Contrasting physiological requirements for T. brucei survival between procyclic (vector) and bloodstream (mammal) forms necessitate different molecular processes and therefore changes in protein expression. Transcriptional regulation is unusual in T. brucei because the arrangement of genes is polycistronic; however, genes which are transcribed together are subsequently cleaved into separate mRNAs by trans-splicing and are individually regulated. During the process of trans-splicing, a 39-nucleotide splice-leader RNA is added to the 5´ end of mRNA. In this study, gene regulation in trypanosomes will be examined in the context of the 7-methylguanosine cap attached to the 5´ end of the splice-leader. Interestingly, in addition to the capping enzymes identified in other eukaryotes, trypanosomatids have an additional guanylyltransferase and methyltransferase in the form of a bifunctional enzyme (TbCGM1). TbCGM1 was found to be essential in bloodstream form T. brucei, although the purpose of this bifunctional capping enzyme remains unclear. Null mutants of a related enzyme, monomeric methyltransferase TbCMT1, did not show an effect on cell viability in culture, however, the enzyme proved to be important for virulence in vivo. Complementary to the study of T. brucei capping enzymes, we worked to develop a method to allow structural analysis of the 5´mRNA cap by mass spectrometry. Following pre-mRNA processing, regulation of the mature mRNAs is a tightly controlled cellular process. While multiple stage-specific transcripts have been identified, previous studies using RNA-seq found that the changes in overall transcript level do not necessarily reflect the abundance of the corresponding proteins. We hypothesized that in addition to mRNA stability, mRNA recruitment to ribosomes may play a significant role in the regulation of gene expression in T. brucei. To approach this question, we performed RNA-seq of total, subpolysomal, and polysomal mRNA. This transcriptomic data was then correlated with published proteomic studies to obtain a global picture of the relative translation efficiencies and their relationship to steady-state protein levels between bloodstream and procyclic form T. brucei.

Die Schlafkrankheit hat ihren Schrecken seit den Zeiten Robert Kochs und Paul Ehrlichs nicht verloren. Die zielgerichtete Entwicklung neuer Medikamente ist für die Menschen in den Endemiegebieten damals wie heute von elementarer Bedeutung. Die Naphtylisochinolin-Alkaloide stellen eine neue chemische Substanzklasse dar, die gute Kandidaten für die Entwicklung neuer Medikamente enthält. Mit GBAP 94 im speziellen liegt eine Substanz vor, die gute Startvorrausetzungen hierfür mitbringt. Diese sind eine sehr gute Wirksamkeit gegen Trypanosomen, gepaart mit einer hohen Selektivität durch einen sehr wahrscheinlich relativ spezifisch anti-trypanosomalen Wirkmechanismus. Die verwendeten Naphtylisochinolin-Alkaloide GBAP 94 und GBAP 146 wurden nach unterschiedlichen Gesichtspunkten ausgewählt. GBAP 94 wurde aufgrund seiner guten antitrypanosomalen Wirkung und seiner hohen Selektivität für Trypanosomen ausgewählt. Die IC50 liegt mit 0,383 µmol/l im Vergleich zu den aktuell verwendeten Medikamenten sehr niedrig. Die Selektivitätsindices (IC50 Trypanosoma brucei brucei / IC50 Makrophagen J774.1) mit 85,6 und (IC50 Try-panosoma brucei brucei / IC50 Leishmania major) mit 15,1 liegen in einem sehr günstigen Bereich. GBAP 146 wurde hauptsächlich wegen seiner guten Fluoreszenz-Eigenschaften ausgewählt. Die antitrypanosomale Aktivität ist mit einer IC50 von 0,289 µmol/l zwar sehr gut, eine große Selektivität ist aber nicht gegeben. Die beiden Alkaloide waren aufgrund ihrer Eigenfluoreszenz gut fluoreszenz-mikroskopisch in den Parasiten zu detektieren. Nach 10 min war in den ersten Trypanosomen die Anreicherung der Wirkstoffe erkennbar. Nach 30 min war bei fast allen Parasiten eine Färbung erkennbar. Die Wirkstoffe reicherten sich zunächst in mehreren kleinen Vakuolen an. Bei längeren Inkubationszeiten zeigte sich eine fast homogene Verteilung innerhalb des kompletten Parasiten. Durch-gängig ausgespart blieb eine vakuolische Struktur. Diese entwickelte oder vergrößerte sich im Verlauf der Inkubationszeit im vorderen Drittel des Parasiten, etwa im Bereich des Kinetoplasten. Diese Vakuole konnte auch lichtmikroskopisch in der Giemsa-Färbung nachgewiesen werden. Der Anteil der veränderten Trypanosomen lag bei diesen Untersuchungen nach 1 h bei 25,4%, stieg bis zum Zeitpunkt 2 h auf 46,6% und stabilisierte sich nach 4 h bei 44,8%. Die vakuolische Struktur führte durch ihre Vergrößerung zur zunehmenden Verplumpung der Trypanosomen bis zu einer kugelförmigen Zellform mit geisselartig-wirkender Flagelle. Aufgrund der veränderten Form wurden die Zellorganellen verdrängt. Dies konnte durch die Fluoreszenzmarkierung des Mitochondriums mit Rodamine B Hexylester und der sauren Kompartimente, besonders des Lysosoms, mit LysoTracker® gezeigt werden. Die Vakuolisierung von Trypanosomen im Zusammenhang mit Apoptose ist bekannt. Die neu entstehende Vakuole konnte weder mit LysoTracker® green, noch mit dem endosomalen Farbstoff FM 4-64 angefärbt werden. Damit können eine lysosomale und eine endosomale Herkunft der Vakuole ausgeschlossen werden. Eine genaue Klärung der Genese der Vakuole steht noch aus. In den Untersuchungen mit Annexin V und Propidium-Jodid im FACS® konnte gezeigt werden, dass die Wirkung der NIQs sehr wahrscheinlich Apoptose induziert. Annexin V ist auch bei Trypanosomen als Marker für Apoptose etabliert. Zudem zeigte sich ein Anstieg der Anzahl apoptotischer Trypanosomen mit Periode von 6 h – 8 h. Diese Dauer entspricht ungefähr der Dauer des trypanosomalen Zellzyklus. Ein Eingriff der NIQs in den Zellzyklus ist somit sehr wahrscheinlich. Eine Hemmung von Teilen des Zellzyklus ist als Auslöser für Apoptose bekannt. Über die genaue Zielstruktur der NIQs kann allerdings nur spekuliert werden. Die apotose-induzierende Wirkung anderer Alkaloide auf Trypanosomen ist inzwischen nachgewiesen. Ein weiteres Indiz ist, dass die Ergebnisse von Ponte-Sucre mit den NIQs bei Leishmanien ebenfalls in Richtung Apoptose weisen. / The trypanosomiasis is still an emerging problem in sub-Saharan Africa. Due to the limitations of the currently used drugs and emerging drug resistance, there is an urgent need for the target-oriented development of novel therapies. Naturally occurring naphthylisoquinoline alkaloids (NIQs), axially chiral acetogenic products derived from tropical plants, have been investigated for their activity against Trypanosoma brucei brucei TC 221. The NIQ N-(3'-Methoxyphenyl)-6,8-dimethoxy-1,3-dimethylisochinoliniumtetrafluoroborate seems to be quite specific antitrypanosomal agent. This compound shows a low IC50-value of 0.383 µmol/l against Trypanosoma brucei brucei TC 221 in comparison to the current drugs. For controls another NIQ, N-(4'-N'-Dansylaminophenyl)-6,8-dimethoxy-1,3-dimethylisochinoliniumtrifluoro-acetate, eflornithine an amphotericin B, witch is described to induce apoptosis in trypanosomes, were used. Both NIQ could be detected directly because of their self-fluorescence in the fluorescence-microscopy. After 10 min an accumulation in the first parasites could be detected. After 30 min almost all parasites show the compounds. After an initial accumulation in small vesicles the NIQ spread homogeneous over nearly the whole parasite. Only a vacuole was spared. This structure developed or increased during incubation time. It was located in the front part of the parasite near the kinetoplast. This vacuole could also be detected in light-microscopy of Giemsa-stained parasites. The fraction of the affected trypanosomes was after 1 h 25.4% and increased up to 46.6% after 2 h and stayed almost in this level (44.8% after 4 h). The increase of the vacuole induced a dumpier up to spherical shape. The organelles were displaced. This could be shown by fluorescence-labelled mitochondria, stained with rodamine-B-hexylester, and the acidic compartments, especially the lysosome stained with LysoTracker®. The vacuolisation of trypanosoma brucei is described during apoptosis. The staining of the developing vacuole wasn’t possible neither with LysoTracker® nor with the endosomal staining FM 4-64®. A lysosomal or endosomal origin of this vacuole could be excluded. The genesis of this vacuole needs further investigation. In the FACS®-investigations with annexin V and propidium-iodide staining we got strong hints that the NIQs induce apoptosis. Annexin V is established as a marker for apoptosis in trypanosome. We found an increase of apoptotic parasites in a 6 h – 8 h period. This is also the time for the trypanosomal cell cycle. NIQs seem to interfere with the cell cycle. This is descried from various authors as a trigger for apoptosis. The target structure is however still unknown. Results of other groups indicate an apoptosis-inducing effect of alkaloids in trypanosoma or leishmania.

Post-translational histone modifications (PTMs) such as methylation of lysine residues influence chromatin structure and function. PTMs are involved in different cellular processes such as DNA replication, transcription and cell differentiation. Deregulations of PTM patterns are responsible for a variety of human diseases including acute leukemia. DOT1 enzymes are highly conserved histone methyltransferases that are responsible for methylation of lysine 79 on histone H3 (H3K79). Most eukaryotes contain one single DOT1 enzyme, whereas African trypanosomes have two homologues, DOT1A and DOT1B, which methylate H3K76 (H3K76 is homologous to H3K79 in other organisms). DOT1A is essential and mediates mono- and di-methylations, whereas DOT1B additionally catalyzes tri-methylation of H3K76. However, a mechanistic understanding how these different enzymatic activities are achieved is lacking. This thesis exploits the fact that trypanosomes possess two DOT1 enzymes with different catalytic properties to understand the molecular basis for the differential product-specificity of DOT1 enzymes. A trypanosomal nucleosome reconstitution system was established to analyze methyltransferase activity under defined in vitro conditions. Homology modeling allowed the identification of critical residues within and outside the catalytic center that modulate product-specificity. Exchange of these residues transferred the product-specificity from one enzyme to the other and revealed regulatory domains adjacent to the catalytic center. This work provides the first evidence that few specific residues in DOT1 enzymes are crucial to catalyze methyl-state-specific reactions. These results have also consequences for the functional understanding of homologous enzymes in other eukaryotes. / Posttranslationale Histonmodifizierungen (PTMs), wie beispielsweise die Methylierung von Lysinseitenketten, beeinflussen maßgeblich die Struktur und Funktion von Chromatin. PTMs spielen eine wichtige Rolle in verschiedensten zellulären Prozessen, darunter DNA Replikation, Transkription oder Zelldifferenzierung. Darüber hinaus liegt ein verändertes PTM-Muster einer Vielzahl humaner Erkrankungen zugrunde, wie z.B. der akuten myeloischen Leukämie. DOT1-Enzyme sind hochkonservierte Histonmethyltransferasen, die für die Methylierung von Lysin 79 in Histon H3 (H3K79) verantwortlich sind. Im Gegensatz zu den meisten Eukaryoten, die lediglich ein einziges DOT1-Enzym besitzen, finden sich zwei homologe Proteine in afrikanischen Trypanosomen (DOT1A und DOT1B), die Lysin 76 in Histon H3 (H3K76) methylieren (H3K76 ist homolog zu H3K79 in anderen Organismen). DOT1A ist essentiell und katalysiert Mono- und Di-Methylierungen, wohin gegen DOT1B darüber hinaus eine Trimethylierung an H3K76 setzen kann. Derzeit fehlt jegliches mechanistische Verständnis darüber, wie beide Enzyme diese unterschiedliche Produktspezifität erreichen. Die vorliegende Dissertation macht sich den Umstand zunutze, dass Trypanosomen zwei DOT1-Methyltransferasen mit unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften besitzen, um Einblicke in die molekulare Grundlage der unterschiedlichen Produktspezifität zu erlangen. Zunächst wurde ein Rekonstitutionssystem für Nukleosomen aus Trypanosomen etabliert, das es ermöglichte die Methyltransferase-Aktivitäten unter definierten in vitro Bedingungen zu analysieren. Homologiemodelle erlaubten die Identifikation von wichtigen Aminosäurepositionen innerhalb und außerhalb des katalytischen Zentrums der Enzyme, die einen Einfluss auf die Produktspezifität haben. Ein Austausch der Aminosäuren an diesen Positionen führte zu einer Umwandlung der Produktspezifität und offenbarte gleichzeitig DOT1A- und DOT1B-spezifische regulatorische Domänen, die an das katalytische Zentrum angrenzen. Diese Arbeit liefert erste Hinweise, dass wenige maßgebliche Aminosäuren in DOT1-Enzymen für den H3K76-Methylierungsgrad während der Katalyse entscheidend sind. Darüber hinaus haben die hier dargestellten Ergebnisse ebenfalls Konsequenzen für das funktionale Verständnis der homologen Enzyme in anderen Eukaryoten.

The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the causal agent of sleeping sickness and besides its epidemiological importance it has been used as model organism for the study of many aspects of cellular and molecular biology especially the post-transcriptional control of gene expression. Several studies in the last 30 years have shown the importance of mRNA processing and stability for gene regulation. In T. brucei genes are unusually arranged in polycistronic transcription units (PTUs) and a coupled process of trans-splicing and polyadenylation produces the mature mRNAs. Both processes, mRNA processing and stability, cannot completely explain the control of gene expression in the different life cycle stages analyzed in T. brucei so far. In recent years, the relevance of expression regulation at the level of translation has become evident in other eukaryotes. Therefore, in the first part of my thesis I studied the impact of translational regulation by means of a genome-wide ribosome profiling approach. My data suggest that translational efficiencies vary between life cycle stages of the parasite as well as between genes within one life cycle stage. Furthermore, using ribosome profiling I was able to identify many new putative un-annotated coding sequences and to evaluate the coding potential of upstream open reading frames (uORF). Comparing my results with previously published proteomic and RNA interference (RNAi) target sequencing (RIT-seq) datasets allowed me to validate some of the new coding sequences and to evaluate their relevance for the fitness of the parasite. In the second part of my thesis I used the transcriptomic and translatomic profiles obtained from the ribosome profiling analysis for the identification of putative non-coding RNAs (ncRNAs). These results led to the analysis of the coding potential in the regions upstream and downstream of the expressed variant surface glycoprotein (VSG), which is outlined in the third part of the results section. The region upstream of the VSG, the co-transposed region (CTR), has been implicated in an increase of the in situ switching rate upon its deletion. The ribosome profiling results indicated moderate transcription but not translation in this region. These results raised the possibility that the CTR may be transcribed into ncRNA. Therefore, in the third part of my thesis, I performed a primary characterization of the CTR-derived transcripts based on northern blotting and RACE. The results suggested the presence of a unique transcript species of about 1,200 nucleotides (nt) and polyadenylated at the 3’-end of the sequence. The deletion of the CTR sequence promoting and increase of the in situ switching rates was performed around 20 years ago by means of inserting reporter genes. With the recent development of endonuclease-based tools for genome editing, it is now possible to delete sequences in a marker-free way. In the fourth part of my thesis, I show the results on the implementation of the highly efficient genome-editing CRISPR-Cas9 system in T. brucei using episomes. As a proof of principle, I inserted the sequence coding for the enhanced green fluorescent protein (eGFP) at the end of the SCD6 coding sequence (CDS). Fluorescent cells were observed as early as two days after transfection. Therefore, after the successful set up of the CRISPR-Cas9 system it will be possible to modify genomic regions with more relevance for the biology of the parasite, such as the substitution of codons present in gene tandem arrays. The implementation of ribosome profiling in T. brucei opens the opportunity for the study of translational regulation in a genome-wide scale, the re-annotation of the currently available genome, the search for new putative coding sequences, the detection of putative ncRNAs, the evaluation of the coding potential in uORFs and the role of unstranslated regions (UTRs) in the regulation of translation. In turn, the implementation of the CRISPR-Cas9 system offers the possibility to manipulate the genome of the parasite at a nucleotide resolution and without the need of including resistant makers. The CRISPR-Cas9 system is a powerful tool for editing ncRNAs, UTRs, multicopy gene families and CDSs keeping their endogenous UTRs. Moreover, the system can be used for the modification of both alleles after just one round of transfection and of codons coding for amino acids carrying post-translational modifications (PTMs) among other possibilities. / Trypanosoma brucei ist nicht nur als Erreger der Schlafkrankheit von großer epidemiologischer Bedeutung, sondern dient auch der Zell-­‐ und Molekularbiologie – insbesondere zur Erforschung der Genregulation auf posttranskriptionaler Ebene – als wichtiger Modellorganismus. In den vergangenen 30 Jahren konnten mehrere Forschungsarbeiten zeigen, dass mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung maßgeblich zur Regulation der Genexpression beitragen. Anders als in den meisten Eukaryoten sind die Gene in T. brucei in polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTUs) angeordnet. Die reife mRNA entsteht aus dem polycistronischen Transkript in einem gekoppelten Prozess aus Trans-­‐splicing und paralleler Polyadenylierung. Beide Vorgänge allein, mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung, reichen nicht aus, um die Regulation der Genexpression in T. brucei vollständing zu erklären und zusätzliche Mechanismen müssen wirksam sein. Daher habe ich im ersten Teil meiner hier vorliegenden Doktorarbeit die Genregulation auf Ebene der Translation mittels genomweitem Ribosome Profiling untersucht. Die dabei gewonnen Daten deuten darauf hin, dass die Translationseffizienzen nicht nur zwischen prozyklischen-­‐ und Blutstromformen des Parasiten differieren, sondern auch die Gene innerhalb eines Stadiums verschieden effizient translatiert werden. Zudem war es mir mit diesem Ansatz möglich, neue, noch nicht annotierte kodierende Sequenzen zu identifizieren und das Kodierungspotenzial der jeweils vorgelagerten offenen Leseraster (ORFs) zu evaluieren. Mithilfe bereits veröffentlichter Proteom-­‐ und RNA Interferenz-­‐ Studien (RIT-­‐seq) konnte ich einige der neu identifizierten kodierenden Sequenzen validieren und deren Bedeutung für die Fitness des Parasiten bestimmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die ermittelten Translations-­‐ und Transkriptionsprofile miteinander verglichen, um auf diese Weise mögliche nicht-­‐kodierende RNAs (ncRNAs) zu identifizieren. Dies führte zu einer eingehenderen Betrachtung der Kodierungspotenziale der dem exprimierten variablen Oberflächenproteins (VSG) vor-­‐ und nachgeschalteten Regionen. In früheren Arbeiten wurde bereits beschrieben, dass eine Deletion der dem VSG vorgelagerten, sogenannten co-­‐transposed region (CTR), vermehrt zu einer Aktivierung einer alternativen VSG Expressionsseite (in situ switches) führt. Ribosome Profiling zeigte, dass eben jede Regionen zwar moderat transkribiert, jedoch nicht translatiert werden. Da diese Ergebnisse vermuten ließen, dass die CTR für eine ncRNA kodiert, hab ich im dritten Teil meiner Arbeit die CTR Transkripte mittels Northern Blot und RACE weiter charakterisiert. Auf diese Weise konnte ich spezifische, 1200 Nukleotide (nt) lange und am 3`-­‐Ende polyadenylierte Transkripte nachweisen. Die bereits erwähnte Deletion der CTR verbunden mit einer erhöhten Rate an in situ switches wurde vor etwa 20 Jahren durch Insertion von Reportergenen durchgeführt. Heute ist es möglich mithilfe von Endonukleasen Genome ohne solche Marker zu editieren. So beschreibt der vierte Teil der Arbeit die Konstruktion von Episomen zur Etablierung und Anwendung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei. Als Machbarkeitsnachweis wurde die kodierende Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) am Ende des SCD6 Gens als Fusionsprotein inseriert. Grün fluoreszierende Zellen konnten bereits zwei Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden. Nachdem CRISPR-­‐Cas9 erfolgreich in T. brucei etabliert werden konnte, werde ich im Folgenden weitere relevante Regionen im Genom modifizieren und beispielsweise die Deletion zweier Histonvarianten durchführen. Die Ribosome Profiling Studie in T. brucei erlaubt es uns, genomweit Genregulation auf Ebene der Translation zu analysieren, das uns zurzeit vorliegende Genom zu re-­‐annotieren, neue kodierende Sequenzen wie auch ncRNAs zu identifizieren und den Einfluss nicht-­‐kodierender Sequenzen auf die Translation zu untersuchen. Gleichzeitig ermöglicht die Etablierung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei eine hochpräzise Manipulation des Genoms ohne den Einsatz von Resistenzmarkern. Auf diese Weise ist es möglich, Gene zu modifizieren und dabei die zugehörigen untranslatierten Bereiche (UTRs) zu erhalten, aber auch ncRNAs, UTRs und mehrfache Kopien eines Gens (gleichzeitig) zu editieren. Ebenso können einzelne Kodons in der Sequenz und somit posttranslational modifizierte Aminosäuren im Genprodukt verändert werden, was uns weitere Möglichkeiten zur Erforschung der Genregulation eröffnet.

Thesis (Ph.D.)--Murdoch University, 2005. / Thesis submitted to the Division of Health Sciences. Bibliography: leaves 141-163.

Thesis (Ph.D.) - University of Glasgow, 2007. / Ph.D. thesis submitted to the Division of Infection and Immunity, Institute of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, 2007. Includes bibliographical references.

Although F1-ATPase is extremely conserved among organisms, a putative subunit p18 was identified in Trypanosoma brucei F1-ATPase complex. To explore its function in the procylic, bloodstream and dyskinetoplastic trypanosomes, three different RNAi cell lines were created. Upon p18 silencing the F1-moiety structural integrity was impaired suggesting that p18 is indeed a bona fide subunit of this complex. Since F1-ATPase is crucial for the bloodstream form survival, its potential inhibitor from the 4-oxopiperidine-3,5-dicarboxylates class (JK-11) was examined. JK-11 inhibited growth of the bloodstream trypanosomes, decreased mitochondrial membrane potential and reduced ATPase and ATP synthase activity in mitochondrial lysates. Our results suggest that JK-11 may act on FoF1-ATP synthase/ATPase and its inhibition may contribute to the cytotoxicity of this drug.

The aim of this thesis was to investigate genes involved in the late steps of the Cytosolic Iron sulfur cluster Assembly (CIA) pathway in procyclic T. brucei, to determine their cellular localization and find their possible interaction partners and substrates.

Plasmodium spp. and Trypanosoma brucei spp. are protozoan parasites with complex lifecycles, each having to adapt to the diverse environments of their insect vector and mammalian host. Each has multiple developmental forms that differ in their morphology and metabolism. Differentiation between these forms is a tightly regulated and often synchronised process in response to changes in the parasite's environment. The molecular mechanisms by which they perceive and respond to such environmental changes are largely unknown. The Plasmodium and T. brucei genomes encode a homologue of the phylogenetically widespread GPR89 family of putative receptors or channels. The mammalian GPR89 homologue has been implicated in the regulation of Golgo acidification, whilst in plants it has been shown to be involved in G protein signally pathways. This study set out to characterise the Plasmodium and T. brucei GPR89 proteins in order to assess their potential role as environmental sensors. Bioinformatic analyses demonstrated that the GPR89 proteins are a highly divergent family of multi-transmembrane domain proteins that may perform a channel or transporter function. Several expression strategies were employed to evaluate the role of the GPR89 proteins. Functional insight was gained from the ectopic expression of both the T. brucei and Arabidopsis thaliana GPR89 proteins in T. Brucei cells. Over-expression of TbGPR98 causes premature stumpy formation in pleomorphic T. brucei cells. This phenotype was replicated by over-expression of a A. thaliana homologue in T. brucei despite signigicatnt sequence divergence. Furthermore, both were demonstrated to act on the same pathway as the putatuve RNA binding protein, RBP7 that was receontly identified in a genome-wide screen for components of the stumpy differentiation pathway. Hence, TbGPR89 is likely a compnent of the slender to stumpy differentiation pathway in bloodstream form trypanosomes and there appears to be functional complementarity between T. brucei and A. thaliana GPR89 proteins.

Two aspects of trypanosomiasis have been investigated in this study. First, molecular methods were applied to the diagnosis of T.evansi in camels in South Libya. The aim of the study was to determine if FTA card blood sampling and PCR amplification could detect parasites and this be used as tool for diagnosis and epidemiology. Targeted samples of 70 camels were identified on the basis of symptoms of infection and blood was collected on FTA cards. PCR primers and conditions for the amplification of T.evansi DNA were developed on the basis of the literature and a positive control clone grown in the laboratory. The assay found 84.3% of camel samples positive using TBR primers (177bp amplicon) and ITS nested primers (611-1513bp amplicons). This result demonstrated that Surra is endemic in this area, and that T.evansi was the species that was involved. The ITS and TBR loci in the parasites identified in Libya were almost identical to those previously reported in the genbank database, though with some polymorphisms. Dullness and emaciation were the clinical signs of camels infected by trypanosomes, and these two symptoms were significantly related to the 1200bp ITS nested PCR amplicon. These two symptoms can be thus used as a sign an initial diagnosis of T.evansi infection in camels. The second aspect of trypanosomiasis studied was the occurrence of endotoxaemia in infection. The first part of this research investigated endotoxin levels in clinical human African trypasnosomiasis using the Limulus Amoebocyte lysate assay. Endotoxin levels were significantly increased over control individuals in the plasma of T.b.rhodesiense patients. This endotoxaemia was unrelated to infection duration, parasitaemia or clinical stage but resolved after clearance of parasites by drug treatment. In the cerebrospinal fluid there was no significant difference in endotoxin level between early and late stage cases and no relationship to parasite loads. It is argued on the basis of the data that endotoxaemia in trypanosomiasis most likely results from increases in permeability of the gut to endotoxins from gram negative enter bacteria. This conclusion was further supported from a study using cell culture adapted T.brucei and secreted products which gave no evidence of any endotoxin activity. Also samples of an acute experimental mouse infection with T.brucei gave no endotoxin activity, suggesting that this phenomenon requires a more chronic infection in mice. No relationships were found between plasma or CSF endotoxin levels to neurological signs of infection. However the presence of a gross inflammatory clinical symptom, splenomegaly, was associated with endotoxaemia and the concentrations of 3 plasma cytokines associated with the immune response in trypanosome infection were associated with correlated to plasma endotoxin levels. In order to determine the nature of the endotoxin activity, a biosensor cell assay for LPS was used, based on human embryonic kidney cells transfected with TLR4/MD3 and a NF-κB induced alkaline phosphatase reporter gene. This assay revealed low or undetectable levels of LPS in clinical samples from T.b.rhodesiense patients, in mouse samples from T.b.brucei infections and in vitro cultured trypanosomes. This suggests that either the endotoxin activity detected using the LAL assay is an unconventional endotoxin signalling via a TLR4 independent pathway or that the human plasma was in some way toxic to the reporter cell and this requires further investigation. In conclusion, this study has provided the first clear evidence of an association of endotoxaemia and inflammatory responses in clinical African trypansomiasis and helps resolve the question of whether endotoxaemia is a parasite or host-microbiota related phenomenon.