a sensor software that allows to gauge the specific growth rate of P. pastoris using a RLS identification algorithm. Moreover, a methanol control system has been implemented for analyzing the effect of the substrate concentration in the productivity on a P. pastoris (phenotype Mut+) culture. And finally it has been analyzed the effect of mixed substrate strategy in Muts and Mut+ phenotypes of P. pastoris for the production of recombinant proteins. Key wordsFed-batch, Pichia pastoris, mixed substrates, bioprocess, control, optimization, RLS.

En les últimes dues dècades, la teràpia gènica ha permès plantejar noves aproximacions en l'àmbit de la medicina personalitzada. Es troba orientada a guarir malalties actualment incurables i/o a millorar ostensiblement la qualitat de vida dels pacients, gràcies a la introducció de material genètic al nucli de la cèl·lula diana per permetre, augmentar o suprimir l'expressió d'un gen específic amb finalitat terapèutica. El vector és l'agent que juga el paper cabdal en aquest mecanisme. D'entre els possibles tipus (virals i no virals), destaca el vector adenoviral per la seva preeminència en els actuals assajos preclínics amb humans i per la necessitat de proveir demandes de mercat importants. El present treball aborda el desenvolupament complet d'un bioprocés per a l'obtenció de vectors adenovirals per a teràpia gènica: estudia els diferents aspectes que conformen el bioprocés, i analitza la implementació a escala industrial de la millor alternativa possible. Com a punt de partida, es realitzen estudis previs per conèixer la interacció dels vectors adenovirals amb les línies cel·lulars productores existents. S'aprofundeix en les tècniques de cultiu de dos candidats cel·lulars concrets: HEK293 (adherent) i HEK293S (no adherent). A partir de la infecció d'ambdós amb el vector adenoviral, es caracteritzen els principals paràmetres del cicle infectiu, els quals permeten concloure que la línia cel·lular HEK293S resulta més apropiada en base a una major productivitat. Aquestes dades proporcionen la base per desenvolupar l'etapa de producció del bioprocés. Aquesta s'estructura entorn als tres factors fonamentals que descriuen la bioreacció (el monitoratge, l'estratègia i el sistema de producció), els quals s'analitzen en profunditat. Es demostra la validesa del mètode de la velocitat de consum d'oxigen (OUR) per realitzar el monitoratge en línia de l'activitat cel·lular durant les fases de creixement i d'infecció. Posteriorment, es decideix avaluar dues estratègies de producció: l'estratègia en discontinu (estratègia de referència) i l'estratègia en continu amb perfusió (estratègia que proporciona les condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo). Finalment, s'apliquen els anteriors factors en l'anàlisi del sistema de producció, en concret, amb la utilització de dues alternatives: l'anomenat sistema convencional (bioreactor de tanc agitat Biostat Bplus) i el sistema no convencional (bioreactor basat en tecnologia d'un sol ús Wave Bioreactor). A partir dels resultats obtinguts, es pot constatar que l'estratègia de producció en continu amb perfusió proporciona elevades concentracions cel·lulars, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració vírica final. D'altra banda, també es posen de manifest els avantatges operacionals del sistema de cultiu no convencional, encara que sacrificant la possibilitat d'utilitzar la mesura de la velocitat de consum d'oxigen (OUR). Per tal de completar el treball, es desenvolupa l'etapa de purificació del bioprocés. En aquesta s'analitzen les propietats del producte i del brou de cultiu, i s'avaluen dues estratègies de purificació. Aquestes es diferencien fonamentalment per la seva possibilitat de facilitar el canvi d'escala, de manera que es designen com a estratègia de purificació no escalable (basada en la ultracentrifugació) i escalable (basada en la cromatografia). La primera és comunament emprada a escala de laboratori; donat que es recull específicament la banda de densitat que conté el vector adenoviral, s'implementa per obtenir material amb una elevada puresa que serveixi com a referència a l'hora de comparar els resultats obtinguts amb l'estratègia escalable. Per portar a terme aquesta última, es dissenyen les operacions que la integren, i es determinen els paràmetres de purificació, entre ells el rendiment global de recuperació del producte final. Posteriorment, es realitza la caracterització del producte per determinar el seu grau de puresa. Els resultats obtinguts deixen palès que l'estratègia escalable presenta un rendiment global superior al de la no escalable, tot i que el grau de puresa aconseguit és inferior. Les dades experimentals, tant de la producció com de la purificació, permeten disposar de quatre alternatives amb l'objectiu d'analitzar la potencial implantació del bioprocés a escala industrial. El disseny i la comparació de les mateixes es realitza d'acord amb el seu dimensionament seguint unes bases de disseny comunes, i la seva valoració final es projecta en termes econòmics. A partir dels resultats obtinguts, l'alternativa més aconsellable d'ésser portada a la pràctica és la basada en el bioprocés integrat pel sistema de producció no convencional operant en continu amb perfusió. Aquesta memòria s'estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 2), on es revisen les característiques de la teràpia gènica, dels vectors adenovirals i de les línies cel·lulars productores, així com del bioprocés i de l'estricta normativa de producció GMP que el regeix. Seguidament (capítol 3), es plantegen els principals objectius del treball. A continuació (capítol 4), es concentren els estudis previs que caracteritzen tant la línia cel·lular productora com la infecció amb el vector adenoviral. Al capítol 5, es presenta el desenvolupament de l'etapa de producció del bioprocés. Anàlogament, en el capítol 6, es desenvolupa l'etapa de purificació del mateix. En el capítol 7, es realitza l'anàlisi de procés de les alternatives sorgides. En el capítol 8, s'exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 9), i s'afegeix l'apèndix (capítol 10), on es complementen alguns aspectes concrets d'aquest treball. / For the last two decades, gene therapy has allowed to bring up new approaches in personal medicine. Its goal is to cure illnesses through the introduction of genetic material to the nucleus of a target cell in order to allow, increase or suppress the expression of a specific gene with therapeutic purpose. The vector is the agent that plays the principal role in this mechanism. Among the possible types (viral and non viral), the adenoviral vector is one of the most important due to its pre-eminence in the current preclinical human assays. The present work achieves the complete development of a bioprocess for the obtention of adenoviral vectors for gene therapy: it studies the different aspects that conform the bioprocess, and analyzes the industrial implementation of the best alternative. As a starting point, previous studies are carried out for knowing the interaction of the adenoviral vectors with the existing producing cellular lines. Techniques are studied for culturing two cellular candidates: HEK293 (adherent) and HEK293S (non adherent). From the infection of both with the adenoviral vector, main parameters of the infective cycle are characterized, which allow to conclude that the cellular line HEK293S is more appropriate due to its higher productivity. These data provide the basis to develop the production of the bioprocess. This stage is based on the study of three fundamental factors that describe bioreaction (monitoring, culture strategy and production system), which are deeply analyzed. The oxygen uptake rate (OUR) method is developed to monitor the cellular activity during the phases of growth and infection. Later on, two culture strategies are evaluated: batch (reference stretegy) and perfusion (strategy that provides most similar conditions to those in vivo). Finally, the former factors apply to the analysis of the production system, in particular, with the utilization of two alternatives: the so called conventional system (stirred tank bioreactor Biostat Bplus) and the non conventional system (single use technology based Wave Bioreactor). From the results, it can be concluded that the perfusion strategy provides high cellular densities, increasing the productivity as well as the final viral concentration. On the other hand, some operational advantages of the non conventional system are outlined, in spite of losing the OUR measure. In order to complete the work, the purification stage of the bioprocess is developed. The properties of the product and the culture broth are analyzed, and two strategies of purification are evaluated. These differ in the possibility of increasing scale, so they are designated as non scalable strategy (based on ultracentrifugation) and scalable strategy (based on filtration and chromatography). The first one is commonly used at laboratory scale; given that the final product contains specifically the adenoviral vector, it is implemented to obtain referencie material with high purity when comparing the obtained results with the scalable strategy. The last one is developed based on the design of several operations. The characterization of the final product is carried out to determined its purity. The obtained results conclude that the scalable strategy shows higher global yield than the non scalable one, even though the degree of purity achieved is lower. The production and purification data allow to have four alternatives in order to analyze the potential implantation of the industrial bioprocess. The design and the comparison of these are carried out according to the same bases of design, and the final discussion is based on economical terms. From the results, the most advisable alternative of being brought to practice is the one based on the bioprocess operating in perfusion using the non conventional system. This memory is structured so it initially contains an introduction (chapter 2), where the characteristics of gene therapy, adenoviral vectors and the producing cellular lines, as well as the bioprocess are outlined. Next (chapter 3), the main objectives of the work are described. Next (chapter 4), the previous studies that characterize the producing cellular line as well as the infection with the adenoviral vector are concentrated. In chapter 5, the development of the production stage is presented. Analogously, in chapter 6, the purification stage is developed. In chapter 7, the process analysis of the alternatives is carried out. In chapter 8, main conclusions extracted from the work are set forth. Finally, the materials and methods used (chapter 9) are shown, and the appendix (chapter 10) is added, where some aspects of this work are complemented.