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Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-27T13:21:42Z No. of bitstreams: 1 Ana Tereza Barufi Franco.pdf: 4866107 bytes, checksum: ed3e675a1fc6ca76bcd7853ae5fb75d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T13:21:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Tereza Barufi Franco.pdf: 4866107 bytes, checksum: ed3e675a1fc6ca76bcd7853ae5fb75d2 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / The Bothropoides and Bothrops gender are responsible for the largest number of snakebites in Brazil, presenting serious systemic effects that induce pathophysiological alterations characterized by local reactions such as edema , myonecrosis, pain and hemohrrage. The antivenom is used to neutralize the greatest possible amount of circulating venom, minimizing its systemic effects. But its action does not extend to local manifestations. The low level laser therapy is an alternative treatment in situations of local lesions due to its biological effects, and is considered a biostimulate resource to the tissues . The aim of this study was to analyze the effect of low power laser -red wavelength of 660 nm, and the infrared laser- wavelength 780 nm, in endothelial cells submitted to injury by Bothropoides jararaca venom. The results showed that the snake venom affected the integrity of endothelial, in all concentrations (1, 5, 10, 12,5, 25 and 50 µg/mL); and affected the viability of endothelial cell in 10 µg/ mL at all time periods analyzed . To evaluate the protective effect of the laser, the dose of 4 J/cm2 reduced the detachment of endothelial cells by improving cellular integrity . This effect was observed in a wavelength of 660 nm at 60 and 120 minutes. The same effect was not observed with the wavelength of 780 nm. So, the present study allowed us to better understand the pathophysiological effects of Bothropoides venom, and contributed to a better understanding of the effects of low power laser and eventually facilitate therapeutic measures more efficient and / or complementary. / As serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são as responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos no Brasil, apresentando efeitos sistêmicos graves, além de induzirem um quadro fisiopatológico caracterizado por reações locais como edema, mionecrose, dor e hemorragia. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende as manifestações locais. A laserterapia de baixa potência é uma alternativa de tratamento em situações de lesão local, devido a seus efeitos biológicos, sendo considerado um recurso bioestimulante em tecidos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do laser de baixa potência vermelho- comprimento de onda de 660 nm; e o laser infravermelho- comprimento de onda 780 nm, em monocamada de células endoteliais submetidos à lesão por veneno de Bothropoides jararaca. Os resultados obtidos mostraram que o veneno, afetou a integridade das monocamadas de células endoteliais em todas as concentrações analisada (5, 10, 12,5, 25 e 50L/mL) em todos os períodos de tempo analisados. Para avaliação do efeito protetor do laser, a dose usada de 4 J/cm2 reduziu o descolamento de células endoteliais melhorando assim a integridade celular. Esse efeito foi observado nos comprimentos de onda de 660 nm nos tempos de 60 e 120 min, o mesmo efeito não foi observado com o comprimento de onda 780 nm. Desta forma, este estudo permitiu entender melhor os efeitos fisiopatológicos do envenenamento botrópico, bem como contribuiu para a melhor compreensão dos efeitos do laser de baixa potência e, eventualmente, favorecer medidas terapêuticas mais eficientes e/ou complementares.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Bothropoides erythromelas à responsÃvel por muitos acidentes no Nordeste do Brasil. O veneno desta serpente induz insuficiÃncia renal aguda. Rins isolados de ratos Wistar, pesando 250 a 300g, foram perfundidos durante 120 min com soluÃÃo Krebs-Henseleit contendo 6g% de albumina bovina. O veneno total de Bothropoides erythromelas foi estudado anteriormente (SOUSA, 2004) e utilizado neste estudo para posterior comparaÃÃo com os grupos tratados com as fraÃÃes PLA2 Lys 49 e Asp 49 do veneno. O veneno total (10mg/mL) e as fraÃÃes PLA2 Lys 49 e Asp 49 (5mg/mL) de B. erythromelas foram adicionados ao sistema 30 min apÃs o inÃcio de cada experimento. Os parÃmetros estudados incluÃram pressÃo de perfusÃo (PP), resistÃncia vascular renal (RVR), ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG), fluxo urinÃrio (FU), percentual de transporte tubular de sÃdio, potÃssio e cloreto (%TNa+, %TK+ e %TCl-), percentual de transporte proximal de sÃdio, potÃssio e cloreto (%pTNa+, %pTK+ e %pTCl-), excreÃÃo de sÃdio, potÃssio e cloreto (ENa+, EK+ e ECl-) e clearance osmÃtico (Cosm) (p< 0,05*). O grupo controle perfundido com albumina foi funcionalmente estÃvel por todos os 120 min. A infusÃo do veneno causou um aumento significante no FU, ENa+, ECl- e Cosm e uma diminuiÃÃo na PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ e %pTCl-. O RFG e a EK+ diminuÃram aos 60 min e aumentaram aos 90 e 120 min quando comparado com o grupo controle. A infusÃo de Lys 49 causou um aumento significante na PP, FU, ENa+, EK+ e Cosm e diminuiu o RFG e o %TNa+ quando comparada com o grupo controle. Lys 49 nÃo modificou os outros parÃmetros funcionais renais. A infusÃo de Asp 49 modificou apenas os parÃmetros funcionais renais %pTK+ (diminuiÃÃo) e EK+ (aumento) quando comparada ao grupo controle. Lys 49 apresentou um efeito similar ao veneno total nos parÃmetros FU, %TNa+, ENa+, EK+ e Cosm e Asp 49 nos parÃmetros %pTK+ e EK+. A anÃlise histolÃgica mostrou uma quantidade moderada de material proteinÃceo nos glomÃrulos e tÃbulos de rins perfundidos com o veneno, Lys 49 e Asp 49, bem como regiÃes focais de apoptose/necrose em rins perfundidos com Lys 49 e Asp 49. CÃlulas MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% vv de soro bovino fetal e entÃo avaliadas na presenÃa do veneno total, Lys 49 e Asp 49 de B. erythromelas nas concentraÃÃes (100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125mg/mL). A anÃlise dos efeitos citotÃxicos em cÃlulas MDCK foi executada pelo mÃtodo MTT. O veneno promoveu efeito citotÃxico nas concentraÃÃes de 50 e 100mg/mL (IC50 =93,31mg/mL). Lys 49 promoveu efeito citotÃxico nas concentraÃÃes de 6,25; 12,5; 25; 50 e 100mg/mL (IC50 = 38,29mg/mL). Asp 49 promoveu efeito citotÃxico nas concentraÃÃes de 50 e 100mg/mL (IC50 = 158mg/mL). TambÃm foram mensurados os nÃveis de lactato desidrogenase (LDH) e nenhum aumento significante foi observado com veneno total e Asp 49. Lys 49 promoveu um aumento significante nos nÃveis de lactato desidrogenase apenas na concentraÃÃo de 100mg/mL. ApÃs o cultivo de cÃlulas MDCK com o veneno total, nas concentraÃÃes de 46,65 e 23,32mg/mL, foi realizada a reaÃÃo de polimerase em cadeia em tempo real para a avaliaÃÃo da expressÃo de genes prà (Caspase-3, Caspase-8 e Bax) e antiapoptÃticos (Bcl-XL e Mcl-1). NÃo foi realizada avaliaÃÃo da expressÃo de genes prà e antiapoptÃticos com Lys 49 e Asp 49. Na expressÃo de genes prÃ-apoptÃticos o veneno total promoveu um aumento da expressÃo de caspase-3 na concentraÃÃo de 23,32Âg/mL e de caspase-8 nas concentraÃÃes de 46,65 e 23,32Âg/mL, quando comparado com os controles positivo (DOXO) e negativo (PBS) e diminuiu a expressÃo de Bax em ambas as concentraÃÃes. Na expressÃo de genes antiapoptÃticos o veneno total promoveu induÃÃo significativa de Mcl-1 somente na concentraÃÃo de 46,65mg/mL e nÃo modificou a expressÃo de Bcl-XL, quando comparado com o controle negativo. O veneno e as fraÃÃes PLA2 Lys 49 e Asp 49 da serpente Bothropoides erythromelas à capaz de promover significativos efeitos sobre os parÃmetros de funÃÃo renal e sobre cÃlulas MDCK, com indicativo de morte celular por apoptose atravÃs da via extrÃnseca. / Bothropoides erythromelas is responsible for a great deal of snakebites in Northeastern from Brazil. The venom of this snake induces acute renal failure. Isolated kidneys from Wistar rats, weighting 250 to 300g, were perfused with Krebs-Henseleit solution containing 6g% of bovine serum albumin for 120 min. The whole venom of Bothropoides erythromelas been previously studied (SOUSA, 2004) and used in this study for comparison with the treated groups with the PLA2 fractions Lys 49 and Asp 49 of the venom. The whole venom (10mg/mL) and the fractions PLA2 Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas (5mg/mL) were added into the system 30 min after the beginning of each experiment. The parameters studied included perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), glomerular filtration rate (GFR), urinary flow (UF), percent sodium, potassium and chloride tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-), percent sodium, potassium and chloride proximal transport (%pTNa+, %pTK+ and %pTCl-), sodium, potassium and chloride excretion (ENa+, EK+ e ECl-) and osmotic clearance (Cosm) (p< 0.05*). The control group perfused with albumin was functionally stable for over 120 min. The infusion of venom caused a significant increase in UF, ENa+, ECl- and Cosm and a decreased in PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ and %pTCl-. The GFR and the EK+ decreased at 60 min and increased at 90 and 120 min when compared with control group. The infusion of Lys 49 caused a significant increase in PP, UF, ENa+, EK+ and Cosm and decreased the GFR and the %TNa+ when compared with control group. Lys49 did not modify the others functional kidney parameters. The infusion of Asp 49 only modify the functional kidney parameters %pTK+ (decreased) and EK+ (increase) when compared with control group. Lys 49 showed a similar effect at whole venom in parameters UF, %TNa+, ENa+, EK+ and Cosm and Asp 49 in parameters %pTK+ and EK+. The histological analysis showed a mild amount of a proteinaceous substance in the renal tubules and glomeruli of kidneys perfused with the venom, Lys 49 and Asp 49, as well as focal areas of apoptosis/necrosis in perfused kidneys with Lys 49 e Asp 49. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% vv fetal bovine serum and then assessed in the presence of the whole venom, Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas in the concentrations (100; 50; 25; 12.5; 6.25 and 3.125mg/mL). The analysis of cytotoxic effects on MDCK cells was performed by MTT method. The venom promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100mg/mL (IC50 =93.31mg/mL). Lys 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 6.25; 12.5; 25; 50 and 100 mg/mL (IC50 = 38.29mg/mL). Asp 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100 mg/mL (IC50 = 158mg/mL). Also the levels of lactic dehydrogenase (LDH) were measured and no significant increase was observed with whole venom and Asp 49. Lys 49 promoted a significant increase in the levels of LDH only in the concentration of 100mg/mL. After culture of MDCK cells with the whole venom, at concentrations of 46.65 and 23.32Âg/mL, was performed the real time polymerase chain reaction for evaluation of pro (Caspase-3, Caspase-8 and Bax) and antiapoptotic (Bcl-XL and Mcl-1) genes expression. The evaluation of pro and antiapoptotic genes expression with Lys 49 e Asp 49 did not realized. In the expression of pro-apoptotic genes the whole venom caused increase of caspase-3 at concentration of 23.32Âg/mL and of caspase-8 at concentrations of 46.65 and 23.32Âg/mL, when compared with negative (PBS) and positive (DOXO) controls and decreased the expression of Bax in both concentrations. In the expression of anti-apoptotic genes the whole venom caused significant induction of Mcl-1 only at a concentration of 46.65Âg/mL and did not modify the expression of Bcl-XL, when compared with the negative control. The venom and the fractions PLA2 Lys 49 e Asp 49 of Bothropoides erythromelas is able to promote significant effects on renal function parameters and on MDCK cells, with indications of cell death by apoptosis through the extrinsic pathway.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Os peptideos potenciadores de bradicinina (BPPs) presentes na fracao de baixo peso molecular (FBP) do veneno da serpente Bothropoides jararaca (Bj) foram os primeiros inibidores da enzima conversora de angiotensina descritos. Recentes estudos demonstram que estes peptideos promovem a ativacao da enzima argininosuccinato sintetase, aumentando a disponibilidade de L-arginina e consequentemente a sintese de oxido nitrico, poliaminas e agmatina, essenciais para o crescimento, diferenciacao celular e neuroprotecao. Considerando os possiveis efeitos farmacologicos da FBP, o presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade citoprotetora da FBP do veneno da serpente Bj em cultura primaria de celulas do hipocampo. Os resultados sugerem que a FBP nao e citotoxica nas condicoes experimentais avaliadas. Evidencias demonstram que as celulas tratadas com FBP 0,1 ¿Êg/mL e posteriormente com peroxido de hidrogenio H2O2 50¿ÊM apresentam maior viabilidade e menor expressao de caspase 3 clivada que as celulas tratadas apenas com H2O2 50¿ÊM, tambem e possivel observar que as celulas previamente tratadas com FBP apresentam morfologia normal, caracterizada pela presenca de neuritos, ja as celulas tratadas apenas com H2O2 50¿ÊM apresentam morfologia compativel com processos de morte celular. Em sintese os resultados sugerem que a FBP apresenta atividade citoprotetora contra o estresse oxidativo promovido por H2O2 50¿ÊM. O presente estudo abre novas perspectivas da aplicacao dos BPPs presentes na FBP da Bj para o desenvolvimento de novas pesquisas na area de neurociencia, com foco no desenvolvimento de farmacos aplicados ao tratamento de doencas neurodegenerativas. / The bradykinin potentiating peptides (BPPs) in the low molecular weight fraction (LMWF) from the venom of the Bothropoides jararaca (Bj) were the first angiotensin-converting enzyme inhibitors described. Recent studies have demonstrated that these peptides promote the activation of the enzyme argininosuccinate synthetase, increasing the availability of L-arginine and therefore the synthesis of agmatine, nitric oxide, polyamines essential for the growth, cell differentiation and neuroprotection. Considering the possible pharmacological effects of the LMWF, the present study aims to evaluate the cytoprotective activity of LMWF from Bj in primary cultured hippocampal cells. The results suggest that the LMWF is not cytotoxic in all experimental conditions. Evidence has shown that cells treated with LMWF 0.1 ìg/mL and then with hydrogen peroxide H2O2 (50ìM) show higher viability and lower expression of cleaved caspase 3 cells than the treated just with H2O2 (50ìM). Is also observed that cells pretreated with LMWF have normal morphology characterized by the presence of neurites, cells treated with H2O2 (50ìM) showed morphology compatible with cell death processes. In summary the results suggest that LMWF has cytoprotective activity against oxidative stress caused by H2O2 (50ìM). This study opens new perspectives of application of BPPs present in the LMWF from Bj for the development of new research in neuroscience, focusing on the development of drugs applied to the treatment of neurodegenerative diseases.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Os acidentes ofidicos sao considerados um problema de saude publica. Por este motivo, ha a necessidade de realizar estudos de caracterizacao do veneno, bem como os de tratamentos e da fisiopatologia do envenenamento. Os componentes do veneno possuem especificidade com varios receptores teciduais humanos, podendo desestabilizar o sistema nervoso, cardiovascular ou hemostatico. Os peptideos potenciadores de bradicinina (BPPs) foram os primeiros inibidores naturais da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) descritos, presentes na fracao de baixo peso molecular (Bj-FBP). No presente estudo foram avaliados as alteracoes no testiculo e musculo estriado esqueletico durante o processo de envenenamento induzido via intramuscular pela acao do veneno e da fracao de baixo peso molecular da serpente Bothropoides jararaca (Bj-V). 22 camundongos machos da linhagem Swiss foram aleatoriamente distribuidos em grupos de 6h e 24h e administrados uma dose de 20¿ÊL de NaCl 0,9% nos animais controle (n=3); 1.2 mg/kg de veneno bruto (Bj-V) (n=4) e 0.24 mg/kg da fracao de baixo peso molecular (Bj-FBP) (n=4). A fracao de baixo peso molecular foi obtida por uma filtracao com peso molecular de 10 kDa e analisado por Espectrometria de Massas onde confirmou a ausencia de indicios de proteinas ou enzimas proteoliticas. Apos o tratamento os testiculos e fragmentos do musculo reto femoral foram coletados e analisados para avaliacao morfologica dos tratamentos. O envenenamento foi caracterizado pela analise morfologica do musculo estriado esqueletico, onde verificou-se, nas amostras do tratamento com Bj-V, verificou-se presenca de hemorragia e necrose tecidual; nas amostras dos animais tratados com Bj-FBP verificou-se a integridade das fibras musculares, mas houve a presenca de migracao celular leucocitaria. Na analise histopatologica dos testiculos observou-se com maior frequencia, alteracoes na morfologia dos tubulos seminiferos dos camundongos tratados com Bj-V e Bj-FBP em comparacao ao controle. Em sintese, os resultados demonstraram que o envenenamento por Bj podem afetar os tubulos seminiferos, levando a presenca de tubulos hipoespermatogenicos, sendo assim, os individuos acometidos pelo acidente ofidico podem apresentar algum comprometimento na espermatogenese. / Snakebites are considered a public health problem. For this reason, there is a need for studies to characterize the poison and the pathophysiology and treatment of poisoning. The components of the venom have specificity with various human tissue receptors, may destabilize the nervous, cardiovascular or hemostatic system. The bradykinin potentiating peptides (BPPs) were the first natural inhibitors of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) described, present in the low molecular weight fraction (Bj-FBP). In the present study the changes in the testis and skeletal muscle were assessed during the process of poisoning induced by intramuscular action of the poison and the fraction of low molecular weight Bothropoides snake jararaca (Bj-V). 22 male mice of the Swiss strain were randomly distributed in groups of 6h and 24h and administered a dose of 20¿ÊL of 0.9% NaCl in control animals (n = 3); 1.2 mg / kg of crude venom (Bj-V) (n = 4) and 0.24 mg / kg of low molecular weight fraction (Bj- FBP) (n = 4). The low molecular weight fraction was obtained by filtration with molecular weight 10kDa and analyzed by mass spectrometry which confirmed the absence of evidence of proteolytic enzymes or proteins. After treatment the testes and fragments of the rectus femoris muscle were collected and analyzed for morphologic evaluation of treatments. The poisoning was characterized by morphological analysis of the striated skeletal muscle, where it was found in the samples treated with Bj-V, there was the presence of hemorrhage and necrosis; in samples from animals treated with Bj-FBP was found the integrity of muscle fibers, but there was the presence of leukocyte cell migration. Histopathology of the testes was observed more frequently, changes in the morphology of the seminiferous tubules of mice treated with Bj and Bj-V-FBP compared to the control. In summary, the results showed that Bj poisoning can affect the seminiferous tubules, leading to the presence of hipoespermatogenicos tubules, so individuals affected by snakebite may have some involvement in spermatogenesis.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Chapter II: In the present study, a metalloproteinase named BpMPI was isolated from Bothropoides pauloensis snake venom and its biochemical, enzymatic and immunochemical characteristics were determined. BpMPI was purified in two chromatography steps on ion exchange resins CM-Sepharose Fast flow and Sephacryl S-300. This protease was homogeneous on SDS-PAGE and showed a single chain polypeptide of 23 kDa under reducing conditions. The primary structure of the enzyme showed high similarity with other SVMPs enzymes from snake venoms. BpMPI showed proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at high temperatures. BpMPI was able to hidrolyse glandular and tecidual kallikrein substrates, but was unable to act upon factor Xa and plasmin substrates. The enzyme did not able to induce local hemorrhage in the dorsal region of mice even at high doses. Immunochemistry studies showed that BpMPI was high immunogenic and the antibodies anti-BpMP-I were very efficient to neutralize the hemorrhagic activity and systemic alterations induced by Bothropoides pauloensis snake venom. / Capítulo II: No presente estudo, uma metaloproteinase denominada BpMPI foi isolada da peçonha da serpente Bothropoides pauloensis e suas características bioquímicas, enzimáticas e imunoquímicas foram determinadas. BpMPI foi purificada utilizando dois passos cromatográficos em resinas de troca iônica CM-Sepharose Fast Flow e Sephacryl S-300. Esta protease mostrou-se homogênea em SDS-PAGE apresentando uma única cadeia polipeptídica de 23 kDa sob condições redutoras. A estrutura primária da enzima mostrou alta similaridade com outras enzimas SVMPs de venenos de serpentes. BpMPI mostrou atividade proteolítica sobre azocaseina e fibrinogênio bovino e foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina e β- mercaptoetanol. Além disso, esta enzima apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas. BpMPI também foi capaz de hidrolisar os substratos da calicreína glandular e tecidual, mas foi incapaz de hidrolisar os substratos do fator Xa e plasmina. A enzima não foi capaz de induzir hemorragia local na região dorsal de camundongos mesmo em altas doses. Estudos imunoquímicos demostraram que os anticorpos anti-BpMP-I foram eficientes em neutralizar a atividade hemorrágica e as alterações sistêmicas induzidas pela peçonha de Bothropoides pauloensis. / Mestre em Genética e Bioquímica