Adipositas und Typ-2-Diabetes sind häufige Erkrankungen des Stoffwechsels. Zur Basistherapie der Adipositas und des Typ-2-Diabetes gehören eine gesunde Ernährungs- weise und die Erhöhung der körperlichen Aktivität unter anderem mit dem Ziel der Gewichtsreduktion. Vermehrte Bewegung führt neben der Verbesserung der körperlichen Leistungsfähigkeit zur Fettmassenreduktion, Verbesserungen der Hyperglykämie, Lipo- proteinstoffwechsels und des Adipokinprofils. Bone morphogenetic proteins (BMPs) werden im Fettgewebe produziert und spielen eine wichtige Rolle in der Adipogenese und Transdifferenzierung von Adipozyten. Während ein Zusammenhang zwischen der BMP-7-Serumkonzentration und Adipositas vor kurzem belegt wurde, ist bisher nicht bekannt, ob weitere BMPs wie BMP-2 und -4 mit Adipositas und Typ-2-Diabetes assoziiert sind. Ziel dieser Arbeit war es deshalb zu untersuchen, ob die BMP-2 und -4 Serumkonzentrationen im Zusammenhang mit Körpergewicht, Fett- verteilung und Parametern des Glukosestoffwechsels bei Patienten mit Adipositas und Typ-2-Diabetes (n=213) stehen. Im Rahmen von drei Interventionsstudien wurde der Einfluss einer hypokalorischen Ernährungsweise über sechs Monate (n=19), eines 45,3 ± 7,4 kg Gewichtsverlustes ein Jahr nach bariatrischer Chirurgie (n=32) sowie eines zwölf- wöchigen Trainingsprogramms (n=60) auf die BMP-2- und -4-Serumkonzentrationen untersucht. Zusätzlich wurde die BMP-2-und -4-mRNA-Expression in humanen omentalen und subkutanen Fettgewebsproben von 161 Patienten charakterisiert. Die BMP-2- und -4-Serumkonzentrationen und die BMP-2- und -4-mRNA-Expression im viszeralen Fettgewebe korrelieren signifikant mit dem BMI und dem Körperfettgehalt. Zirkulierende BMP-4-Spiegel sind geschlechtsabhängig und bei Patienten mit T2D signifikant niedriger als bei gesunden Kontrollpatienten. Sowohl eine moderate Gewichts- reduktion durch kalorienreduzierte Ernährung als auch ein Gewichtsverlust von 45,3 ± 7,4 kg nach bariatrischer Chirurgie führen zu einer signifikanten Reduktion der zirkulierenden BMP-2- und -4-Spiegel. Das zwölfwöchige Trainingsprogramm führte lediglich zu einer signifikanten Reduktion der BMP-2-Serumkonzentration und zu signifikanten Ver- besserung der Leistungsfähigkeit, von Parametern des Glukosestoffwechsels und der Serumkonzentrationen von Adiponektin und Interleukin-6. Zusammengefasst zeigen die Daten, dass erhöhte Serumkonzentrationen von BMP-2 und 4 mit Adipositas assoziiert sind und durch Gewichtsreduktion und Erhöhung der körperlichen Aktivität verringert werden können. Die BMP-2- und -4-mRNA-Expression im viszeralen Fettgewebe kann zu erhöhten Serumkonzentrationen dieser Adipokine bei viszeraler Fettverteilung beitragen.

Introduction: Idiopathic Pulmonary arteriole hypertension (IPAH) is a rare but severely debilitating disease that strikes women to men at a ratio of 3:1. Endothelial cell (EC) dysfunction is a hallmark of the disease. This includes rapid growth of the ECs until the occlusion of the vasculature as well as decreased blood levels of vasodilators. Markedly increased levels of endothelin-1, a potent vasoconstrictor and smooth muscle mitogen, have been noted in IPAH patients. / Recently mutations in the bone morphogenic protein receptor type II (BMPRII) have been linked to the disease. Interestingly mutations in activin-like kinase-1 (ALK-1) and endoglin have been linked to hereditary haemorrhagic telangiectasia (HHT), a disease that results in PAH clinically indistinguishable from IPAH. All of these proteins are either receptors or co-receptors to members of the TGFbeta superfamily. The connection of these mutations to the disease still remains largely a mystery to researchers and the effects of either bone morphogenic proteins 2, 4, 7 or TGFbeta levels on endothelin-1(ET-1) production in human microvascular endothelial cells cultured from normal lungs (HMVEC-LBI) are unknown. / Methods: HMVEC-LBI cells were cultured in the presence of various concentrations of BMP 2,4,7 and TGFbeta, in complete media or serum starved conditions. After allotted time points the media was collected and assayed by ELISA, meanwhile the cells were lysed and protein content assayed for normalization purposes. Small Mothers against Decapentaplegic (SMAD) 1/5 phosphorylation was also measured. / Results and Conclusions: Despite evidence that all BMPs used were biologically active, namely through SMAD phosphorylation studies, only BMP7 at very high dosages increased ET-1 production levels. TGFbeta had a more pronounced effect at earlier time points with lower concentrations. The results provide insights on the effects of an important group of proteins, the BMPs and TGFbeta, on lung microvascular ECs and which are likely the key cellular player In IPAH development. These findings may have clinical relevance in terms of control of the disease and understanding the normal response of these cells BMPs and TGFbeta.

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Doctor of Philosophy / Department of Biology / Alexander E. Beeser / Multiple signaling pathways regulate development of the posterior zebrafish body, which is derived from a population of progenitor cells called the tailbud, a structure formed at the end of gastrulation. Fate specification and differentiation are closely linked with cell migration to ensure that, as some cells exit the tailbud and differentiate, other cells are retained in the tailbud as undifferentiated precursors to support later growth. The role of BMP signaling in specifying cell fate in the tailbud has been well-characterized. Among the lost ventral tissues like ventral tailfin and cloaca, embryos with compromised BMP signaling produce a curious phenotype-a ventrally located secondary tail containing both somitic muscle and notochord. This phenotype is proposed to be a fate-patterning defect when the BMP gradient lowered to a precise level. However, this morphogen mode is insufficient to explain secondary tail formation without considering BMP also regulates morphogenetic movements during gastrulation, promoting the convergence of lateral mesodermal cells towards the dorsal axis. In this study, we provide evidence that BMP signaling continues to mediate cell movements during tail development. Our data indicate that BMP signaling is activated in the ventroposterior tailbud to promote cell migration during tailbud protrusion, and that it is the defective migration of these cells which ultimately leads to bifurcation of the CNH domain, a presumptive stem cell pool in the tailbud, and formation of a secondary tail in BMP mutants. In parallel, the morphogenesis of tailbud cells is known to be under the control of noncanonical Wnt signaling, although the exact nature of the defect remains unclear. We find that inhibition of noncanonical Wnt signaling also leads to secondary tail formation. Additionally, we show that noncanonical Wnt signaling interacts with BMP signaling to maintain CNH integrity by affecting cadherin localization in CNH cells, possibly disrupting cell cohesion. We propose a model that BMP and a noncanonical Wnt pathway regulate tail morphogenesis by controlling cell migration and cell adhesion within the tailbud.

Because of its high specific strength, durability, and biocompatibility, titanium is a widely used material for orthopedic implants. However, its insufficient binding with the surrounding bone tissue regularly leads to stress shielding, bone resorption and implant loosening. A promising solution to improve adhesion is to modify the implant surface chemistry and topography by coating it with a protein-eluting polyelectrolyte complex. Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), a potent osteoconductive growth factor, was adsorbed onto the surface of anodized titanium, and polyelectrolyte multilayer (PEM) coatings prepared from solutions of poly-L-histidine (PLH) and poly(methacrylic acid) (PMAA) were built on top of the BMP-2. The effect of solution pH during the deposition process was investigated. High levels of BMP-2 released over several months were achieved. Approximately 2 μg/cm² of BMP-2 were initially adsorbed on the anodized titanium and a pH-dependent release behavior was observed, with more stable coatings assembled at pH = 6-7. Three different diffusion regimes could be determined from the release profiles: an initial burst release, a sustained release regime and a depletion regime. Mass adsorption monitoring using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) showed that PLH was adsorbed in greater quantities than PMAA, and that more mass was adsorbed per bilayer as the number of bilayers grew. Moreover, the pH of the water used during the rinsing step significantly impacted the composition of the multilayer. Atomic force microscopy (AFM) and contact angle analysis (CAA) were used to determine the topography and surface energy of the PEMs. No visible change was observed in surface morphology as the assembly pH was varied, whereas the surface energy decreased for samples prepared at more basic pH. These variations indicate that the influence of the initial BMP-2 layer can be felt throughout the PEM and impact its surface structure.

Einleitung Fokale Gelenkknorpeldefekte treten in der Deutschen Bevölkerung mit einer geschätzten Inzidenz von über 300 000 jährlichen Fällen auf. In der US-amerikanischen Bevölkerung wird jährlich von über 600 000 Fällen ausgegangen. Aufgrund der Insuffizienz körpereigener Heilungskapazitäten und verfügbarer Therapieverfahren, schreitet die Erkrankung regelhaft zur post-traumatischen Arthrose fort. Neben der individuellen Lebensqualitätseinschränkung besteht eine sozioökonomische Bedeutung mit geschätzten Krankheitskosten von jährlich über 10 Milliarden US Dollar in den Vereinigten Staaten. Das Versagen zellbasierter Therapieverfahren beruht unter anderem auf einer Insuffizienz der chondrogenen Differenzierung, sowie der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten mit nachfolgender Osteogenese analog den Vorgängen in der Wachstumsfuge. Für die Induktion der chondrogenen Differenzierung stehen insbesondere Mitglieder der TGF-β Superfamilie, wie BMP-2, zur Verfügung. Diese sind jedoch ebenso durch eine Induktion der hypertrophen Differenzierung gekennzeichnet. Zur Induktion der Chondrogenese unter Umgehung der TGF-β-Signalwege wurde IHH in-vitro als vielversprechend beschrieben. Bislang besteht jedoch kein Nachweis der in-vivo Effektivität von IHH zur Knorpelreparation. Die Schaffung eines Wachstumsfaktor-Milieus in der Gelenkknorpelläsion in-vivo stellt ebenso eine Herausforderung dar. Diesbezüglich wurde ein vereinfachtes Verfahren zum lokalisierten in-vivo Gentransfer mittels adenoviraler Vektoren und autologen Knochenmarkskoagulaten anhand von Markergenen beschrieben. Die Effektivität jenes Verfahrens zur in-vivo Knorpelreparation wurde noch nicht gezeigt. Zweck dieses kontrollierten in-vivo Experimentes ist es, mittels des oben genannten Gentransferverfahrens die Wirksamkeit von BMP-2 und IHH zur Reparation von osteochondralen Defekten in New Zealand White Rabbits nachzuweisen. Die zentrale Hypothese lautete, dass BMP2 beziehungsweise IHH Gentransfer in einer höheren langzeit-histologischen Qualität des Reparationsgewebes resultiert. Explorativ sollten dabei Unterschiede in den einzelnen Dimensionen der Gewebequalität anhand des ICRS-II Histology Scoring Systems, sowie der Grad der Typ I (als Faserknorpelmarker), Typ II (als Marker hyalinen Gelenkknorpels) und Typ X Kollagen Deposition (als Marker hypertropher Chondrozyten) beschrieben werden. Material und Methoden Als Tiermodel wurden bilaterale 3,2 mm durchmessende osteochondrale Bohrlochdefekte in der Trochlea von New Zealand White Rabbits verwendet (n=10 unabhängige Tiere, 20 Gelenke). Die Defekte wurden mit autologen Knochenmarkkoageln gefüllt, die nach vorheriger Beckenkammaspiration gewonnen wurden. In den experimentellen Gruppen wurden die Knochenmarkkoagel beladen mit jeweils 1 x 1011 infektiösen Partikeln adenoviraler Vektoren, die cDNA codierend für BMP2 (n=3 Tiere, entsprechend 6 Gelenken) oder IHH (n=4; 8) enthielten. In der Kontrollgruppe wurde das nicht-chondrogene Markergen GFP (n=3; 6) transferiert. Beide Gelenke eines Tieres wurden der gleichen Gruppe zugeordnet. Die histologische Gewebequalität wurde nach 13 Wochen anhand des ICRS-II Scoringsystems durch 3 unabhängige, verblindete Untersucher bewertet. Als primäre Outcomes wurden der ICRS-II Parameter „Generelles Assessment“, sowie die Typ II Kollagen positive Fläche designiert. Als explorative Outcomes wurden die verbleibenden ICRS-II Parameter, sowie die Typ I und Typ X Kollagen Deposition bewertet. Die Korrelation zwischen den Untersuchern wurde nach Pearson ermittelt. Zum Test auf Signifikanz der Gruppenunterschiede wurde ein lineares gemischtes Modell verwendet, welches einer mögliche Abhängigkeit beider Gelenke eines Tieres Rechnung trägt. Ergebnisse Qualitative Bewertung des Reparationsknorpels. Dreizehn Wochen nach der Intervention zeigten die meisten der BMP-2 behandelten Gelenke (4 von 6) und alle der IHH behandelten Gelenke (8 von 8) hyalin-artigen Reparationsknorpel, während alle GFP behandelten Kontrollgelenke (6 von 6) faserknorpel-artiges Reparationsgewebe zeigten. Zwei BMP-2 behandelten Gelenke zeigten eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation. Primäre Outcomes - ICRS-II „Generelles Assessment“ und Typ II Kollagen positive Fläche. IHH und BMP-2 behandelte Gelenke zeigten im Vergleich zu GFP höhere Punktzahlen in dem ICRS-II „Generelles Assessment“ Parameter: +33.0 (95% Konfidenzintervall: -0.4, +66.4) Punkte für IHH und +8.5 (-26.6, +43.7) Punkte für BMP-2. Beide Effekte erreichten nicht das Level statistischer Signifikanz (p=0.052 und 0.537). IHH erhöhte die Typ II Kollagen Deposition in der Defektregion, während BMP-2 Gelenke keinen Unterschied zu GFP Kontrollen zeigten: +18.7 (-4.5, +42.0) Punkte für IHH und +0.0 (-29.7, +29.8) Punkte für BMP-2. Die erhöhte Typ II Kollagendeposition erreichte nicht das konventionelle Level statistischer Signifikanz (p=0.093). Sekundäre Outcomes - ICRS-II Parameter. In dem Vergleich von BMP-2 mit GFP Kontrollen wurde in keinem der 12 untersuchten Parameter ein signifikanter Unterschied festgestellt. IHH Gentransfer resultierte hingegen in höheren Punktzahlen in allen untersuchten Parametern, wobei der Unterschied in 5 der 12 Parameter das Niveau statistischer Signifikanz erreichte. Ein um 21.5 Punkte (+3.6, +39.4) erhöhter Score wurde für den Parameter „Gewebemorphologie“ beobachtet, sowie +21.0 (+6.4, +35.7) für „Chondrozytäres Clustering“, +31.2 (+0.8, +61.5) für „Formation der Tidemark“, +17.3 (+0.2, +34.5) für „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und +35.0 (+4.6, +65.2) für das „Assessment der mittleren und tiefen Zone“. Sekundäre Outcomes - Marker chondrozytärer Hypertrophie. Eine perizelluläre Deposition von Typ X Kollagen wurde in allen Gruppen beobachtet. Eine deutlich gesteigerte Deposition wurde nur in den Gelenken beobachtet, die nach BMP2 Gentransfer eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation zeigten. Diskussion Das hier beschriebene Experiment stellt die erste Veröffentlichung der Wirksamkeit von IHH zur Verbesserung der histologischen Knorpelqualität von in-vivo therapierten Gelenkknorpeldefekten dar [175]. Die Hypothese, dass IHH zu einer verbesserten histologischen Knorpelqualität führt wurde bestätigt, während die Hypothese zu den positiven Effekten von BMP-2 wiederlegt wurde. IHH führte zu besseren Ergebnissen in allen Untersuchten Parametern, das Niveau statistischer Signifikanz wurde dabei in den Parametern „Gewebemorphologie“, „Chondrozytäres Clustering“, „Formation der Tidemark“, „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und „Assessment der mittleren und tiefen Zone“ erreicht. Das primäre Ziel dieses Experimentes war es, den „Proof of concept“ zu liefern, dass IHH auch in-vivo ein attraktiver Faktor für die Induktion der Chondrogenese darstellt. Das langfristige Ziel ist die Induktion der Chondrogenese unter Umgehung des TGF-β Signalweges zu erzielen, um eine folgende hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten und die folgende Ossifikation des reparierten Defektes zu verhindern. Die Limitationen der Studie umfassen die ausschließlich histologische und immunhistochemische durchgeführte Bewertung der Knorpelqualität und eine eingeschränkte statistische Power. Ob IHH es vermag die hypertrophe Differenzierung zu umgehen und somit eine langfristige hyaline Knorpelreparation zu ermöglichen, ist in weiteren präklinischen Studien mit biochemischer und molekulargenetischer Analyse der Hypertrophie-Marker zu untersuchen. In Bezug auf den klinischen Einsatz zur Knorpelreparation erscheint der Einsatz der Wachstumsfaktoren als Protein auf funktionalisierten Matrices vielversprechend. BMP-2 wird aufgrund der hier beobachteten intraläsionalen Knochenformation nach BMP2 Gentransfer als nicht geeignet zur Unterstützung der Knorpelreparation in-vivo bewertet. / Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2, encoded by BMP2) and Indian hedgehog protein (IHH, encoded by IHH) are well known regulators of chondrogenesis and chondrogenic hypertrophy. Despite being a potent chondrogenic factor BMP-2 was observed to induce chondrocyte hypertrophy in osteoarthritis (OA), growth plate cartilage and adult mesenchymal stem cells (MSCs). IHH might induce chondrogenic differentiation through different intracellular signalling pathways without inducing subsequent chondrocyte hypertrophy. The primary objective of this study is to test the efficacy of direct BMP2 and IHH gene delivery via bone marrow coagulates to influence histological repair cartilage quality in vivo. Vector-laden autologous bone marrow coagulates with 10^11 adenoviral vector particles encoding BMP2, IHH or the Green fluorescent protein (GFP) were delivered to 3.2 mm osteochondral defects in the trochlea of rabbit knees. After 13 weeks the histological repair cartilage quality was assessed using the International Cartilage Repair Society (ICRS) II scoring system and the type II collagen positive area. IHH treatment resulted in superior histological repair cartilage quality than GFP controls in all of the assessed parameters (with P < 0.05 in five of 14 assessed parameters). Results of BMP2 treatment varied substantially, including severe intralesional bone formation in two of six joints after 13 weeks. In conclusion, IHH gene transfer is effective to improve repair cartilage quality in vivo, whereas BMP2 treatment, carried the risk intralesional bone formation. Therefore IHH protein can be considered as an attractive alternative candidate growth factor for further preclinical research and development towards improved treatments for articular cartilage defects.

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名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 博士(医学)(課程) 学位授与年月日:平成6年3月25日 服部宇氏の博士論文として提出された

Adipositas gehört zu den häufigsten Stoffwechselkrankheiten. Zur Basistherapie der Adipositas gehören eine gesunde Ernährungsweise und die Erhöhung der körperlichen Aktivität mit dem Ziel der Gewichtsreduktion. Körperliches Training führt neben der Verbesserung der Leistungsfähigkeit zu einer Reihe metabolischer Veränderungen, wie zur Reduktion der Fettmasse, zu Verbesserungen von chronischer Hyperglykämie, des Lipidstoffwechsels und des atherogenen, pro-inflammatorischen Adipokin-Serumprofils. Bone morphogenetic proteins (BMPs) werden auch im Fettgewebe produziert und spielen eine wichtige Rolle in der Adipogenese und Transdifferenzierung von Adipozyten. Vor kurzem wurde ein Zusammenhang zwischen der BMP-7 Serumkonzentration und Adipositas postuliert. Allerdings ist bisher nicht bekannt, ob eine Gewichtsreduktion mit Veränderungen der BMP-7 Serumkonzentration assoziiert ist. Ziel dieser Arbeit war es deshalb zu untersuchen, ob die Serumkonzentration von BMP-7 im Zusammenhang mit Körpergewicht, Fettverteilungsmuster, Parametern des Glukosestoffwechsels und der Insulinsensitivität bei Patienten mit Adipositas und Typ 2 Diabetes (n=213) stehen. Im Rahmen von zwei Interventionsstudien mit dem Ziel der Gewichtsreduktion wurde der Einfluss einer hypokalorischen Ernährungsweise mit zusätzlichem körperlichen Training über 6 Monate (n=19) sowie 6 Monaten nach einer bariatrischen Operation (n=14) auf die BMP-7 Serumkonzentration untersucht. Zusätzlich wurde die BMP-7-mRNA Expression im humanen omentalen und subkutanen Fettgewebe von 233 Patienten im Rahmen einer unabhängigen Querschnittstudie charakterisiert. Die BMP-7 Serumkonzentration ist unabhängig von Alter und Geschlecht, korreliert signifikant mit den nüchtern Insulin, C-Peptid und Glukose Serumkonzentrationen, mit der SFRP5-Konzentration bei Probanden ohne Typ2 Diabetes mellitus, signifikant negativ mit den Serumkonzentrationen von Gesamteiweiß, Chemerin, freien Fettsäuren (bei Männern), und DLK-1 (bei Frauen). Bei Patienten mit Typ 2 Diabetes zeigte sich eine negative Korrelation zwischen der BMP-7-Serumkonzentration und ALAT. Die BMP-7 mRNA Expression ist im viszeralen Fettgewebe signifikant höher als im subkutanen Fettgewebe. Sowohl eine moderate Gewichtsreduktion von 8,8±6,5kg [2,0-26,6kg] durch kalorienreduzierte Ernährung als auch ein Gewichtsverlust von 45,3±7,4kg 6 Monate nach bariatrischer Chirurgie führten nicht zu einer signifikanten Veränderung der zirkulierenden BMP-7 Spiegel. Zusammengefasst zeigten die Querschnitts- und Interventionsstudien, dass erhöhte BMP-7- Serumkonzentrationen mit Hyperinsulinämie assoziiert sind, aber durch Gewichtsreduktion und Erhöhung der körperlichen Aktivität nicht signifikant beeinflusst werden können. Die erhöhte BMP-7-Expression im viszeralen Fettgewebe könnte eine intrinsische Besonderheit dieses Fettdepots sein und zur viszeralen Fehlverteilung des Fettgewebes bei Adipositas beitragen.

Dissertation (Ph.D.).--University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at San Antonio, 2007. / Vita. Includes bibliographical references.