Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-06-12T18:41:28Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Geraldo Sampaio.pdf: 579470 bytes, checksum: 5ea9d0a4310f23ecab87dc463848dc1e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-12T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Geraldo Sampaio.pdf: 579470 bytes, checksum: 5ea9d0a4310f23ecab87dc463848dc1e (MD5) / Introdução: Com o avanço no entendimento de bioprocessos, houve um significativo aumento de novas técnicas que geram diversas informações sobre as interações celulares. Dentre estas técnicas, a citometria de fluxo têm se consolidado como uma importante ferramenta com amplas aplicações, como por exemplo contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo, com a análise de vários parâmetros simultaneamente. Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa principalmente em caprinos e ovinos, doença que deprecia o valor do couro e carne no mercado agro-industrial. Objetivo: padronizar técnicas, através da citometria de fluxo, para avaliar a contagem absoluta deste microrganismo, bem como aspectos fisiológicos e da interação entre C.pseudotuberculosis e células fagocitárias murinas. Metodologia: Cultivo de C.pseudotuberculosis em meio BHI - T80 0,5%, seguido da marcação deste microrganismo com corantes fluorescentes, em diferentes períodos que definem diferentes estados fisiológicos ao longo do seu crescimento. Ensaio de fagocitose utilizando células do peritônio de murinos de duas linhagens após peritonite induzida por Tioglicolato de Sódio, cultivadas e lavadas para aderência celular. Após a adesão celular, foi feito o desafio com bactérias coradas com regente fluorescente, com 1h 30 min de infecção as células aderentes foram tripsinizadas, posteriormente lavadas e centrifugadas para o ensaio por citometria de fluxo. Resultados: Observou-se um período de crescimento similar a uma curva padrão de crescimento microbiano (fases lag, log, estacionária e de declínio), contudo a técnica utilizada permitiu a distinção entres diferentes estados fisiológicos. Os dados obtidos na citometria evidenciam populações de células fagocíticas contendo bactérias no citoplasma, sendo observadas duas populações envolvidas neste processo. Uma população de baixa complexidade interna, similar à apresentada por linfócitos, e uma população com complexidade interna moderada similar a apresentada por células de origem monocítica. As células dos camundongos CBA participando da fagocitose de microrganismos da linhagem T1 apresentam uma maior granulação interna que aquelas encontradas no peritônio dos camundongos da linhagem suíça nas mesmas condições, sugerindo uma maior ativação celular. O mesmo fenômeno pode ser observado quando as células participam da fagocitose da linhagem C57. Células peritoneais de camundongos CBA apresentaram maior capacidade de fagocitose e nesta linhagem se observou um maior envolvimento de células mononucleares fagocíticas nesta atividade. Para a linhagem suíça, observou-se uma maior participação de células compatíveis com linfócitos na fagocitose deste microrganismo. Conclusões: A técnica de citometria de fluxo com a marcação por florescência foi eficaz para a avaliação do crescimento e viabilidade de Corynebacterium pseudotuberculosis, bem como da interação das células bacterianas com as células fagocitárias peritoneais murinas. A CF constitui-se, portanto, numa técnica eficiente para a avaliação da curva de crescimento desta bactéria, permitindo a distinção dos diferentes estados fisiológicos, inclusive podendo indicar um mecanismo de escape à fagocitose. / Salvador

Peptidase pode ser considerada, como uma subclasse das enzimas hidrolíticas que ocupam uma posição central em relação às suas aplicações na área fisiológica e também na área comercial. As peptidases representam um dos três maiores grupos de enzimas industriais e são responsáveis por cerca de 60% da venda mundial de enzimas. O presente trabalho visa avaliar a produção de peptidase em fermentação submersa (FSm) pelo fungo Scopulariopsis koningii, utilizando como substrato farinha de pena (FP), a caracterização bioquímica parcial, secagem do extrato bruto, purificação da peptidase e determinação de especificidade da peptidase isolada. Para avaliar a influência da farinha de pena (FP), na produção de peptidases, foram adicionadas às porcentagens de 0,2; 0,4 e 0,8% no meio de cultura. Os melhores níveis de produção de peptidases pelo fungo Scopulariopsis koningii foram obtidos nas concentrações de 0,4% e 0,8% de FP em 48h de fermentação com 1.427 U/mL. A caracterização bioquímica parcial do extrato bruto foi realizada com azocaseína 1% preparada em tampão com pH adequado. A peptidase presente no extrato enzimático apresentou atividade ótima em pH 6,5 e temperatura ótima de 55°C. A peptidase foi inibida por PMSF, indicando a presença de resíduo de aminoácido serino no sítio catalítco, e desta forma sendo classificada como serino peptidase. Entretanto, também observamos uma inibição por EDTA, sugerindo a presença de uma metalo peptidase presente no extrato bruto, desta forma podemos sugerir que o fungo S. koningii na presença do meio contendo FP secreta duas subclasses; serino e metalo peptidase, ou secreta uma serino peptidase dependente de íon. Zimograma constatou a presença de duas enzimas. A atividade enzimática do extrato bruto diminuiu significativamente quando exposta os íons Al+3, Ni2+ e Cu2+ e aumentada quando adicionados os íons Ba2+, Ca2+ e Mg2+. A purificação da metalo peptidase presente no extrato enzimático envolveu sete etapas de purificação, sendo cromatografia de troca-iônica e gel filtração determinantes, com recuperação de 6% e purificação de 3,4 vezes. Utilizando a peptidase pura (metalo) realizouse a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. A peptidase pura apresentou atividade ótima em pH 6,0 e temperatura ótima de 40°C e mostrou-se estável em ampla faixa de pH e temperatura. Foi modulada positivamente pelos íons Na+ e K+ e negativamente por Al3+ e Cu2+. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência de aminoácidos apolares do lado \"linha\" do substrato sintético na eficiência catalítica e no lado não \"linha\" grande influência de aminoácidos polares neutros e apolares. A secagem foi realizada por liofilização foram utilizados três tipos de adjuvantes: maltodextrina, manitol e glicina, em diferentes concentrações. Após a secagem foi realizado estudo da estabilidade nas temperaturas 4, 25 e 60°C por 32 dias para avaliar o desempenho dos adjuvantes na manutenção da atividade do extrato enzimático liofilizado. O adjuvante considerado mais eficaz foi a maltodextrina na concentração de 4,5% que manteve cerca de 93% da atividade do extrato enzimático liofilizado por 32 dias. / Peptidase can be considered as a subclass of hydrolytic enzymes which occupy a central position in relation to their applications in physiological area and also in the commercial area. Peptidases represent one of the three largest groups of industrial enzymes and account for about 60% of worldwide sales of enzymes. This study aims to evaluate the production of peptidase in submerged fermentation (FSm) by the fungus Scopulariopsis koningii, using as substrate feather meal (FP), the partial biochemical characterization, drying the crude extract, purification and determination of specific peptidase peptidase isolated. To evaluate the influence of feather meal (FM), in the production of peptidases, were added to the percentages of 0.2, 0.4 and 0.8% in the culture medium. The best levels of production of peptidases by the fungus Scopulariopsis koningii were obtained at concentrations of 0.4% and 0.8% of FP 48h fermentation with 1,427 U/mL. Partial biochemical characterization of the crude extract was performed with 1% azocasein prepared in buffer with appropriate pH. This in peptidase enzyme extract showed optimal activity at pH 6.5 and optimum temperature of 55°C. The peptidase was inhibited by PMSF, indicating the presence of a serine residue at amino acid catalytic site, and thus being classified as serine peptidase. However, we also observed an inhibition by EDTA, suggesting the presence of a metallo peptidase present in the crude extract, thus we suggest that the fungus S. koningii in the presence of medium containing secret FP two subclasses; serine peptidase and metal, or secretes a serine peptidase dependent ion. Zymogram found the presence of two enzymes. The enzymatic activity of the crude extract decreased significantly when exposed the Al 3+, Ni 2+ and Cu2+ ions and increased when added to Ba2+, Ca2+ and Mg2+ ions. The purification of metallo peptidase present in the enzyme extract involved seven stages of purification, and ion-exchange chromatography and gel filtration determinants, with recovery and purification of 6 % from 3.4 times. Using pure peptidase (metallo) held functional biochemical characterization and determination of kinetic parameters using both the intramolecular peptide substrate fluorescence suppression. Pure peptidase showed optimal activity at pH 6.0 and optimum temperature of 40°C and was stable in a wide range of pH and temperature. The positively modulated by Na+ and K+ and negatively by Al3+ and Cu2+. Analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of nonpolar amino acid side \"line\" of the synthetic substrate in the catalytic efficiency and not on the side \"line\" great influence of nonpolar and polar neutral amino acids. The freeze drying was performed by three types of additives were used: maltodextrin, mannitol and glycine in different concentrations. After drying stability study was conducted at the temperatures 4, 25 and 60°C for 32 days to evaluate the performance of additives in maintaining the activity of the enzyme extract lyophilized. The adjuvant was found more efficacious maltodextrin in a concentration of 4.5%, which retained about 93% of the extract lyophilized enzyme activity for 32 days.

Peptidase pode ser considerada, como uma subclasse das enzimas hidrolíticas que ocupam uma posição central em relação às suas aplicações na área fisiológica e também na área comercial. As peptidases representam um dos três maiores grupos de enzimas industriais e são responsáveis por cerca de 60% da venda mundial de enzimas. O presente trabalho visa avaliar a produção de peptidase em fermentação submersa (FSm) pelo fungo Scopulariopsis koningii, utilizando como substrato farinha de pena (FP), a caracterização bioquímica parcial, secagem do extrato bruto, purificação da peptidase e determinação de especificidade da peptidase isolada. Para avaliar a influência da farinha de pena (FP), na produção de peptidases, foram adicionadas às porcentagens de 0,2; 0,4 e 0,8% no meio de cultura. Os melhores níveis de produção de peptidases pelo fungo Scopulariopsis koningii foram obtidos nas concentrações de 0,4% e 0,8% de FP em 48h de fermentação com 1.427 U/mL. A caracterização bioquímica parcial do extrato bruto foi realizada com azocaseína 1% preparada em tampão com pH adequado. A peptidase presente no extrato enzimático apresentou atividade ótima em pH 6,5 e temperatura ótima de 55°C. A peptidase foi inibida por PMSF, indicando a presença de resíduo de aminoácido serino no sítio catalítco, e desta forma sendo classificada como serino peptidase. Entretanto, também observamos uma inibição por EDTA, sugerindo a presença de uma metalo peptidase presente no extrato bruto, desta forma podemos sugerir que o fungo S. koningii na presença do meio contendo FP secreta duas subclasses; serino e metalo peptidase, ou secreta uma serino peptidase dependente de íon. Zimograma constatou a presença de duas enzimas. A atividade enzimática do extrato bruto diminuiu significativamente quando exposta os íons Al+3, Ni2+ e Cu2+ e aumentada quando adicionados os íons Ba2+, Ca2+ e Mg2+. A purificação da metalo peptidase presente no extrato enzimático envolveu sete etapas de purificação, sendo cromatografia de troca-iônica e gel filtração determinantes, com recuperação de 6% e purificação de 3,4 vezes. Utilizando a peptidase pura (metalo) realizouse a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. A peptidase pura apresentou atividade ótima em pH 6,0 e temperatura ótima de 40°C e mostrou-se estável em ampla faixa de pH e temperatura. Foi modulada positivamente pelos íons Na+ e K+ e negativamente por Al3+ e Cu2+. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência de aminoácidos apolares do lado \"linha\" do substrato sintético na eficiência catalítica e no lado não \"linha\" grande influência de aminoácidos polares neutros e apolares. A secagem foi realizada por liofilização foram utilizados três tipos de adjuvantes: maltodextrina, manitol e glicina, em diferentes concentrações. Após a secagem foi realizado estudo da estabilidade nas temperaturas 4, 25 e 60°C por 32 dias para avaliar o desempenho dos adjuvantes na manutenção da atividade do extrato enzimático liofilizado. O adjuvante considerado mais eficaz foi a maltodextrina na concentração de 4,5% que manteve cerca de 93% da atividade do extrato enzimático liofilizado por 32 dias. / Peptidase can be considered as a subclass of hydrolytic enzymes which occupy a central position in relation to their applications in physiological area and also in the commercial area. Peptidases represent one of the three largest groups of industrial enzymes and account for about 60% of worldwide sales of enzymes. This study aims to evaluate the production of peptidase in submerged fermentation (FSm) by the fungus Scopulariopsis koningii, using as substrate feather meal (FP), the partial biochemical characterization, drying the crude extract, purification and determination of specific peptidase peptidase isolated. To evaluate the influence of feather meal (FM), in the production of peptidases, were added to the percentages of 0.2, 0.4 and 0.8% in the culture medium. The best levels of production of peptidases by the fungus Scopulariopsis koningii were obtained at concentrations of 0.4% and 0.8% of FP 48h fermentation with 1,427 U/mL. Partial biochemical characterization of the crude extract was performed with 1% azocasein prepared in buffer with appropriate pH. This in peptidase enzyme extract showed optimal activity at pH 6.5 and optimum temperature of 55°C. The peptidase was inhibited by PMSF, indicating the presence of a serine residue at amino acid catalytic site, and thus being classified as serine peptidase. However, we also observed an inhibition by EDTA, suggesting the presence of a metallo peptidase present in the crude extract, thus we suggest that the fungus S. koningii in the presence of medium containing secret FP two subclasses; serine peptidase and metal, or secretes a serine peptidase dependent ion. Zymogram found the presence of two enzymes. The enzymatic activity of the crude extract decreased significantly when exposed the Al 3+, Ni 2+ and Cu2+ ions and increased when added to Ba2+, Ca2+ and Mg2+ ions. The purification of metallo peptidase present in the enzyme extract involved seven stages of purification, and ion-exchange chromatography and gel filtration determinants, with recovery and purification of 6 % from 3.4 times. Using pure peptidase (metallo) held functional biochemical characterization and determination of kinetic parameters using both the intramolecular peptide substrate fluorescence suppression. Pure peptidase showed optimal activity at pH 6.0 and optimum temperature of 40°C and was stable in a wide range of pH and temperature. The positively modulated by Na+ and K+ and negatively by Al3+ and Cu2+. Analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of nonpolar amino acid side \"line\" of the synthetic substrate in the catalytic efficiency and not on the side \"line\" great influence of nonpolar and polar neutral amino acids. The freeze drying was performed by three types of additives were used: maltodextrin, mannitol and glycine in different concentrations. After drying stability study was conducted at the temperatures 4, 25 and 60°C for 32 days to evaluate the performance of additives in maintaining the activity of the enzyme extract lyophilized. The adjuvant was found more efficacious maltodextrin in a concentration of 4.5%, which retained about 93% of the extract lyophilized enzyme activity for 32 days.

Em caso de envenenamento ofídico, o tratamento no Brasil hoje é realizado pela administração de soros geralmente produzidos por equinos, que apresentam eficácia limitada: são úteis para os efeitos sistêmicos, mas não inibem efetivamente a evolução dos danos locais, podem causar reações adversas e apresentam alto custo de produção. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), trata-se de uma doença negligenciada pelas autoridades científicas mundiais. O presente projeto, em parceria com o Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais da Fundação Oswaldo Cruz - Rondônia, propõe a produção por Escherichia coli de fragmentos de anticorpos de cadeia pesada de camelídeos, denominados VHH, contra as toxinas do veneno de Bothrops jararacussu, utilizando biorreator. Neste trabalho há interesse em produzir VHH, através da otimização do crescimento desta E. coli. A cinética do crescimento bacteriano foi realizada em shaker orbital sob diferentes condições, variando tamanho do frasco, rotação do shaker, composição do meio de cultura e concentração de substrato; e em biorreatores, alternando meios de cultura e modo de operação do reator (descontínuo e descontínuo alimentado), alterando a vazão de alimentação (linear e exponencial) O processo cinético é fortemente limitado pela formação de acetato, por condições auxotróficas da célula e pela transferência de oxigênio. Nos ensaios em frascos agitados, uma melhor condição de crescimento foi obtida utilizando frascos de 1 L, sob rotação a 270 rpm e 5,0 g/L de glicose. Nos ensaios em reator, quando operados em batelada obtiveram-se cerca 5,5 g/L de células finais, contra 9,3 g/L de células em batelada alimentada com vazão constante. Um maior crescimento foi ainda obtido em um reator de 2 L em regime de batelada alimentada exponencialmente. O biorreator varia a agitação do meio e mantém um nível pré-definido de oxigênio dissolvido, evitando a limitação de oxigênio e controlando a oferta de glicose para o crescimento celular. Neste processo, atingimos 25,6 g/L de células e 0,35 g/L de proteína total após purificação, utilizando meio M9 suplementado. / Nowadays in Brazil, the treatment for snakebite poisoning is carried out by the administration of horse sera, which have limited effectiveness: they are useful for systemic effects, but do not effectively inhibit local damage, cause adverse reactions, and present high production costs. According to the WHO, this disease is neglected by the world`s scientific authorities. This project, in partnership with the Institute for Research in Tropical Diseases of Oswaldo Cruz Foundation - Rondonia, proposes the production of heavy chain antibody fragments from camelids, called VHH, using Escherichia coli, to be used against the toxins from the Bothrops jararacussu poison, using a bioreactor. This work is interested in producing VHH through the use of E. coli. The kinetics of bacterial growth were performed in orbital shaker under different conditions, varying vial size, shaker rotation, composition of the culture medium and substrate concentration; and bioreactors, alternating culture media and operation mode of reactor (batch and fed-batch), changing feeding rate (linear and exponential). The kinetic process is statically bound to acetate formation, auxotrophic conditions of the cell and oxygen transfer. In assays in shaken flasks, an output of 270 rpm and 5.0 g/L of glucose. In reactor runs, when operated in a batch 5.5 g/L of final cells were obtained, against 9.3 g/L of final cells in fed-batch with constant flowrate. A larger value was obtained in an exponentially fed-batch reactor of 2 L. The bioreactor varies the agitation of oxygen and controls glucose addition for cell growth. In this process, 25.6 g/L cells and 0.35 g/L total protein after purification were reached, using supplemented M9 medium.

Foram analisados alguns parâmetros que influenciam os bioprocessos, submerso e sólido, do fungo Eupenicillium javanicum na produção de peptidases. No bioprocesso submerso foram avaliados a influência de diferentes concentrações e tipos de fonte de carbono e concentrações de fonte nitrogênio no meio, pH, temperatura e tempo de incubação. No bioprocesso sólido avaliou-se a influência de dois tipos de resíduos agroindustriais, em diferentes proporções, dois tipos de fonte de nitrogênio, em diferentes concentrações, tempo e temperatura de incubação. As peptidases produzidas em ambos os bioprocessos foram caracterizadas bioquimicamente, avaliando pH e temperatura ótima, estabilidade em diferentes temperaturas e valores de pH e influência da adição de íons e inibidores na atividade da peptidase. A enzima produzida em bioprocesso sólido foi submetida ao processo de purificação utilizando métodos cromatográficos. Utilizando a peptidase pura realizou-se a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. Além disso, o extrato enzimático obtido através do bioprocesso foi submetido ao processo de microencapsulação, visando uma maior estabilidade das peptidases e facilidade no armazenamento e transporte, utilizando a técnica de Spray drying, em seguida foi avaliado o rendimento do processo e a estabilidade das peptidases das micropartículas produzidas. O fungo Eupenicillium javanicum mostrou potencial na produção de peptidases em ambos bioprocessos, produzindo peptidases da classe das metalopeptidases com alta estabilidade em diferentes valores de pH e temperatura. O processo de purificação mostrou-se viável e reprodutível. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência do lado \"linha\" da peptidase na eficiência catalítica. O processo de microencapsulação mostrou-se viável e gerou micropartículas estáveis. A peptidase produzida apresentou características que demonstram seu potencial uso nas diferentes áreas industriais. / Some parameters that influence the submerged and semi solid bioprocesses, by the fungus Eupenicillium javanicum in the peptidases production, were conducted. In submerged bioprocess was evaluated the effect of different concentrations and types of carbon source and nitrogen source in the medium, pH, temperature and incubation time. In semi solid bioprocess semi solid was evaluated the influence of two types of agroindustrial residues, in different proportions, and different concentrations of nitrogen source, temperature and of incubation time. The peptidases produced in both bioprocesses were characterized biochemically, evaluating, the optimum pH and temperature, stability at different temperatures and pH values and the influence of the addition of ions and inhibitors on peptidase activity. The enzyme produced in semi solid bioprocess was subjected to the purification process using chromatographic methods. Using pure peptidase was performed the biochemical characterization and determination of kinetic parameters, both using the fluorescence intramolecular suppression peptide substrate. Furthermore, the enzymatic extract obtained by semi solid bioprocess was subjected to microencapsulation process by using the technique of spray drying, in order to obtain greater stability, ease storage and transport of peptidases, then assessed the yield process and stability of the peptidases of microparticles produced. The fungus Eupenicillium javanicum showed potential production of peptidases in the both bioprocesses, producing peptidases that belong to the class of metallopeptidases, with high stability at different pH and temperature. The purification process was feasible and reproducible. The analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of the \"line\" side on the peptidase catalytic efficiency. The microencapsulation process was feasible and generated stable microparticles. The peptidase produced has characteristics that demonstrated it a potential use in different industrial fields.

Em caso de envenenamento ofídico, o tratamento no Brasil hoje é realizado pela administração de soros geralmente produzidos por equinos, que apresentam eficácia limitada: são úteis para os efeitos sistêmicos, mas não inibem efetivamente a evolução dos danos locais, podem causar reações adversas e apresentam alto custo de produção. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), trata-se de uma doença negligenciada pelas autoridades científicas mundiais. O presente projeto, em parceria com o Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais da Fundação Oswaldo Cruz - Rondônia, propõe a produção por Escherichia coli de fragmentos de anticorpos de cadeia pesada de camelídeos, denominados VHH, contra as toxinas do veneno de Bothrops jararacussu, utilizando biorreator. Neste trabalho há interesse em produzir VHH, através da otimização do crescimento desta E. coli. A cinética do crescimento bacteriano foi realizada em shaker orbital sob diferentes condições, variando tamanho do frasco, rotação do shaker, composição do meio de cultura e concentração de substrato; e em biorreatores, alternando meios de cultura e modo de operação do reator (descontínuo e descontínuo alimentado), alterando a vazão de alimentação (linear e exponencial) O processo cinético é fortemente limitado pela formação de acetato, por condições auxotróficas da célula e pela transferência de oxigênio. Nos ensaios em frascos agitados, uma melhor condição de crescimento foi obtida utilizando frascos de 1 L, sob rotação a 270 rpm e 5,0 g/L de glicose. Nos ensaios em reator, quando operados em batelada obtiveram-se cerca 5,5 g/L de células finais, contra 9,3 g/L de células em batelada alimentada com vazão constante. Um maior crescimento foi ainda obtido em um reator de 2 L em regime de batelada alimentada exponencialmente. O biorreator varia a agitação do meio e mantém um nível pré-definido de oxigênio dissolvido, evitando a limitação de oxigênio e controlando a oferta de glicose para o crescimento celular. Neste processo, atingimos 25,6 g/L de células e 0,35 g/L de proteína total após purificação, utilizando meio M9 suplementado. / Nowadays in Brazil, the treatment for snakebite poisoning is carried out by the administration of horse sera, which have limited effectiveness: they are useful for systemic effects, but do not effectively inhibit local damage, cause adverse reactions, and present high production costs. According to the WHO, this disease is neglected by the world`s scientific authorities. This project, in partnership with the Institute for Research in Tropical Diseases of Oswaldo Cruz Foundation - Rondonia, proposes the production of heavy chain antibody fragments from camelids, called VHH, using Escherichia coli, to be used against the toxins from the Bothrops jararacussu poison, using a bioreactor. This work is interested in producing VHH through the use of E. coli. The kinetics of bacterial growth were performed in orbital shaker under different conditions, varying vial size, shaker rotation, composition of the culture medium and substrate concentration; and bioreactors, alternating culture media and operation mode of reactor (batch and fed-batch), changing feeding rate (linear and exponential). The kinetic process is statically bound to acetate formation, auxotrophic conditions of the cell and oxygen transfer. In assays in shaken flasks, an output of 270 rpm and 5.0 g/L of glucose. In reactor runs, when operated in a batch 5.5 g/L of final cells were obtained, against 9.3 g/L of final cells in fed-batch with constant flowrate. A larger value was obtained in an exponentially fed-batch reactor of 2 L. The bioreactor varies the agitation of oxygen and controls glucose addition for cell growth. In this process, 25.6 g/L cells and 0.35 g/L total protein after purification were reached, using supplemented M9 medium.

Foram analisados alguns parâmetros que influenciam os bioprocessos, submerso e sólido, do fungo Eupenicillium javanicum na produção de peptidases. No bioprocesso submerso foram avaliados a influência de diferentes concentrações e tipos de fonte de carbono e concentrações de fonte nitrogênio no meio, pH, temperatura e tempo de incubação. No bioprocesso sólido avaliou-se a influência de dois tipos de resíduos agroindustriais, em diferentes proporções, dois tipos de fonte de nitrogênio, em diferentes concentrações, tempo e temperatura de incubação. As peptidases produzidas em ambos os bioprocessos foram caracterizadas bioquimicamente, avaliando pH e temperatura ótima, estabilidade em diferentes temperaturas e valores de pH e influência da adição de íons e inibidores na atividade da peptidase. A enzima produzida em bioprocesso sólido foi submetida ao processo de purificação utilizando métodos cromatográficos. Utilizando a peptidase pura realizou-se a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. Além disso, o extrato enzimático obtido através do bioprocesso foi submetido ao processo de microencapsulação, visando uma maior estabilidade das peptidases e facilidade no armazenamento e transporte, utilizando a técnica de Spray drying, em seguida foi avaliado o rendimento do processo e a estabilidade das peptidases das micropartículas produzidas. O fungo Eupenicillium javanicum mostrou potencial na produção de peptidases em ambos bioprocessos, produzindo peptidases da classe das metalopeptidases com alta estabilidade em diferentes valores de pH e temperatura. O processo de purificação mostrou-se viável e reprodutível. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência do lado \"linha\" da peptidase na eficiência catalítica. O processo de microencapsulação mostrou-se viável e gerou micropartículas estáveis. A peptidase produzida apresentou características que demonstram seu potencial uso nas diferentes áreas industriais. / Some parameters that influence the submerged and semi solid bioprocesses, by the fungus Eupenicillium javanicum in the peptidases production, were conducted. In submerged bioprocess was evaluated the effect of different concentrations and types of carbon source and nitrogen source in the medium, pH, temperature and incubation time. In semi solid bioprocess semi solid was evaluated the influence of two types of agroindustrial residues, in different proportions, and different concentrations of nitrogen source, temperature and of incubation time. The peptidases produced in both bioprocesses were characterized biochemically, evaluating, the optimum pH and temperature, stability at different temperatures and pH values and the influence of the addition of ions and inhibitors on peptidase activity. The enzyme produced in semi solid bioprocess was subjected to the purification process using chromatographic methods. Using pure peptidase was performed the biochemical characterization and determination of kinetic parameters, both using the fluorescence intramolecular suppression peptide substrate. Furthermore, the enzymatic extract obtained by semi solid bioprocess was subjected to microencapsulation process by using the technique of spray drying, in order to obtain greater stability, ease storage and transport of peptidases, then assessed the yield process and stability of the peptidases of microparticles produced. The fungus Eupenicillium javanicum showed potential production of peptidases in the both bioprocesses, producing peptidases that belong to the class of metallopeptidases, with high stability at different pH and temperature. The purification process was feasible and reproducible. The analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of the \"line\" side on the peptidase catalytic efficiency. The microencapsulation process was feasible and generated stable microparticles. The peptidase produced has characteristics that demonstrated it a potential use in different industrial fields.

Utilizou-se um meio de cultivo a base de farinha de mandioca, suplementado com nutrientes, em fermentador agitado (700 rpm) e aerado (10 litros de ar/min), com volume de reação de 10 litros praticamente constante, fração de inóculo de 10% em volume, ph 4,0 e temperatura de 35ºC. Foram realizados ensaios com concentração total de açúcares de 20 g/l e 40 g/l, tanto descontínuos como descontínuos alimentados. Nestes variou-se a vazão mássica de alimentação (fs), o instante de início de alimentação e a condição do xarope de farinha (previamente hidrolisado ou não). Repetições dos ensaios descontínuos indicaram variabilidade de resultados elevada. Não se observou expressivas mudanças no crescimento microbiano, a não ser pelo aumento na velocidade específica nos ensaios descontínuos alimentados a 20 g/l. A síntese de glicoamilase foi sensivelmente aumentada nos ensaios descontínuos alimentados a 20 g/l (produtividade dobrada). A 40 g/l, obteve-se produtividade 26% superior. Os melhores resultados foram obtidos com fs=17,1 gart/h a so=20 g/l e fs=32,2 gart/h a 40 g/l, e obteve-se o pior no ensaio em que se alimentou desde o início de cultivo. A so=20 g/l a repressão se apresenta como principal mecanismo de controle de síntese de glicoamilase, não ocorrendo a mesma a 40 g/l, ensaios nos quais a indução tornou-se muito relevante. / In order to study different processes and the influence of control mechanism on glucoamylase synthesis, several batch and fed-batch runs were made with Aspergillus awamori NRRL 3112. A medium containing cassava flour and nutrients were used in a 10 liters stirred and aerated tank, at pH 4,0 and temperature 35 °C. The batch and fed-batch runs used 20 and 40 g of total reducing sugars (TRS) per liter. In the fed-batch runs, the carbon source feed rate (fs), the feeding start time, and whether the syrup were pre-hydrolyzed or not were varied. Repeated batch runs showed significant variability. Notable changes in cell growth were not observed, unless by the increase of the specific growth rate in the 20 gTRS/l fed-batch runs. The enzyme productivity doubled in the lower sugar concentration fed-batch runs, but increased just 26% in the runs with 40g/l of TRS. The best results were achieved at 20g/l with carbon source feed rate=17,1 gTRS/h and fs=32,2 gTRS/h at 40g/l. The worst noted when the feeding started at the beginning of the run. At 20 gTRS/l, repression showed as the main mechanism control in order to synthesize glucoamylase. On the other hand induction became the relevant factor when 40gTRS/l were offered to microorganism.

Utilizou-se um meio de cultivo a base de farinha de mandioca, suplementado com nutrientes, em fermentador agitado (700 rpm) e aerado (10 litros de ar/min), com volume de reação de 10 litros praticamente constante, fração de inóculo de 10% em volume, ph 4,0 e temperatura de 35ºC. Foram realizados ensaios com concentração total de açúcares de 20 g/l e 40 g/l, tanto descontínuos como descontínuos alimentados. Nestes variou-se a vazão mássica de alimentação (fs), o instante de início de alimentação e a condição do xarope de farinha (previamente hidrolisado ou não). Repetições dos ensaios descontínuos indicaram variabilidade de resultados elevada. Não se observou expressivas mudanças no crescimento microbiano, a não ser pelo aumento na velocidade específica nos ensaios descontínuos alimentados a 20 g/l. A síntese de glicoamilase foi sensivelmente aumentada nos ensaios descontínuos alimentados a 20 g/l (produtividade dobrada). A 40 g/l, obteve-se produtividade 26% superior. Os melhores resultados foram obtidos com fs=17,1 gart/h a so=20 g/l e fs=32,2 gart/h a 40 g/l, e obteve-se o pior no ensaio em que se alimentou desde o início de cultivo. A so=20 g/l a repressão se apresenta como principal mecanismo de controle de síntese de glicoamilase, não ocorrendo a mesma a 40 g/l, ensaios nos quais a indução tornou-se muito relevante. / In order to study different processes and the influence of control mechanism on glucoamylase synthesis, several batch and fed-batch runs were made with Aspergillus awamori NRRL 3112. A medium containing cassava flour and nutrients were used in a 10 liters stirred and aerated tank, at pH 4,0 and temperature 35 °C. The batch and fed-batch runs used 20 and 40 g of total reducing sugars (TRS) per liter. In the fed-batch runs, the carbon source feed rate (fs), the feeding start time, and whether the syrup were pre-hydrolyzed or not were varied. Repeated batch runs showed significant variability. Notable changes in cell growth were not observed, unless by the increase of the specific growth rate in the 20 gTRS/l fed-batch runs. The enzyme productivity doubled in the lower sugar concentration fed-batch runs, but increased just 26% in the runs with 40g/l of TRS. The best results were achieved at 20g/l with carbon source feed rate=17,1 gTRS/h and fs=32,2 gTRS/h at 40g/l. The worst noted when the feeding started at the beginning of the run. At 20 gTRS/l, repression showed as the main mechanism control in order to synthesize glucoamylase. On the other hand induction became the relevant factor when 40gTRS/l were offered to microorganism.

O etanol é um dos biocombustíveis oriundos de fontes renováveis mais promissor e ambientalmente amigável. Visando-se ao atendimento de uma demanda crescente por este álcool, o aproveitamento integral dos materiais lignocelulósicos é uma alternativa interessante e, desta forma, trabalhos de pesquisa têm sido desenvolvidos visando-se à viabilização de biorrefinarias de produção integrada de etanol 1G e 2G. O presente trabalho teve como objetivo principal desenvolver e analisar economicamente modelos de biorrefinaria integrada 1G2G que empregam pré-tratamento ácido diluído, avaliando-se o impacto econômico do destino da hemicelulose para produção de etanol. Para isso, foram definidos cenários que incluíssem todas as etapas do processo de produção de etanol 1G e 2G, sendo avaliados dois teores de sólidos no reator de pré-tratamento (5% e 10%) e, para cada caso, três relações tempo e conversão da hidrólise enzimática, sendo estas de 45%, 51% e 55% para tempos de reação de 24h, 48h e 72h, respectivamente. Para cada condição, considerou-se a fermentação de pentose (C5) ou seu envio para tratamento de efluentes, constituindo-se, assim, 12 cenários. Foram realizadas as simulações destes cenários auxiliadas pelo pacote computacional Aspen Plus®, obtendo-se os dados de balanço de massa e energia, permitindo assim a realização da análise de viabilidade econômica empregando a plataforma Biorrefinaria Virtual de Cana - BVC. Foi possível observar que a produção de etanol 2G empregando pré-tratamento ácido diluído foi responsável por um aumento na produção de etanol de até 35%. Avaliando-se os cenários, observou-se que quando o reator de pré-tratamento foi operado com maior teor de sólidos, menor consumo de energia térmica foi necessário, requerendo menor quantidade de bagaço na caldeira e aumentando o rendimento final de etanol. Com relação ao custo de investimento, este correspondeu a R$799,2 milhões para a biorrefinaria 1G, enquanto que os cenários integrados 1G2G apresentaram valores cerca de 40% superiores. Dentre as áreas mais expressivas no custo de investimento, estão a de pré-tratamento e geração e distribuição de vapor. No que concerne ao custo de produção de etanol, os cenários que apresentaram menor valor para etanol 2G corresponderam ao uso de 10% de sólidos no reator de pré-tratamento com fermentação de C5. As áreas mais expressivas para esse custo foram os custos com insumos e capital. Todavia, os cenários com 5% de sólidos no reator de pré-tratamento e sem fermentação de C5 resultaram em menor custo de produção global de etanol (1G2G), sendo o custo com cana, insumos e capital os mais expressivos. Com base na taxa interna de retorno, esta se apresentou abaixo da taxa mínima de atratividade para todos os cenários, ocasionando um valor presente líquido negativo, inferindo-se que, nas condições avaliadas, a metodologia empregada nos cenários está inviável do ponto de vista de um investidor. No entanto, a análise econômica auxiliou a identificação dos gargalos tecnológicos do processo de produção integrada de etanol 1G2G quando estes empregam pré-tratamento ácido diluído, favorecendo a definição de metas operacionais a serem solucionadas em trabalhos de pesquisa. / Ethanol is one of the most promising and environmentally friendly biofuels obtained from renewable energy sources. Aiming at meeting a growing demand for this fuel, the integral use of lignocellulosic materials is an interesting alternative and, in this way, research Works have been performed to make viable biorefineries for integrated production of 1G and 2G ethanol. The present work had as main objective to develop and to analyze economically models of 1G2G integrated biorefineries using dilute acid pretreatment, evaluating the economic impact of using hemicellulose for ethanol production. Alternative scenarios were defined including all steps of the 1G and 2G ethanol production process. Two different solids contents were evaluated in the pre-treatment reactor (5% and 10%) and, for each case, three values of time and conversion for the enzymatic hydrolysis step were considered, namely 45%, 51% and 55% for reaction times of 24h, 48h and 72h, respectively. For each condition, the fermentation of pentose (C5) or its sending for effluents treatment was supposed, constituting, thus, 12 scenarios. Simulations of these scenarios were carried out using the software Aspen Plus®, generating mass and energy balance data, thus allowing carrying out economic viability analysis using the Virtual Sugarcane Biorefinery (VSB) platform. Production of 2G ethanol using dilute acid pretreatment was responsible for an increase in ethanol production of up to 35%. When the pretreatment reactor was operated with higher solids content, lower thermal energy consumption was necessary, requiring less bagasse in the boiler and thus increasing the final ethanol yield. Regarding to investment cost, it was of R$ 799.2 million for 1G biorefinery, compared to a value 40% higher observed for integrated 1G2G scenarios. Among the most significant areas of investment cost are the pretreatment and the generation and distribution of steam. With relation to the cost of etanol production, scenarios that presented the lowest value for 2G ethanol corresponded to the use of 10% solids in the pre-treatment reactor associated to C5 fermentation. The most significant areas for this cost were the input and capital costs. However, the scenarios with 5% solids in the pre-treatment reactor without C5 fermentation resulted in a lower global ethanol production cost (1G2G), with sugarcane, chemical inputs and capital cost representing the most significant fraction. Based on the internal rate of return, this was lower than the minimum attractiveness rate of return for all scenarios, resulting in a negative net present value, allowing inferring that, under the evaluated conditions, the methodology used in the scenarios would be unviable from an investor viewpoint. However, the economic analysis helped to identify technological bottlenecks of the integrated 1G2G etanol production process using dilute acid pretreatment, favoring the definition of operational goals to be solved in research works.