Brazil is the world's largest orange producer (Citrus sinensis L. Osbeck), whose production in 2014/2015 amounted to approximately 16.7 million metric tons and with an expected decrease in production of 14.3 million metric tons for the 2015/2016 crop. The orange production would be even greater, if it were not for damages caused by citrus leprosis viruses (Citrus Leprosis Virus - CiLV), transmitted by citrus leprosis mites of the genus Brevipalpus spp. found in all citrus producing regions of the world. Citrus leprosis is considered one of the most important viruses in citrus orchards in Brazil with significant results on the reduction of production and life span of plants, due to lesions and premature fall of fruits and leaves. It may also cause death of branches and shoots. Thus, researches aimed at the proper management of the virus vector are becoming increasingly necessary to reduce production costs and increase fruit quality and plant longevity. Therefore, studies were carried out in an area of monoculture of citrus, and in other areas with system of cultivation in consortium of citrus with teak, in the citrus growing areas of the state of Pará aiming to study the spatial distribution of citrus leprosis associated with its vector and abiotic factors in the Brazilian Amazon through geostatistics, and to test the spatial distribution by means of dispersion indices Morisita index (Iδ), Green coefficient (Cx), exponent k of the negative binomial distribution, Taylor's power law, and estimation of the common k exponent) to elaborate a sequential sampling plan for the citrus leprosis mite under local conditions, in order to optimize the sampling method. It was verified that for the methods studied, the citrus leprosis and its vector presented an aggregated spatial distribution in the two evaluated citrus cultivation systems. Using geostatistics, it was verified that the spatial dependence of the citrus leprosis mite varied from 15 to 80 meters in a monoculture system, and from 28 to 44 meters in a consortium system with teak, whereas for citrus leprosis the spatial dependence was from 25 to 75 meters in monoculture, and 20 to 40 meters in a consortium system. For the sequential sampling plan, it is concluded that the spatial distribution model that best represented the data was the Negative Binomial Distribution and, for the number of mites per plant, the expected maximum number of sample units for decision making is 21 mites per plant in both cropping systems, while for the number of mites in six branches this value is 28 sample units. / O Brasil é o maior produtor mundial de laranja (Citrus sinensis L. Osbeck), com uma produção na safra 2014/2015 de aproximadamente 16,7 milhões de toneladas e com expectativa de diminuição de produção para 14,3 milhões de toneladas para a safra 2015/2016. A produção da laranja seria ainda maior se não fosse os danos causados pela leprose dos citros (Citrus Leprosis Virus – CiLV), transmitida pelos ácaros da leprose dos citros, do gênero Brevipalpus spp., que são encontrados em todas as regiões no mundo produtoras de citros. A leprose dos citros é considerada uma das mais importantes viroses dos pomares citrícolas no Brasil devido aos efeitos significativos na redução da produção e no período de vida das plantas, causado por lesões e queda prematura dos frutos e folhas, podendo ainda ocasionar morte de ramos e brotações. Dessa forma, trabalhos que visem ao manejo adequado do vetor do vírus, tornam-se cada vez mais necessários para que sejam reduzidos os custos de produção e se aumente a qualidade dos frutos e longevidade das plantas. Neste trabalho, foram realizados estudos em uma área de monocultivo de citros e em outra área com sistema de cultivo em consórcio de citros com teca, no pólo citrícola do estado do Pará, com objetivo de se estudar a distribuição espacial da leprose dos citros associada ao seu vetor e fatores abióticos na Amazônia brasileira, por meio da geoestatística, e também estudar a distribuição espacial por meio de índices de dispersão (índice de Morisita (Iδ), coeficiente de Green (Cx), expoente k da distribuição binomial negativa, lei da potência de Taylor e estimativa do expoente k comum) para elaborar um plano de amostragem sequencial para o ácaro da leprose dos citros em condição local, afim de otimizar o método de amostragem. Verificou-se que os métodos estudados, a leprose dos citros e seu vetor, apresentaram distribuição espacial agregada nos dois sistemas de cultivo de citros avaliados. Com a utilização da geoestatística, verificou-se que a dependência espacial do ácaro da leprose dos citros variou de 15 a 80 metros em sistema de monocultivo e de 28 a 44 metros em sistema consorciado com teca, enquanto que para leprose dos citros a dependência espacial foi de 25 a 75 metros em monocultivo e 20 a 40 metros em sistema consorciado. Para o plano de amostragem sequencial conclui-se que o modelo de distribuição espacial que melhor representou os dados foi o da Distribuição Binomial Negativa e, para o número de ácaros por planta, o número máximo esperado de unidades amostrais para tomada de decisão é de 21 unidades amostrais, enquanto que para o número de ácaros em seis ramos esse valor é de 28 unidades amostrais.

Orientador: Carlos Amadeu Leite de Oliveira / Banca: Celso Omoto / Banca: Mário Eidi Sato / Banca: Nilza Maria Martinelli / Banca: Marcelo da Costa Ferreira / Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar a viabilidade técnico-econômica da poda associada ao controle químico no manejo da leprose. Visou também, investigar as relações entre leprose e características da planta, bem como o efeito de sucessivas aplicações de calda sulfocálcica sobre propriedades químicas do solo. O experimento foi conduzido de 2003 a 2010, totalizando sete safras, em um pomar de laranja „Pera‟ localizado no município de Reginópolis-SP. Neste pomar foram realizadas podas severas e leves, e replantio, e aplicações de acaricidas para controlar do ácaro vetor Brevipalpus phoenicis. Realizaram-se levantamentos populacionais do B. phoenicis e de ácaros predadores, quantificação da produção, incidência e severidade da leprose, assim como a viabilidade de cada estratégia empregada foi calculada. Nas duas últimas safras do experimento realizaram-se avaliações das características físico-químicas dos frutos, análises foliares e de solo. Após as sete safras, verificou-se que a poda utilizada isoladamente não foi suficiente para o controle da leprose, sendo necessária a associação de outras táticas. A poda leve associada a acaricidas específicos foi à tática mais eficiente e viável economicamente. Os parâmetros físico-químicos de frutos não foram afetados pela alta severidade leprose na planta, indicando que os frutos que permanecem na planta até a colheita apresentam características idênticas às plantas isentas de leprose. Entretanto, embora a leprose não afete a qualidade do suco, afeta significativamente a produtividade da planta, podendo reduzi-lá a zero. As plantas com maior severidade da leprose apresentaram menores teores foliares de cálcio e maiores teores de potássio, fósforo e nitrogênio. As várias aplicações de calda sulfocálcica sobre as plantas proporcionaram maior teor de enxofre no solo nas camadas de 0-20 cm e de 20-40 cm / Abstract: The aim of this work was to evaluate the technical and economic feasibility of pruning associated with chemical control in citrus leprosis management. And also investigate the relationship among the disease and properties plant, as well as the effect of successive applications of lime sulfur on chemical properties of soil. The study was conducted from 2003 to 2010, totaling seven seasons in an orange plantation of the „Pear‟ variety in the city of Reginópolis-SP. In the orchard were realized severe and light pruning over citrus trees and replanting and pesticide spraying to control Brevipalpus phoenicismite, the disease vector. There had been performed B. phoenicis and predator mite population surveys, yield evaluation, leprosis incidence, as well as the variability of each strategy was also measured. By the two last seasons during the experiment was carried out fruit physical and chemical properties evaluation, leaf and soil analysis. After seven seasons period, it was observed that the pruning only is not able to control leprosis by itself, being necessary another strategy associated. The light pruning associated to the specific acaricide application was the more efficient and economically viable. The main fruit physical and chemical parameters were not affected by the leprosis incidence, what shows that the fruit that remain on the plant until the harvest have identical characteristics to that plant free from the disease. However, although the leprosis not affect juice quality, the disease reduces production significantly. The plant presenting higher leprosis severity present lower leaf calcium content and higher potassium, phosphorus and nitrogen contents.The various lime sulfur spray on the plant had provided a highersulfur content at 0 - 20 cm and 20 - 40 cm soil depth / Doutor

A cultura do maracujazeiro tem sido afetada por um grande número de pragas e doenças, que exigem dedicação e esforços urgentes, no sentido de minimizar as perdas e evitar sua disseminação. O vírus da pinta verde do maracujazeiro (PVM) (Passion fruit green spot virus PFGSV) caracteriza-se por induzir a formação de pequenas manchas verdes em frutos e em folhas, e lesões necróticas em ramos. Exames de secções ultrafinas de tecidos infectados ao microscópio eletrônico de transmissão consistentemente revelam a presença de partículas baciliformes em cisternas do retículo endoplasmático e viroplasma denso no citoplasma. Os efeitos citopáticos encontrados, a relação com o ácaro vetor, Brevipalpus phoenicis, e a comparação com outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTB), como o da leprose dos citros, classifica o vírus como sendo do tipo citoplasmático. Seu relato inicial deu-se há cerca de 10 anos em Vera Cruz-SP, mas em 1994 foi relatada uma doença no Estado da Bahia chamada de definhamento precoce do maracujazeiro (DPM), que apresenta sintomas, efeitos citopáticos e vetor semelhantes ao da pinta verde, tendo sido sugerida a possibilidade de serem duas denominações para uma mesma doença. Atualmente a PVM/DPM encontra-se em vários outros Estados como Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pará, além do Distrito Federal. Sua diagnose ainda depende dos sintomas observados, infestação por ácaros Brevipalpus e microscopia eletrônica. Para se desenvolver um método de diagnose molecular, que permita detectar o vírus causador da PVM/DPM de maneira rápida e confiável, em grande número de amostras, foi feita uma Biblioteca de cDNA a partir do RNA dupla fita do vírus, extraído de tecidos sintomáticos de maracujazeiros infectados com um isolado do PFGSV encontrado em Limeira-SP. Com o sequenciamento parcial do genoma viral, foram desenhados primers específicos que amplificam partes dos genes putativos da p24 e aqueles que codificam a proteína de movimento (MP) e a Replicase (Rep) de diferentes isolados do PFGSV. Primers do PFGSV e de dois outros VTBs do tipo citoplasmático (VTB-C) para os quais se dispõe de primers para sua detecção por RT-PCR (vírus da leprose dos citros C - CiLV-C; mancha anelar de Solanum violaefolium - SvRSV) foram testados em reações homólogas e heterólogas. Ocorreram amplificações por RT-PCR gerando fragmentos de tamanho esperados apenas para os vírus homológos, mas não nas reações heterólogas, indicando que PFGSV deve diferir do CiLV-C e SvRSV. Assim, tem-se agora uma ferramenta molecular que detecta especificamente o PFGSV. Um estudo inicial sobre a variabilidade genética do PFGSV foi feito a partir da extração do RNA total, seguido de RT-PCR utilizando os primers específicos, purificação dos fragmentos obtidos e uso da técnica de Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Foram analisados isolados procedentes de diferentes regiões brasileiras e em geral a variabilidade foi maior para as amostras do Estado de São Paulo. Logrou-se transmitir experimentalmente o PFGSV com ácaros para uma espécie silvestre de maracujá (Passiflora morifolia). / In Brazil, passion fruits are affected by several diseases and pests which affect their yield. Among them, a recently recognized viral disease, caused by Passion fruit green spot virus (PFGSV), is characterized by the presence of green spots on fruits and senescent leaves, and necrotic lesions on branches. When the infection is early, stem lesions may coalesce, girdling the branch resulting in the subsequent death of the plant. Electron microscopic examination of the thin sections of infected tissues revealed the presence of short, bacilliform particles in the cistern of the endoplasmic reticulum and dense, vacuolated viroplasma in the cytoplasm. The disease was shown to be transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). The localized symptoms, transmission by Brevipalpus mite and the observed cytopathic effect are considered evidences to demonstrate the viral nature of the disease and place it among the socalled cytoplasmic type of Brevipalpus-transmitted viruses (C-BTV), whose prototype is the Citrus leprosis virus C (CiLV-C). Though the first report of the disease occurred more than 10 years ago at Vera Cruz-SP, little is known about PFGSV, though it has been found in several passion flower growing areas in Brazil. In 1994 was report a disease named of DPM (definhamento precoce do maracujazeiro) was reported state of Bahia, with characteristics similar to that of the PVM and it has been suggested that DPM and PVM are the same disease. Subsequently the PVM/DPM has been found in several others Brazilian States as Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pará and Distrito Federal. Diagnosis has been made by symptoms, association with Brevipalpus mites and the time consuming transmission electron microscopy. This work reports the results of efforts to generate a quick and precise method to detect the virus for the diagnosis of the disease, evaluate the variability of the PFGSV isolates from different regions of the country and determine the taxonomic position of this virus. From the dsRNA present in extracts of the PFGSV-infected passion flower plant tissues, a cDNA library was obtained and its sequencing permitted to identify part of the viral genome. Based on these sequences, particularly of p24 and the putative genes that code for the movement protein (MP) and replicase (Rep), specific primers were designed which specifically detected PFGSV by RT-PCR in extracts of PFGSV-infected tissues. Evaluation of the variability of different isolates of PFGSV was made by single strand conformational polymorphism (SSCP) of the amplified fragments of the viral genome. In general, it a larger variation was found in isolates from São Paulo state. PFGSV seems to differ from two other C-BTV with available primers, CiLV-C and the Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), since RT-PCR assays do not cross amplify their genomes. Experimental transmission of PFGSV by mites to woodland passion flower (Passiflora morifolia) was achieved.

O gênero botânico Clerodendrum pertence à família Lamiaceae e compreende várias espécies ornamentais, geralmente trepadeiras, das quais as mais comumente cultivadas são coração-sangrento (C. x speciosum Tiejism. & Binn.) e lágrima-de-Cristo (C. thomsonae Balf.). Manchas cloróticas e necróticas em folhas de coração-sangrento foram observadas pela primeira vez em um jardim de Piracicaba, SP, associadas à infestação com Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae). Exames de secções de tecidos das lesões foliares ao microscópio eletrônico revelaram ocorrência de efeitos citopáticos do tipo nuclear e concluiu-se que os sintomas eram causados por um vírus transmitido por Brevipalpus (VTB), o qual foi tentativamente designado de mancha clorótica de Clerodendrum (Clerodendrum chlorotic spot virus- ClCSV). O ClCSV é transmitido mecanicamente de coração-sangrento para coração-sangrento e em ensaios preliminares foi transmitido mecanicamente e por Brevipalpus phoenicis para várias outras plantas, além da ocorrência de sua disseminação natural por esses ácaros para outras espécies. Ocorre a infecção sistêmica nas hospedeiras Chenopodium quinoa Will. e C. amaranticolor Coste & Reyn. infectadas com ClCSV caso as plantas sejam mantidas por cerca de 2 semanas entre 28-30 oC. Utilizando-se estas plantas realizou-se a purificação parcial do vírus. Este trabalho apresenta a caracterização biológica e molecular do ClCSV. Os resultados dos testes PTA-ELISA e RT-PCR demonstraram a detecção do ClCSV em diversas hospedeiras, além da análise da reação sorológica e molecular deste vírus com os outros VTBs do tipo nuclear. O seqüenciamento do produto de PCR revelou que as seqüências de nucleotídeos apresentaram similaridade com a polimerase de OFV (Orchid Fleck Virus), outro VTB do tipo nuclear. Além da identificação sorológica do vírus foram realizadas análises morfo-anatômicas para visualização das alterações causadas pelo ClCSV em tecidos de Clerodendrum x speciosum e em hospedeiras infectadas. / The botanical genus Clerodendrum belongs to the family Lamiaceae and includes several ornamental species, usually climbing, and heart-bloody (C. x speciosum Tiejism. & Binn.) and tear-in-Christ (C. thomsonae Balf. ) are among the most cultivated. Necrotic and chlorotic spots on leaves of heart-blood have been observed for the first time in a garden of Piracicaba, associated with an infestation of Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae). Sections of diseased tissues examined in the electron microscope revealed characteristic cytopathic effects of the nuclear type and concluded that the symptoms were caused by a virus transmitted by Brevipalpus (VTB), tentatively named Clerodendrum chlorotic spot virus (ClCSV). This virus is transmitted through mechanical inoculation from heart-bloody to heart-bloody and in preliminary tests mechanically and by mites for several other plants, in addition to the natural occurrence of its spread to other species. Systemic infection occurs in the host Chenopodium quinoa Will. and C. amaranticolor Coste & Reyn. infected with ClCSV if the plants are kept at 28-30°C for about 2 weeks. These plants were used for partial purification of vírus. This study presents the biological and molecular characterization of ClCSV. Through the PTA-ELISA and RT-PCR tests was possible to detect the ClCSV in different host, in addition to the analysis of serological and molecular reaction of this virus with other type of nuclear VTBs. From the sequencing of the PCR product was obtained from nucleotide sequences that showed similarity to the polymerase of OFV (Orchid Fleck Virus), another type of nuclear VTB. Morpho-anatomical analysis were performed to see the changes caused by ClCSV in tissues of Clerodendrum x speciosum and other infected hosts. It was possible to observe the occurrence of hypertrophy, cell plasmolisis and the reduction of starch grains in the áreas injured in all plants infected by ClCSV.

A leprose dos citros, causada por Citrus leprosis vírus (CiLV), é uma doença endêmica nas regiões produtoras do estado de São Paulo que causa sérios prejuízos à produção. O vírus é transmitido exclusivamente pelo ácaro Brevipalpus phoenicis e medidas de controle da doença visam principalmente reduzir a população do vetor através de aplicações de acaricidas. Apesar do controle da doença ser determinado por meio de amostragens da população do ácaro, não há nenhum estudo de longo prazo que correlacione a população do vetor com a incidência da doença. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os padrões de crescimento temporal e os padrões espaciais da distribuição do ácaro e da doença e estabelecer uma associação entre as duas populações. A população do ácaro e os sintomas de leprose foram monitorados durante três anos sob condições naturais de epidemia, em um talhão de laranja doce, variedade Valência enxertada sobre limão cravo, A população de B. phoenicis apresentou flutuações, mas com picos crescentes ao longo do período. As oscilações na sua densidade dependeram principalmente da fenologia das plantas e menos das condições climáticas. O crescimento da incidência da doença foi lento e seguiu comportamento logístico. Apesar de não ser sistêmica a leprose dos citros comporta-se como poliética com acúmulo de inoculo de ano para ano. A infecção em ramos é a principal causa do caráter cumulativo da doença. Através de regressão logística, a probabilidade de doença foi modelada em função de covariáveis construídas de forma a captar informação da vizinhança das plantas no tempo passado a respeito da incidência do ácaro e da própria doença. Não houve correlação entre o nível de doença numa avaliação e a quantidade de ácaros em avaliações anteriores, em períodos pregressos de até 70 dias. O padrão espacial de plantas com sintomas foi altamente agregado e não correspondeu à distribuição espacial de plantas infestadas pelo ácaro, que foi fracamente agregada. A probabilidade de infestação e de infecção nas plantas foi modelada como dependente do estado das plantas vizinhas, quanto às próprias características, através de modelos autologísticos. A probabilidade de plantas estarem infestadas pelo ácaro não depende de sua vizinhança estar ou não hospedando a praga, ao mesmo tempo. Já a probabilidade de doença em uma árvore depende de árvores vizinhas estarem doentes naquele momento. O padrão espacial da incidência de plantas com sintomas visíveis provavelmente reflete o padrão de infestação pelos ácaros contaminados por CiLV, pois existe uma subpopulação de vetores inserida na população de B. phoenicis. O controle da doença baseado na população de B. phoenicis, não é portanto, recomendável. A amostragem para a tomada de decisão de controle deve ser pautada pela presença de sintomas e ácaros e não somente pela presença de ácaros. / Citrus leprosis, caused by Citrus leprosis virus (CiLV), is a disease endemic to the producing regions of the state of São Paulo, where it has a heavy impact on production. The virus is transmitted exclusively by the Brevipalpus phoenicis mite and disease control measures aim to reduce the vector population mainly by acaricide applications. Although the disease control is based on mite population samplings, there are no long-term studies available that correlate the vector population with the disease incidence. The objective of this study was to characterize temporal and spatial growth patterns of the mite, disease distribution and the association between the two populations. The mite population and citrus leprosis symptoms were monitored for three years under natural epidemic conditions, in a sweet orange stand of the variety Valencia, grafted unto Citrus limonia Osbeck. The B. phoenicis population presented fluctuations, although with increasing peaks along the study period. The oscillation density depended more on the tree phenology than on climate conditions. The disease incidence increased slowly under a logistic model. Although citrus leprosis is not systemic, it has a polietic performance and builds up inoculum year after year. The infection of branches is the main cause of the cumulative nature of the disease. The disease probability was modeled by a covariable constructed to capture information of the trees surroundings in the past, concerning mite incidence and the disease itself. There was no correlation between the disease level in one evaluation and the mite quantity in earlier evaluations, in antecedent periods of up to 70 days. The spatial pattern of trees with symptoms was highly aggregated and did not correspond to the spatial distribution of miteinfested trees, which was weakly aggregated. The probability of tree infestation and infection was modeled as dependent of the state of the surrounding trees through autologistic models. The probability of mite infestation of a tree does not depend on whether the neighbor trees host the pest or not, but on whether the neighbor trees are diseased at that moment. A vector subpopulation is inserted in the B. phoenicis population. The spatial pattern of tree incidence with visible symptoms probably reflects the infestation pattern by CiLV-contaminated mites. Sampling for decision taking regarding disease control must be based on the presence of symptoms as well as of mites, rather than on the mite population only.

O vírus da mancha das orquídeas ("Orchid fleck virus" - OFV), transmitido pelo ácaro Brevipalpus californicus, causa manchas cloróticas e necróticas em orquídeas de vários gêneros e foi relatado em diversos países. O diagnóstico de "orchid fleck", doença causada pelo OFV, tem sido feito através da análise dos sintomas, sorologia, observação de cortes ultrafinos de tecido infectado em microscópio eletrônico de transmissão ou RT-PCR. No entanto, apesar de testes moleculares serem freqüentemente mais eficientes e específicos que outros métodos, os "primers" disponíveis na literatura nem sempre detectam o vírus em baixas concentrações no tecido vegetal, ou amplificam regiões da planta sadia. Com base nas seqüências nucleotídicas da capa protéica viral depositadas no GenBank foram desenhados novos "primers", que amplificam um fragmento de 326 pb. Esses "primers" foram utilizados para a detecção do OFV por RT-PCR e para a marcação com digoxigenina de sondas para hibridização. A variabilidade de um fragmento do gene da capa protéica deste vírus foi estudada por polimorfismo conformacional de fita simples ("Single strand conformational polymorphism" - SSCP) e seqüenciamento de nucleotídeos. Quarenta e oito amostras de 18 gêneros de orquídeas foram coletadas no Brasil, Costa Rica e Austrália. As análises dos padrões de SSCP resultaram em seis haplótipos diferentes e em agrupamentos baseados na origem geográfica das amostras. Amostras representando cada um desses padrões foram seqüenciadas e comparadas com aquelas disponíveis no GenBank. A análise de SSCP provou ser eficiente para fornecer informações preliminares sobre a variabilidade do OFV. No entanto, apenas através do seqüenciamento de nucleotídeos das amostras foi possível determinar a real variabilidade das mesmas. / Orchid fleck virus (OFV), transmitted by the mite Brevipalpus californicus, causes chlorotic and necrotic ringspots in many orchid genera and was reported in several countries. The diagnosis of the Orchid fleck disease has been performed by symptomatology, transmission electon microscopy, serology or RT-PCR. Even though the molecular tests are usually more efficient and specific than other methods, the available primers did not always detect the OFV in low concentrations or sometimes amplified healthy plant samples. Based on the nucleotide sequences of the coat protein gene (cp) available in the GenBank, new primers were designed. These primers amplified a 326 pb specific OFV fragment and were used for RT-PCR and as hybridization probes. The variability of a fragment of the cp of this virus was investigated by "single strad conformational polymorphism (SSCP)" and nucleotide sequencing. Forty eight samples of 18 genera of orchids were collected from Brazil, Costa Rica and Australia. The SSCP analysis resulted in six different haplotypes and demonstrated a clustering in samples based on geographical origin. Samples representing the different SSCP patterns were sequenced and compared with those available in the GenBank. The SSCP analysis proved to be efficient to provide preliminary information about OFV variability. However, only through nucleotide sequencing it was possible to determine the actual variability amongst the samples.

O vírus da mancha das orquídeas (“Orchid fleck virus” - OFV), transmitido pelo ácaro Brevipalpus californicus, causa manchas cloróticas e necróticas em orquídeas de vários gêneros e foi relatado em diversos países. O diagnóstico de "orchid fleck", doença causada pelo OFV, tem sido feito através da análise dos sintomas, sorologia, observação de cortes ultrafinos de tecido infectado em microscópio eletrônico de transmissão ou RT-PCR. No entanto, apesar de testes moleculares serem freqüentemente mais eficientes e específicos que outros métodos, os "primers" disponíveis na literatura nem sempre detectam o vírus em baixas concentrações no tecido vegetal, ou amplificam regiões da planta sadia. Com base nas seqüências nucleotídicas da capa protéica viral depositadas no GenBank foram desenhados novos “primers”, que amplificam um fragmento de 326 pb. Esses “primers” foram utilizados para a detecção do OFV por RT-PCR e para a marcação com digoxigenina de sondas para hibridização. A variabilidade de um fragmento do gene da capa protéica deste vírus foi estudada por polimorfismo conformacional de fita simples ("Single strand conformational polymorphism" – SSCP) e seqüenciamento de nucleotídeos. Quarenta e oito amostras de 18 gêneros de orquídeas foram coletadas no Brasil, Costa Rica e Austrália. As análises dos padrões de SSCP resultaram em seis haplótipos diferentes e em agrupamentos baseados na origem geográfica das amostras. Amostras representando cada um desses padrões foram seqüenciadas e comparadas com aquelas disponíveis no GenBank. A análise de SSCP provou ser eficiente para fornecer informações preliminares sobre a variabilidade do OFV. No entanto, apenas através do seqüenciamento de nucleotídeos das amostras foi possível determinar a real variabilidade das mesmas. / Orchid fleck virus (OFV), transmitted by the mite Brevipalpus californicus, causes chlorotic and necrotic ringspots in many orchid genera and was reported in several countries. The diagnosis of the Orchid fleck disease has been performed by symptomatology, transmission electon microscopy, serology or RT-PCR. Even though the molecular tests are usually more efficient and specific than other methods, the available primers did not always detect the OFV in low concentrations or sometimes amplified healthy plant samples. Based on the nucleotide sequences of the coat protein gene (cp) available in the GenBank, new primers were designed. These primers amplified a 326 pb specific OFV fragment and were used for RT-PCR and as hybridization probes. The variability of a fragment of the cp of this virus was investigated by “single strad conformational polymorphism (SSCP)” and nucleotide sequencing. Forty eight samples of 18 genera of orchids were collected from Brazil, Costa Rica and Australia. The SSCP analysis resulted in six different haplotypes and demonstrated a clustering in samples based on geographical origin. Samples representing the different SSCP patterns were sequenced and compared with those available in the GenBank. The SSCP analysis proved to be efficient to provide preliminary information about OFV variability. However, only through nucleotide sequencing it was possible to determine the actual variability amongst the samples.