O objetivo deste trabalho foi modificar os procedimentos da maturação in vitro (MIV) para induzir a competência de oócitos bovinos com intensa atividade da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH), determinada pelo emprego do corante vital Azul de Cresil Brilhante (BCB). Foram realizados dois experimentos; no primeiro trabalho foi realizada a MIV de oócitos após a identificação da atividade da G6PDH, empregando-se a seguinte proporção: competentes (sem atividade enzimática)/não competentes - 10:01, respectivamente. Os resultados revelaram um efeito negativo dos oócitos não competentes sobre a capacidade dos competentes em realizarem a MIV, a FIV e a CIV. Os resultados sugerem que para aumentar a produção de embriões deve-se realizar a MIV de oócitos competentes e não competentes, separadamente. O objetivo do segundo experimento foi verificar se a prolongação do tempo de MIV (30h) afetaria as taxas de MIV, FIV e CIV obtidas a partir de oócitos não competentes. Os oócitos não competentes não foram afetados, positiva ou negativamente, pelo prolongamento do tempo de MIV, no entanto, os oócitos competentes sofreram decréscimo na capacidade de serem fecundados e desenvolverem-se até o estágio de blastocistos. Podemos concluir que as modificações realizadas no procedimento da MIV não foram capazes de induzir competência em oócitos com intensa atividade da enzima G6PDH. / The present work aimed modify the in vitro maturation (IVM) procedure to induce competence of bovine oocytes with high glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) activity. Two experiments were carried out; the first non-competent oocytes (with high enzymatic activity) were matured with competent oocyte (lower G6PDH activity) on proportion of 1:10, respectively. The second experiment aimed observe the effect of prolonged IVM (from 24 to 30h) on the cleavage and development rates in oocytes with higher enzymatic activity. Our data showed that oocytes with lower enzymatic activity did not induce competence of higher G6PDH activity oocyte. However, we observed a negatively effect on the cleavage and development rates on oocytes competent, then, to increase the number of embryos in vitro produced we need to mature oocytes competent and non-competent separately. In the second experiment, the non-competent gametes submitted to prolonged IVM were not affected, however, competent oocytes were negatively affect by prolonged IVM. We can concluded that the IVM modifications did not able to induce the competence in the oocytes with high G6PDH activity.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro determinar as taxas de desenvolvimento in vitro de embriões murinos no estágio de 8-células expostos a 15.7 MPa de N2 durante 2 ou 4 horas. Segundo, determinar as taxas de sobrevivência embrionária à crioconservação dos blastocistos originados a partir do cultivo dos embriões de 8-células após a indução do estresse subletal celular com o auxílio da pressão gasosa. Terceiro, determinar a expressão dos genes BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 e PPIA nas seguintes etapas experimentais: no estágio de 8-células imediatamente após a coleta dos embriões; no estágio de blastocisto antes e após o congelamento. Nas seis replicações realizadas foram utilizados 14 machos e 60 fêmeas Mus musculus domesticus. Na primeira etapa dos experimentos, das fêmeas superovuladas, 38 produziram 1092 embriões viáveis no estágio de 8-células que foram, de forma aleatória, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo P1 – os embriões foram expostos a 15.7 MPa de N2 gasoso durante 2 horas e após cultivados in vitro até alcançar o estádio de blastocisto; Grupo P2 – os embriões foram tratados de maneira idêntica aos do Grupo P1, sendo expostos aos 15.7 MPa de N2 gasoso durante 4 horas; Grupo controle CE - os embriões foram submetidos ao cultivo in vitro imediatamente após a coleta; Grupo controle CB: os embriões foram mantidos em temperatura ambiente (22 ºC) durante 4 horas e após colocados na estufa para o cultivo in vitro. Na segunda etapa, amostras dos embriões dos quatro grupos experimentais tiveram a expressão gênica determinada com auxílio da amplificação e determinação quantitativa do mRNA (“Real Time PCR”). Os resultados do desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto na primeira etapa foram os seguintes: Grupo P1 – 96,4% (245/253); Grupo P2 – 94,0% (253/269); Grupo CE – 95,0% (249/262) e Grupo CB – 95,4 (249/261). Na segunda etapa dos experimentos os resultados de reexpansão dos blastocistos após a criopreservação foram: Grupo P1 – 86,3% (63/73); Grupo P2 – 80,0 (76/95); Grupo CE – 72,8 (67/92); Grupo CB – 83,6 (92/110). A análise da expressão da maioria dos genes não revelou diferenças entre os grupos experimentais, provavelmente devido à variação biológica dos embriões entre os grupos e dentro de um mesmo grupo. A exposição dos embriões no estágio de 8-células a 15.7 MPa de N2 gasoso não comprometeu a viabilidade in vitro para desenvolverem-se ao estágio de blastocisto. As taxas de sobrevivência dos blastocistos à criopreservação diferiram somente entre os grupos de embriões expostos à HGP durante 2 horas (P1) no estágio de 8-células (86,3%) e o grupo de embriões submetidos ao cultivo in vitro (CE) (72,8%). Os resultados dos experimentos revelaram que a HGP pode ser empregada na indução de estresse celular subletal em embriões murinos. / The first objective of the experiments was to determine the development rates of mouse embryos exposed to high gaseous pressure (HGP – 15.7 MPa gaseous N2) at 8-cell stage for 2 or 4 hours. Second, determine the blastocyst re-expansion rates after cryopreservation. Third, determine the relative expression of BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 and PPIA in the following experimental steps: immediately after collection of 8-cell stage embryos, at the blastocyst stage before and after freezing. Fourteen males and 60 females Mus musculus domesticus were used in six experiment replications. Thirty-eight (63%) from the 60 superovulated, females produced 1092 viable embryos. These 8-cell stage embryos were then randomly divided into four experimental groups: P1 group – embryos were first exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 2 hours and after cultured in vitro until the blastocyst stage; P2 group - embryos were treated identically to the P1 group, but were exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 4 hours; CE control group - embryos were submitted to in vitro culture immediately after collection; CB control group - embryos were maintained at room temperature (22ºC) for 4 hours and after cultured in vitro. The results of embryo in vitro development to the blastocyst stage were: P1 Group- 96.4% (245/253); P2 group- 94.0% (253/269); CE group- 95.0% (249/262) and CB- 95.4 (249/261). After cryopreservation the blastocyst re-expansion rates were: P1 group- 86.3 % (63/73); P2 group- 80.0 (76/95); CE group – 72.8 (67/92), CB group- 83.6 (92/110). No major differences in gene expression were observed among treatment groups for most genes analyzed in this study, likely due to the biological variability in groups of embryos within each group. Exposure of embryos at 8-cells stage to 15.7 MPa of gaseous N2 did not compromise in vitro embryo viability to reach the blastocyst stage. The survival rates of blastocysts to cryopreservation differ only among the embryos that were exposed to the HGP during 2 hours at 8-cell stage (86,3 %) and the 8-cell stage embryos that were submitted to the in vitro culture immediately after collection (72,8 %). The experimental results showed that HGP can be used to induce sublethal cell stress in murine embryos.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA079.pdf: 1198872 bytes, checksum: 45c625202a482ee64b00347aef9f38a0 (MD5) Previous issue date: 2011-06-30 / The Flemish cattle breed, originarily from the Northeast region of France, was imported to Brazil from Argentina in 1945, being allocated to an experimental Station in Lages, State of Santa Catarina (SC). The Flemish is a double purpose breed very well adapted to the altiplane. Such features contributed to a quick dissemination of this breed in the Southern region of Brazil. However, the introduction of more specialized breeds in the past decades caused a loss of interest in the Flemish breed, resulting in a drastic reduction in the herd size, with only about fifty animals still remaining, all located at the EPAGRI Experimental Station in Lages, SC. The high risk of extinction imposed to this small herd, along with its importance to biodiversity, justifies the need for its preservation. For that, the Ovum Pick Up (OPU)/in vitro embryo production (IVP) and the multiple ovulation and embryo transfer (MOET) procedures are among the available reproductive biotechnologies that could be readily applied for the maintenance and expansion of the breed. However, data regarding the oocyte retrieval efficiency by OPU and embryo yield either by IVP or MOET for Flemish cattle are still lacking. The aim of this study was to compare the efficiency of the in vivo and in vitro embryo production systems for the Flemish breed, using Holstein females as control counterparts. Eight multiparous Flemish females and eight Holstein females were allocated to two subgroups of four animals per breed. Each subgroup was subjected to 10 OPU sessions, at weekly intervals, or two MOET protocols, for two periods of 63 days. After the conclusion of one 63-days long period of OPU and MOET sessions, both procedures were repeated in a second period of 63 days, inverting the subgroups of animals for each procedure. The OPU was performed by ultrasonography for the transvaginal aspiration of &#8805;3 mm follicles. Recovered oocytes were morphologically graded and subjected to IVP procedures, including the in vitro maturation, fertilization and culture steps, up to Day 7 of development. For the MOET subgroups, a standard decreasing FSH dose treatment was used followed by AI, with embryo recovery performed by nonsurgical procedures on Day 7 after AI. Frozen semen from the same Flemish bull was used for the entire experiment. Quantitative data were analyzed using the PROC MIXED or by the Friedman test (SAS), whereas qualitative data were analyzed by the &#967;2 test, and data on the embryonic morphology and kinetics of development by the Kruskal-Wallis test (Minitab), for P<0.05. After 20 OPU sessions per breed, a total of 635 viable oocytes were obtained from Flemish females, with 8.0 ± 0.7 oocytes/animal/section, which was significantly higher than from Holstein cows (543 viable oocytes, 7.3 ± 0.7 oocytes/animal/section). The mean number of blastocysts per IVP procedure (3.9 ± 1.5 vs. 2.1 ± 1.2) and blastocyst rates (11.8% vs. 7.2%) were higher in Flemish than in Holstein females, respectively. After four MOET sessions (total of 32 flushings), Flemish females yielded more viable embryos than Holstein animals (111 vs. 48 viable embryos, with 7.5 ± 1.8 vs. 3.7 ± 1.4 embryos/female, respectively). In conclusion, Flemish females yielded more viable oocytes by OPU and more viable embryos by IVP or MOET than Holstein females. Also, MOET procedures were more efficient than OPU/IVP for the production of embryos, irrespective of the breed. Nevertheless, both reproductive biotechnologies, OPU/IVP and MOET procedures, were efficient as useful tools for the genetic conservation of Flemish cattle / Bovinos da raça Flamenga, originários da França, chegaram ao Brasil em 1945 oriundos da Argentina, sendo alocados em Lages, no Estado de Santa Catarina. Esta raça é de dupla aptidão e que, devido à perfeita adaptação às condições edafoclimáticas regionais, acabou compondo inúmeros rebanhos na região Sul do Brasil. Porém, a introdução de raças especializadas no decorrer das últimas décadas ocasionou desinteresse pela raça Flamenga, resultando na redução drástica do rebanho, com cerca de cinqüenta animais ainda remanescentes e lotados na EPAGRI de Lages. O risco de extinção imposto a este rebanho e sua importância para a biodiversidade justificam a necessidade de sua preservação. Dentre as biotécnicas reprodutivas que podem ser utilizadas para a expansão desta raça destacam-se a Ovum Pick Up (OPU)/produção in vitro de embriões (PIV) e a produção in vivo de embriões pela múltipla ovulação, inseminação artificial (IA) e transferência de embriões (TE). Informações sobre a eficiência de recuperação de oócitos obtidos por OPU para a PIV ou mesmo de embriões produzidos por TE na raça Flamenga são praticamente inexistentes. O objetivo deste estudo foi comparar as eficiências de produção in vitro vs. in vivo de embriões da raça Flamenga, utilizando-se a raça Holandesa como controle. Oito fêmeas da raça Flamenga e oito da raça Holandesa foram subdivididas em dois subgrupos de quatro animais/raça. Cada subgrupo foi submetido a um bloco de 10 seções de OPU/PIV com intervalo semanal ou a duas seções de TE, em um intervalo de 63 dias. Passado este primeiro período de 63 dias, ambos os procedimentos (OPU/PIV e TE) foram repetidos em um segundo período de 63 dias, invertendo-se os subgrupos de animais para cada procedimento. A OPU foi realizada por ultrassonografia transvaginal para a aspiração de folículos com diâmetro acima de 3 mm. Todos os CCOs foram avaliados morfologicamente e submetidos à PIV, a qual incluiu as etapas de maturação, fecundação e cultivo in vitro até o Dia 7 de desenvolvimento. Para a TE, realizou-se protocolo padrão com doses decrescentes de FSH, seguida de IA, com recuperação de embriões realizados por procedimento não-cirúrgico no dia 7 após a inseminação. Sêmen congelado do mesmo touro da raça Flamenga foi utilizado em todo o experimento. Os dados quantitativos foram analisados pelo PROC MIXED ou pelo teste de Friedman (SAS). Os dados qualitativos foram analisados pelo teste do &#967;2, e analisou-se os dados de morfologia embrionária e cinética de desenvolvimento pelo teste de Kruskal-Wallis (Minitab), para P<0,05. Após 20 seções de OPU/raça, o número total de oócitos viáveis e a média de oócitos/animal/seção na raça Flamenga (n=635 e 8,0 ± 0,7) foram superiores à raça Holandesa (n=543 e 7,3 ± 0,7), respectivamente. O número médio de blastocistos obtidos por rotina de PIV (3,9 ± 1,5 vs. 2,1 ± 1,2) e a taxa de blastocistos pela PIV (11,8% vs. 7,2%) foram maiores para fêmeas da raça Flamenga se comparadas a fêmeas da raça Holandesa, respectivamente. Após quatro seções de TE (32 coletas/recoletas totais), produziram-se 111 embriões viáveis na raça Flamenga, com média de 7,5 ± 1,8 embriões/fêmea, sendo superior à raça Holandesa, a qual obteve um total de 48 estruturas viáveis, com média de 3,7 ± 1,4 embriões viáveis/fêmea. Desta maneira, conclui-se que as fêmeas Flamengas forneceram mais oócitos viáveis por OPU e mais embriões viáveis por PIV ou TE do que fêmeas Holandesas. Além disso, o procedimento de TE apresentou maior eficiência que a OPU/PIV para a produção de embriões, independente da raça. Contudo, ambas as biotécnicas se mostraram eficazes como ferramentas úteis para a conservação genética de animais da raça Flamenga

Os objetivos dos experimentos foram primeiro determinar as taxas de desenvolvimento in vitro de embriões murinos no estágio de 8-células expostos a 15.7 MPa de N2 durante 2 ou 4 horas. Segundo, determinar as taxas de sobrevivência embrionária à crioconservação dos blastocistos originados a partir do cultivo dos embriões de 8-células após a indução do estresse subletal celular com o auxílio da pressão gasosa. Terceiro, determinar a expressão dos genes BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 e PPIA nas seguintes etapas experimentais: no estágio de 8-células imediatamente após a coleta dos embriões; no estágio de blastocisto antes e após o congelamento. Nas seis replicações realizadas foram utilizados 14 machos e 60 fêmeas Mus musculus domesticus. Na primeira etapa dos experimentos, das fêmeas superovuladas, 38 produziram 1092 embriões viáveis no estágio de 8-células que foram, de forma aleatória, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo P1 – os embriões foram expostos a 15.7 MPa de N2 gasoso durante 2 horas e após cultivados in vitro até alcançar o estádio de blastocisto; Grupo P2 – os embriões foram tratados de maneira idêntica aos do Grupo P1, sendo expostos aos 15.7 MPa de N2 gasoso durante 4 horas; Grupo controle CE - os embriões foram submetidos ao cultivo in vitro imediatamente após a coleta; Grupo controle CB: os embriões foram mantidos em temperatura ambiente (22 ºC) durante 4 horas e após colocados na estufa para o cultivo in vitro. Na segunda etapa, amostras dos embriões dos quatro grupos experimentais tiveram a expressão gênica determinada com auxílio da amplificação e determinação quantitativa do mRNA (“Real Time PCR”). Os resultados do desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto na primeira etapa foram os seguintes: Grupo P1 – 96,4% (245/253); Grupo P2 – 94,0% (253/269); Grupo CE – 95,0% (249/262) e Grupo CB – 95,4 (249/261). Na segunda etapa dos experimentos os resultados de reexpansão dos blastocistos após a criopreservação foram: Grupo P1 – 86,3% (63/73); Grupo P2 – 80,0 (76/95); Grupo CE – 72,8 (67/92); Grupo CB – 83,6 (92/110). A análise da expressão da maioria dos genes não revelou diferenças entre os grupos experimentais, provavelmente devido à variação biológica dos embriões entre os grupos e dentro de um mesmo grupo. A exposição dos embriões no estágio de 8-células a 15.7 MPa de N2 gasoso não comprometeu a viabilidade in vitro para desenvolverem-se ao estágio de blastocisto. As taxas de sobrevivência dos blastocistos à criopreservação diferiram somente entre os grupos de embriões expostos à HGP durante 2 horas (P1) no estágio de 8-células (86,3%) e o grupo de embriões submetidos ao cultivo in vitro (CE) (72,8%). Os resultados dos experimentos revelaram que a HGP pode ser empregada na indução de estresse celular subletal em embriões murinos. / The first objective of the experiments was to determine the development rates of mouse embryos exposed to high gaseous pressure (HGP – 15.7 MPa gaseous N2) at 8-cell stage for 2 or 4 hours. Second, determine the blastocyst re-expansion rates after cryopreservation. Third, determine the relative expression of BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 and PPIA in the following experimental steps: immediately after collection of 8-cell stage embryos, at the blastocyst stage before and after freezing. Fourteen males and 60 females Mus musculus domesticus were used in six experiment replications. Thirty-eight (63%) from the 60 superovulated, females produced 1092 viable embryos. These 8-cell stage embryos were then randomly divided into four experimental groups: P1 group – embryos were first exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 2 hours and after cultured in vitro until the blastocyst stage; P2 group - embryos were treated identically to the P1 group, but were exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 4 hours; CE control group - embryos were submitted to in vitro culture immediately after collection; CB control group - embryos were maintained at room temperature (22ºC) for 4 hours and after cultured in vitro. The results of embryo in vitro development to the blastocyst stage were: P1 Group- 96.4% (245/253); P2 group- 94.0% (253/269); CE group- 95.0% (249/262) and CB- 95.4 (249/261). After cryopreservation the blastocyst re-expansion rates were: P1 group- 86.3 % (63/73); P2 group- 80.0 (76/95); CE group – 72.8 (67/92), CB group- 83.6 (92/110). No major differences in gene expression were observed among treatment groups for most genes analyzed in this study, likely due to the biological variability in groups of embryos within each group. Exposure of embryos at 8-cells stage to 15.7 MPa of gaseous N2 did not compromise in vitro embryo viability to reach the blastocyst stage. The survival rates of blastocysts to cryopreservation differ only among the embryos that were exposed to the HGP during 2 hours at 8-cell stage (86,3 %) and the 8-cell stage embryos that were submitted to the in vitro culture immediately after collection (72,8 %). The experimental results showed that HGP can be used to induce sublethal cell stress in murine embryos.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro determinar as taxas de desenvolvimento in vitro de embriões murinos no estágio de 8-células expostos a 15.7 MPa de N2 durante 2 ou 4 horas. Segundo, determinar as taxas de sobrevivência embrionária à crioconservação dos blastocistos originados a partir do cultivo dos embriões de 8-células após a indução do estresse subletal celular com o auxílio da pressão gasosa. Terceiro, determinar a expressão dos genes BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 e PPIA nas seguintes etapas experimentais: no estágio de 8-células imediatamente após a coleta dos embriões; no estágio de blastocisto antes e após o congelamento. Nas seis replicações realizadas foram utilizados 14 machos e 60 fêmeas Mus musculus domesticus. Na primeira etapa dos experimentos, das fêmeas superovuladas, 38 produziram 1092 embriões viáveis no estágio de 8-células que foram, de forma aleatória, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo P1 – os embriões foram expostos a 15.7 MPa de N2 gasoso durante 2 horas e após cultivados in vitro até alcançar o estádio de blastocisto; Grupo P2 – os embriões foram tratados de maneira idêntica aos do Grupo P1, sendo expostos aos 15.7 MPa de N2 gasoso durante 4 horas; Grupo controle CE - os embriões foram submetidos ao cultivo in vitro imediatamente após a coleta; Grupo controle CB: os embriões foram mantidos em temperatura ambiente (22 ºC) durante 4 horas e após colocados na estufa para o cultivo in vitro. Na segunda etapa, amostras dos embriões dos quatro grupos experimentais tiveram a expressão gênica determinada com auxílio da amplificação e determinação quantitativa do mRNA (“Real Time PCR”). Os resultados do desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto na primeira etapa foram os seguintes: Grupo P1 – 96,4% (245/253); Grupo P2 – 94,0% (253/269); Grupo CE – 95,0% (249/262) e Grupo CB – 95,4 (249/261). Na segunda etapa dos experimentos os resultados de reexpansão dos blastocistos após a criopreservação foram: Grupo P1 – 86,3% (63/73); Grupo P2 – 80,0 (76/95); Grupo CE – 72,8 (67/92); Grupo CB – 83,6 (92/110). A análise da expressão da maioria dos genes não revelou diferenças entre os grupos experimentais, provavelmente devido à variação biológica dos embriões entre os grupos e dentro de um mesmo grupo. A exposição dos embriões no estágio de 8-células a 15.7 MPa de N2 gasoso não comprometeu a viabilidade in vitro para desenvolverem-se ao estágio de blastocisto. As taxas de sobrevivência dos blastocistos à criopreservação diferiram somente entre os grupos de embriões expostos à HGP durante 2 horas (P1) no estágio de 8-células (86,3%) e o grupo de embriões submetidos ao cultivo in vitro (CE) (72,8%). Os resultados dos experimentos revelaram que a HGP pode ser empregada na indução de estresse celular subletal em embriões murinos. / The first objective of the experiments was to determine the development rates of mouse embryos exposed to high gaseous pressure (HGP – 15.7 MPa gaseous N2) at 8-cell stage for 2 or 4 hours. Second, determine the blastocyst re-expansion rates after cryopreservation. Third, determine the relative expression of BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 and PPIA in the following experimental steps: immediately after collection of 8-cell stage embryos, at the blastocyst stage before and after freezing. Fourteen males and 60 females Mus musculus domesticus were used in six experiment replications. Thirty-eight (63%) from the 60 superovulated, females produced 1092 viable embryos. These 8-cell stage embryos were then randomly divided into four experimental groups: P1 group – embryos were first exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 2 hours and after cultured in vitro until the blastocyst stage; P2 group - embryos were treated identically to the P1 group, but were exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 4 hours; CE control group - embryos were submitted to in vitro culture immediately after collection; CB control group - embryos were maintained at room temperature (22ºC) for 4 hours and after cultured in vitro. The results of embryo in vitro development to the blastocyst stage were: P1 Group- 96.4% (245/253); P2 group- 94.0% (253/269); CE group- 95.0% (249/262) and CB- 95.4 (249/261). After cryopreservation the blastocyst re-expansion rates were: P1 group- 86.3 % (63/73); P2 group- 80.0 (76/95); CE group – 72.8 (67/92), CB group- 83.6 (92/110). No major differences in gene expression were observed among treatment groups for most genes analyzed in this study, likely due to the biological variability in groups of embryos within each group. Exposure of embryos at 8-cells stage to 15.7 MPa of gaseous N2 did not compromise in vitro embryo viability to reach the blastocyst stage. The survival rates of blastocysts to cryopreservation differ only among the embryos that were exposed to the HGP during 2 hours at 8-cell stage (86,3 %) and the 8-cell stage embryos that were submitted to the in vitro culture immediately after collection (72,8 %). The experimental results showed that HGP can be used to induce sublethal cell stress in murine embryos.

Sistemas de produção in vitro de embriões mamíferos muitas vezes requerem que o cultivo embrionário seja realizado de forma individualizada. Entretanto, os resultados obtidos com o cultivo in vitro (CIV) individual são inconstantes e, por vezes, inferiores ao CIV em grupo. Entre os sistemas que requerem o CIV individual, a técnica de handmade cloning (HMC) se destaca por produzir embriões sem zona pelúcida que não podem ser cultivados agrupados em protocolos convencionais de CIV. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões bovinos clonados pela técnica de HMC e submetidos a três diferentes sistemas de CIV em micropoços (Well of the well – WOW), sendo um industrial, confeccionado em polidimetilsiloxano (PDMS), que visou à padronização da configuração do sistema de CIV. Após 11 replicações, de 3.876 complexos cumuli-oócito bovinos maturados in vitro, 3.437 (88,6%) oócitos apresentaram a extrusão do 1º corpúsculo polar. Após a digestão da zona pelúcida, 2.992 estruturas foram bisseccionadas manualmente, com a produção de 2.288 hemi-citoplastos. Reconstruiram-se 1.011 embriões pela adesão de dois hemi-citoplastos a uma célula somática (célula-tronco mesenquimal bovina de uma fêmea adulta da raça Nelore), dos quais 751 (74,2%) embriões fusionaram após eletrofusão, sendo 715 ativados quimicamente. Os embriões clonados (n=705) foram então alocados aleatoriamente em três grupos experimentais para o CIV: Grupo 1 (G1) – micropoço modificado (WOW-modificado, FELTRIN et al., 2006a); Grupo 2 (G2) – micropoço convencional (WOW-convencional , VATJA et al., 2000); e Grupo 3 (G3) – micropoço – PDMS (WOW-PDMS) . Como grupo controle (FIV, Grupo 4, G4), 594 oócitos foram colocados em maturação, fecundação e cultivo in vitro, em paralelo aos grupos clonados. Os resultados das taxas de clivagem no Dia 2, de blastocisto no Dia 7 e de prenhez no Dia 30 de desenvolvimento foram analisados pelo teste do χ2 com nível de significância de 5%. Não houve diferença significativa quanto à taxa de clivagem nos diferentes grupos. Entretanto, a taxa de blastocisto (BL) no G1 (99/239; 41,4%) foi significativamente superior à observada no G2 (72/232; 31,0%) e no G3 (68/234; 29,1%), sendo estas últimas semelhantes entre si. A taxa de BL do grupo controle (315/594; 53,0%) foi superior aos três grupos experimentais. Finalmente, o desenvolvimento in vivo até o Dia 30 de prenhez não diferiu entre os grupos G1 (7/15; 46,7%), G2 (7/13; 53,9%) e G3 (6/16; 50,0%). O sistema em micropoço modificado promoveu melhores condições de CIV a embriões clonados por HMC, traduzido por maiores taxas de BL, não se refletindo, entretanto, em diferenças no desenvolvimento in vivo subseqüente à transferência para fêmeas receptoras. / In vitro production systems for mammalian embryos quite often require embryos to be cultured individually. However, results obtained after individual embryo in vitro culture (IVC) are frequently inconsistent and inferior to IVC in groups. The Handmade Cloning (HMC) procedure is among the systems that require individual IVC, since zona-free embryos cannot be grouped for culture by standard IVC protocols. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo development of bovine embryos cloned by HMC, after the IVC in three distinct microwell arrangements, including an industrial chip, manufactured in polydimethylsiloxane (PDMS), which aimed to standardize the pattern of the IVC system. After 11 replications, 3,437 (88.6%) oocytes were selected based on the extrusion of the first polar body, out of 3,876 in vitro-matured bovine cumuli-oocyte complexes. Following zona pellucida digestion, 2,992 structures were manually bisected, generating 2,288 hemi-cytoplasts. A total of 1,011 embryos were reconstructed by the adhesion of two hemi-cytoplasts to a somatic cell (bovine mesenchymal stem cells from an adult Nelore female), with 751 fusing (74.2%) following electrofusion, and 715 being chemically activated. Cloned embryos (n=705) were then randomly allocated to one of three IVC experimental groups: Group 1 (G1) – modified microwells (FELTRIN et al., 2006a); Group 2 (G2) – conventional microwells (VATJA et al., 2000); and Group 3 (G3) – microwells in PDMS. As control group (IVF, Group 4, G4), 594 oocytes were in vitro-matured, fertilized and cultured in parallel to the cloned groups. Cleavage, blastocyst and pregnancy rates evaluated on Days 2, 7 and 30 of development were analyzed by the χ2 test, for a significance level of 5%. No differences in cleavage rates were observed between groups. However, blastocyst rates in G1 (99/239; 41.4%) were significantly higher than in G2 (72/232; 31.0%) and in G3 (68/234; 29.1%), which did not differ between one another. Blastocyst rates in the IVF control group (315/594; 53.0%) were in turn higher than in all cloned experimental groups. Finally, in vivo development to Day 30 of pregnancy was not different between G1 (7/15; 46.7%), G2 (7/13; 53.9%) and G3 (6/16; 50.0%). In summary, the modified microwell system promoted superior development to the blastocyst stage than both the conventional and the DMPS-based microwell systems, with no impact on the subsequent in vivo development after transfer to female recipients.

Sistemas de produção in vitro de embriões mamíferos muitas vezes requerem que o cultivo embrionário seja realizado de forma individualizada. Entretanto, os resultados obtidos com o cultivo in vitro (CIV) individual são inconstantes e, por vezes, inferiores ao CIV em grupo. Entre os sistemas que requerem o CIV individual, a técnica de handmade cloning (HMC) se destaca por produzir embriões sem zona pelúcida que não podem ser cultivados agrupados em protocolos convencionais de CIV. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões bovinos clonados pela técnica de HMC e submetidos a três diferentes sistemas de CIV em micropoços (Well of the well – WOW), sendo um industrial, confeccionado em polidimetilsiloxano (PDMS), que visou à padronização da configuração do sistema de CIV. Após 11 replicações, de 3.876 complexos cumuli-oócito bovinos maturados in vitro, 3.437 (88,6%) oócitos apresentaram a extrusão do 1º corpúsculo polar. Após a digestão da zona pelúcida, 2.992 estruturas foram bisseccionadas manualmente, com a produção de 2.288 hemi-citoplastos. Reconstruiram-se 1.011 embriões pela adesão de dois hemi-citoplastos a uma célula somática (célula-tronco mesenquimal bovina de uma fêmea adulta da raça Nelore), dos quais 751 (74,2%) embriões fusionaram após eletrofusão, sendo 715 ativados quimicamente. Os embriões clonados (n=705) foram então alocados aleatoriamente em três grupos experimentais para o CIV: Grupo 1 (G1) – micropoço modificado (WOW-modificado, FELTRIN et al., 2006a); Grupo 2 (G2) – micropoço convencional (WOW-convencional , VATJA et al., 2000); e Grupo 3 (G3) – micropoço – PDMS (WOW-PDMS) . Como grupo controle (FIV, Grupo 4, G4), 594 oócitos foram colocados em maturação, fecundação e cultivo in vitro, em paralelo aos grupos clonados. Os resultados das taxas de clivagem no Dia 2, de blastocisto no Dia 7 e de prenhez no Dia 30 de desenvolvimento foram analisados pelo teste do χ2 com nível de significância de 5%. Não houve diferença significativa quanto à taxa de clivagem nos diferentes grupos. Entretanto, a taxa de blastocisto (BL) no G1 (99/239; 41,4%) foi significativamente superior à observada no G2 (72/232; 31,0%) e no G3 (68/234; 29,1%), sendo estas últimas semelhantes entre si. A taxa de BL do grupo controle (315/594; 53,0%) foi superior aos três grupos experimentais. Finalmente, o desenvolvimento in vivo até o Dia 30 de prenhez não diferiu entre os grupos G1 (7/15; 46,7%), G2 (7/13; 53,9%) e G3 (6/16; 50,0%). O sistema em micropoço modificado promoveu melhores condições de CIV a embriões clonados por HMC, traduzido por maiores taxas de BL, não se refletindo, entretanto, em diferenças no desenvolvimento in vivo subseqüente à transferência para fêmeas receptoras. / In vitro production systems for mammalian embryos quite often require embryos to be cultured individually. However, results obtained after individual embryo in vitro culture (IVC) are frequently inconsistent and inferior to IVC in groups. The Handmade Cloning (HMC) procedure is among the systems that require individual IVC, since zona-free embryos cannot be grouped for culture by standard IVC protocols. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo development of bovine embryos cloned by HMC, after the IVC in three distinct microwell arrangements, including an industrial chip, manufactured in polydimethylsiloxane (PDMS), which aimed to standardize the pattern of the IVC system. After 11 replications, 3,437 (88.6%) oocytes were selected based on the extrusion of the first polar body, out of 3,876 in vitro-matured bovine cumuli-oocyte complexes. Following zona pellucida digestion, 2,992 structures were manually bisected, generating 2,288 hemi-cytoplasts. A total of 1,011 embryos were reconstructed by the adhesion of two hemi-cytoplasts to a somatic cell (bovine mesenchymal stem cells from an adult Nelore female), with 751 fusing (74.2%) following electrofusion, and 715 being chemically activated. Cloned embryos (n=705) were then randomly allocated to one of three IVC experimental groups: Group 1 (G1) – modified microwells (FELTRIN et al., 2006a); Group 2 (G2) – conventional microwells (VATJA et al., 2000); and Group 3 (G3) – microwells in PDMS. As control group (IVF, Group 4, G4), 594 oocytes were in vitro-matured, fertilized and cultured in parallel to the cloned groups. Cleavage, blastocyst and pregnancy rates evaluated on Days 2, 7 and 30 of development were analyzed by the χ2 test, for a significance level of 5%. No differences in cleavage rates were observed between groups. However, blastocyst rates in G1 (99/239; 41.4%) were significantly higher than in G2 (72/232; 31.0%) and in G3 (68/234; 29.1%), which did not differ between one another. Blastocyst rates in the IVF control group (315/594; 53.0%) were in turn higher than in all cloned experimental groups. Finally, in vivo development to Day 30 of pregnancy was not different between G1 (7/15; 46.7%), G2 (7/13; 53.9%) and G3 (6/16; 50.0%). In summary, the modified microwell system promoted superior development to the blastocyst stage than both the conventional and the DMPS-based microwell systems, with no impact on the subsequent in vivo development after transfer to female recipients.