Memoria (licenciado en ciencias jurídicas y sociales) / No autorizada por los autores para ser publicada a texto completo / Esta memoria pretende desentrañar misteriosos caminos para quienes optamos por la vía del Derecho, no sólo en el área de la ciencia médica, sino también incorporarlos al ámbito de la llamada Bio-jurídica. A la luz de la importancia que tendrá este tema en el futuro, exponemos, cómo podríamos llegar a disponer de nuestra carga genética y de nuestras células sexuales reproductoras, óvulo y espermio, llamadas genéricamente gametos humanos. Para ello proponemos en una primera parte, cómo ellos, que pertenecen o emanan del cuerpo humano, pueden desligarse y pasar pertenecer a otra persona; como los podemos defender en el ámbito constitucional, civil, penal e internacional; que naturaleza jurídica tienen, si pueden o no ser considerados bienes. Luego pedimos ayuda a la ciencia para que nos informe cómo se forman y los usos que se les puede dar de acuerdo al estado actual de la misma y que, hoy por hoy, tiene al mundo sumido en un total asombro y temor a lo desconocido. Todo esto con apoyo de la ética.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the present study, chick embryos, non treated and treated with busulfan during the period from 1 to 6 days of incubation (stages 5 to 30) were used. These embryos were transversally sectioned in different levels, according to migratory pathway of primordial germ cells. The sections were then stained: 1. by Haematoxilin and Eosin for morphological observation; 2. by Periodic Acid Schiff, for the study of interactive glycoproteins and identification of primordial germ cells; sulfated and non sulfated glycosaminoglycans were observed by Alcian Blue (pH 2,5 and pH 1,0, respectively)and collagen was observed by Sirius Red Technique. Migration of primordial germ cells has a continuous flux. The route begins in germinal crescent, passes into the blood vessels and then reaches the interstitium destined to the developing gonads, where primordial germ cells colonize. Along the route, it was noted that interactive glycoproteins reduce right after the beginning of the intersticial migration phase. The same happens with sulfated glycosaminoglycans, that it could be related to a mechanism of compensation on the cell migration. On the other hand, in busulfan treated embryos, the amount of sulfated glycosaminoglycans (supposed to be hialuronic acid) increases, and, also, compensates the migration. Atrophic gonads were seen in busulfan treated embryos. The quantity of collagen was not modified along the route. These results suggest that extracellular matrix compounds participate actively by modulating the migration of primordial germ cells. / O presente estudo constitui a realização de cortes histológicos em embriões de Gallus gallus domesticus L. não tratados e tratados com busulfan, durante o período de 1 a 6 dias (estádios 5 a 30 de HAMBURGER & HAMILTON, 1951) de incubação. Nestes embriões, foram realizados cortes transversais, em diferentes níveis, dependendo da rota migratória das células germinativas primordiais. Tais cortes foram corados pela Hematoxilina e Eosina-floxina para estudos morfológicos; pelo método do ácido periódico-reativo de Schiff para a marcação das células germinativas primordiais e o estudo das glicoproteínas interativas; pelo método do Alcian Blue para observar glicosaminoglicanas sulfatadas e não sulfatadas e pelo Picrosirius para observar o colágeno em embriões tratados e não tratados com busulfan. Observou-se que as células germinativas primordiais seguem um fluxo contínuo na sua rota migratória do estádio 5 a 30 de HAMBURGER & HAMILTON, 1951. A rota inicia-se no crescente germinativo, passa pelos vasos sanguíneos e posteriormente pelo interstício para, por fim, colonizar o esboço gonadal. Ao longo da rota migratória notou-se que as glicoproteínas interativas diminuem logo após o início da fase intersticial de migração, o mesmo acontecendo com as glicosaminoglicanas sulfatadas, o que pôde ser interpretado como um mecanismo compensatório na velocidade de migração das células. Já nos embriões tratados com busulfan, embora as glicoproteínas interativas tenham diminuído em tal etapa, a quantidade suposta de ácido hialurônico aumentada, também compensa a velocidade de migração. As gônadas, frente ao busulfan, mostraram-se atrofiadas. A quantidade de colágeno permaneceu inalterada em toda a rota migratória com ou sem o tratamento com o busulfan. Estes resultados sugerem uma participação ativa de componentes da matriz extracelular como moduladores da migração das células germinativas primordiais ao longo do seu trajeto migratório.

Orientador: Francisco Eduardo Martinez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:26:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Segatelli_TaniaMara_D.pdf: 2722114 bytes, checksum: 42553c00f75889ad9e7da916ef3940bd (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O gerbilo (Meriones unguiculatus) é um roedor nativo das regiões áridas da Mongólia e China, é de especial interesse em pesquisas biomédicas e tem sido criado em laboratório desde 1960. Estudos sobre a estrutura e função do testículo do gerbilo são raros, em especial sobre a espermatogênese. O presente trabalho é o primeiro a realizar uma investigação mais detalhada sobre a duração do ciclo espermatogênico e analisar morfométrica e funcionalmente o testículo do gerbilo. Através da técnica de marcação com 3H-timidina, a duração do ciclo do epitélio seminífero foi estimada em 10,55 :f: 1,0 dias e a duração total do processo espermatogênico foi de 47,47 dias, considerando que 4,5 ciclos são necessários para completar o processo. Os compartimentos tubular e intersticial ocuparam volume de 92% e 8%, respectivamente. Baseado no volume ocupado pelo compartimento tubular no parênquima testicular e no diâmetro do túbulo seminífero, aproximadamente 10 metros de túbulos seminíferos foram encontrados por testículo e 18 metros por grama de testículo no gerbilo. Cerca de 12 espermatócitos primários foram formados para cada espermatogônia do tipo AI. O índice meiótico observado foi de 2,8, representando 30% de perdas celulares durante as divisões meióticas. O número de células de Sertoli por grama de testículo foi de 28 milhões, com capacidade de suporte individual de 21 células germinativas. A produção espermática diária por grama de testículo foi de 33 milhões, sugerindo alta eficiência espermatogênica nessa espécie. O gerbilo pode ser utilizado como modelo para futuras investigações do processo espermatogênico / Abstract: The gerbil (Meriones unguiculatus) is a rodent native of the arid regions of Mongolia and China, is of special interest in biomedical research and has been bred in laboratory since 1960. Studies on the structure and function of the gerbil testis are sporadic and, moreover those on spermatogenesis are rare. This is the first study to perform a more detailed investigation about duration of the spermatogenic cycle and morphometric and functional analysis of the gerbil testis. Through 3H-thymidine injection tecnic, the mean duration of seminiferous epithelium cyc1e was determined to be 10.55 :t 1.0 days and the total duration of spermatogenesis based on 4.5 cyc1es was 47.47 days. The volume density of tubular and interstitial compartments was approximately 92% and 8%, respectively. Based on the volume of the testis parenchyma and the volume occupied by seminiferous tubules in the testis and the tubular diameter, about 9 and 18 meters of seminiferous tubules were found per testis and per gram of testis, respectively. About 12 primary spermatocytes were formed for each type A1 spermatogonia. The meiotic index was 2.8. This result shows that 30% of cell loss occurs during the two meiotic divisions. The number of Sertoli cell per gram of the testis was 28 million and the supporting capacity was 21 germ cel1. The daily sperm production per gram of the testis was 33 million. This value suggest high spermatogenic efficiency in this specie. The gerbil could be utilized as an animal model for future investigation of spermatogenic process / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

As células germinativas primordiais (CGPs) são as precursoras dos gametas, capazes de gerar um novo indivíduo os quais transmitirão os materiais genéticos para as futuras gerações. Normalmente, a linha germinal de mamífero é determinada por fatores genéticos e epigenéticos que possuem funções essenciais para guiar na direção e desenvolvimento das CGPs, bem como das células germinativas embrionárias (CGEs). A reprogramação epigenética é fundamental para a regulação do genoma durante o desenvolvimento das células germinativas responsáveis por originar a linhagem gametogênica nos mamíferos. A metilação e desmetilação em CGPs são um evento único, essencial para apagar a memória epigenética e também prevenir transmissões de epimutações para a próxima geração. Assim, o completo entendimento das vias e mecanismos para a migração inicial e diferenciação destas células em CGEs podem ser importantes para identificar e corrigir falhas possíveis nesses processos, o que será importante, no futuro, para o desenvolvimento e desempenho reprodutivo. A maioria dos estudos com CGPs e CGEs é realizado em camundongos, porém nem sempre esta espécie torna-se o melhor modelo de estudo quando se quer transpor esses conhecimentos a humanos. O cão doméstico (Canis lúpus familiaris) apresenta-se como um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento em mamíferos, pois possui inúmeras similaridades com a bioquímica, fisiologia e genética. Deste modo, torna-se interessante expandir os estudos sobre as CGPs e CGEs na espécie canina, a fim de mostrar a importância de diferentes modelos que se assemelham a seres humanos. Portanto, objetiva-se, nesta proposta, identificar qual é a dinâmica de marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos que são importantes para o desenvolvimento das CGPs e CGEs caninas. Para tal procedimento, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira, consiste no processo in vivo, desde o desenvolvimento inicial do embrião até a completa formação da crista gônadal. Análises de RTq-PCR e imunofluorescência para marcadores pluripotentes POU5F1 (OCT4) e NANOG, germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2 foram realizados para criar um perfil de genes que são importantes para o desenvolvimento das CGPs caninas. Prosseguiu-se para a segunda fase in vitro, que incide na derivação e caracterização das CGEs caninas. Ensaios de Fosfatase Alcalina, imunofluorescência para os marcadores: pluripotente POU5F1 (OCT4), germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA), mesodérmico THY-1 (CD90) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2, RT-qPCR para os genes NANOG e DDX4 e formação de teratoma foram efetivados para comprovar a linhagem de células CGEs. Como resultado in vivo, percebe-se que diferentes padrões de marcações e genes foram expressos nas CGPs, comprovando que a espécie canina se assemelha mais com os humanos do que com os camundongos. Os resultados in vitro mostraram que foi possível derivar as células CGEs e que estas conseguem reter sua pluripotencialidade e que diminuem a expressão dos genes germinativos. Porém, essas células tendem a se diferenciar em outros tecidos somáticos, mesmo com a adição de suplementos, fato também notado em CGEs humanas. / Primordial germ cells (PGCs) are known as the only cells capable of generating a new individual, they originate the gametes which then will transmit genetic material to future generations. Normally, the mammalian germ line is determined by genetic and epigenetic factors that have essential functions to guide the direction and development of PGCs as well as embryonic germ cells (EGCs). Epigenetic reprogramming is fundamental for the regulation of the genome during the development of the germ cells responsible for originating the gametogenic lineage in mammals. Methylation and demethylation in PGCs is a unique event, essential for erasing epigenetic memory and also preventing transmissions of epimutations to the next generation. Thus, the understanding of the patterns of differentiation of PGCs in EGCs can be important in identifying and correcting possible failures in these processes, which will be important in the future for development and reproductive performance. Most of the studies with PGCs in EGCs are carried out in mice, but this species is not always the best model of study when transposing this knowledge to humans. In canines, no study has ever been reported on canine PGCs and maybe the Canine species has become interesting as a new animal model for studies. It is known that the study material of human embryos are scarce samples and difficult to obtain, so it is necessary to use other animal models, such as the Canids, which also resemble humans. Dogs were the first fundamental models for the development of bone marrow transplantation in humans, but also made valuable contributions to the development of therapies for cardiovascular and orthopedic diseases. Then, it has become interesting to expand the studies on PGCs in the canine species in order to show the importance of different models that might resemble humans. Therefore, we had how proposal identify which were pluripotent, germinative and epigenetic markers that are important for the development of PGCs and canine EGCs. It research was divided into two phases: the first consists of the in vivo process, from the initial development of the embryo to the complete formation of the gonadal ridge. We analyzed through the techniques of real-time PCR (RT-qPCR) and immunofluorescence for pluripotent markers POU5F1 (OCT4) and NANOG, germline DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2 were performed to create a profile of genes that are important for the development of canine PGCs. We proceeded to the second in vitro phase, which focuses on the derivation and characterization of canine EGCs. Alkaline Phosphatase (AP), immunofluorescence for the markers: pluripotent POU5F1 (OCT4), germinative DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA), mesodermal THY-1 (CD90) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2. We also analyzed RT-qPCR for NANOG and DDX4 genes and teratoma formation were performed to prove the EGCs cell lineage. As a result in vivo, different marking patterns and genes had been expressed in CGPs, proving that the canine species is more similar to humans than to mice. The in vitro results showed that it was possible to derive the EGCs and that they are able to retain their pluripotency and decrease the expression of the germinative genes. However, these cells continue to differentiate into other somatic tissues, even with the addition of supplements, a fact also noted in human CGEs.

As células germinativas primordiais (CGPs) são as precursoras dos gametas, capazes de gerar um novo indivíduo os quais transmitirão os materiais genéticos para as futuras gerações. Normalmente, a linha germinal de mamífero é determinada por fatores genéticos e epigenéticos que possuem funções essenciais para guiar na direção e desenvolvimento das CGPs, bem como das células germinativas embrionárias (CGEs). A reprogramação epigenética é fundamental para a regulação do genoma durante o desenvolvimento das células germinativas responsáveis por originar a linhagem gametogênica nos mamíferos. A metilação e desmetilação em CGPs são um evento único, essencial para apagar a memória epigenética e também prevenir transmissões de epimutações para a próxima geração. Assim, o completo entendimento das vias e mecanismos para a migração inicial e diferenciação destas células em CGEs podem ser importantes para identificar e corrigir falhas possíveis nesses processos, o que será importante, no futuro, para o desenvolvimento e desempenho reprodutivo. A maioria dos estudos com CGPs e CGEs é realizado em camundongos, porém nem sempre esta espécie torna-se o melhor modelo de estudo quando se quer transpor esses conhecimentos a humanos. O cão doméstico (Canis lúpus familiaris) apresenta-se como um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento em mamíferos, pois possui inúmeras similaridades com a bioquímica, fisiologia e genética. Deste modo, torna-se interessante expandir os estudos sobre as CGPs e CGEs na espécie canina, a fim de mostrar a importância de diferentes modelos que se assemelham a seres humanos. Portanto, objetiva-se, nesta proposta, identificar qual é a dinâmica de marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos que são importantes para o desenvolvimento das CGPs e CGEs caninas. Para tal procedimento, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira, consiste no processo in vivo, desde o desenvolvimento inicial do embrião até a completa formação da crista gônadal. Análises de RTq-PCR e imunofluorescência para marcadores pluripotentes POU5F1 (OCT4) e NANOG, germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2 foram realizados para criar um perfil de genes que são importantes para o desenvolvimento das CGPs caninas. Prosseguiu-se para a segunda fase in vitro, que incide na derivação e caracterização das CGEs caninas. Ensaios de Fosfatase Alcalina, imunofluorescência para os marcadores: pluripotente POU5F1 (OCT4), germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA), mesodérmico THY-1 (CD90) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2, RT-qPCR para os genes NANOG e DDX4 e formação de teratoma foram efetivados para comprovar a linhagem de células CGEs. Como resultado in vivo, percebe-se que diferentes padrões de marcações e genes foram expressos nas CGPs, comprovando que a espécie canina se assemelha mais com os humanos do que com os camundongos. Os resultados in vitro mostraram que foi possível derivar as células CGEs e que estas conseguem reter sua pluripotencialidade e que diminuem a expressão dos genes germinativos. Porém, essas células tendem a se diferenciar em outros tecidos somáticos, mesmo com a adição de suplementos, fato também notado em CGEs humanas. / Primordial germ cells (PGCs) are known as the only cells capable of generating a new individual, they originate the gametes which then will transmit genetic material to future generations. Normally, the mammalian germ line is determined by genetic and epigenetic factors that have essential functions to guide the direction and development of PGCs as well as embryonic germ cells (EGCs). Epigenetic reprogramming is fundamental for the regulation of the genome during the development of the germ cells responsible for originating the gametogenic lineage in mammals. Methylation and demethylation in PGCs is a unique event, essential for erasing epigenetic memory and also preventing transmissions of epimutations to the next generation. Thus, the understanding of the patterns of differentiation of PGCs in EGCs can be important in identifying and correcting possible failures in these processes, which will be important in the future for development and reproductive performance. Most of the studies with PGCs in EGCs are carried out in mice, but this species is not always the best model of study when transposing this knowledge to humans. In canines, no study has ever been reported on canine PGCs and maybe the Canine species has become interesting as a new animal model for studies. It is known that the study material of human embryos are scarce samples and difficult to obtain, so it is necessary to use other animal models, such as the Canids, which also resemble humans. Dogs were the first fundamental models for the development of bone marrow transplantation in humans, but also made valuable contributions to the development of therapies for cardiovascular and orthopedic diseases. Then, it has become interesting to expand the studies on PGCs in the canine species in order to show the importance of different models that might resemble humans. Therefore, we had how proposal identify which were pluripotent, germinative and epigenetic markers that are important for the development of PGCs and canine EGCs. It research was divided into two phases: the first consists of the in vivo process, from the initial development of the embryo to the complete formation of the gonadal ridge. We analyzed through the techniques of real-time PCR (RT-qPCR) and immunofluorescence for pluripotent markers POU5F1 (OCT4) and NANOG, germline DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2 were performed to create a profile of genes that are important for the development of canine PGCs. We proceeded to the second in vitro phase, which focuses on the derivation and characterization of canine EGCs. Alkaline Phosphatase (AP), immunofluorescence for the markers: pluripotent POU5F1 (OCT4), germinative DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA), mesodermal THY-1 (CD90) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2. We also analyzed RT-qPCR for NANOG and DDX4 genes and teratoma formation were performed to prove the EGCs cell lineage. As a result in vivo, different marking patterns and genes had been expressed in CGPs, proving that the canine species is more similar to humans than to mice. The in vitro results showed that it was possible to derive the EGCs and that they are able to retain their pluripotency and decrease the expression of the germinative genes. However, these cells continue to differentiate into other somatic tissues, even with the addition of supplements, a fact also noted in human CGEs.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El pollo (Gallus domesticus) es muy utilizado para el estudio de la embriología. La línea germinal compuesta por las células germinales primordiales (CGP) aparece en el embrión desde las 18 horas de incubación, la cuales comienzan a migrar dirigiéndose hacia el área ventromedial de la superficie del mesonefros, por medio de los vasos sanguíneos incipientes, pasando a ser parte fundamental del desarrollo de esta. Las hembras solo desarrollan la gónada izquierda mientras que la derecha degenera en el proceso de la embriogénesis, los machos desarrollan un par de gónadas igualmente funcionales, esto ocurre desde temprano en el desarrollo, (día 5). El proceso por el cual ocurre este fenómeno aun no esta claro , existiendo diversas teorías que lo explican, como hormonales, factores del crecimiento, entre otras, algunas muestran que el retroceso de la gónada derecha ocurre tempranamente en el desarrollo y otras de forma tardía como a los 17 días de incubación . El objetivo del presente trabajo fue conocer y describir etapas del desarrollo gonádico relacionadas a horas de incubación demostrativas de este proceso. Además de tratar de establecer una relación entre la llegada de células germinales a la futura gónada y su posterior desarrollo. El modelo experimental utilizado consistió en 30 huevos fértiles de pollo (Gallus domesticus), separados en 5 grupos de 6 huevos cada uno de acuerdo a horas de incubación, serán de 96 (grupo1) 120 (grupo2), 160 (grupo 3), 192 (grupo 4) y 208 horas de incubación (grupo5), de acuerdo a la tabla de Hamilton y Hamburger, a cada grupo se le realizaron dos tinciones: técnica histológica de hematoxilina eosina para identificar estructuras y la técnica histoquímica de PAS para identificar las CGP. Los resultados obtenidos indican que ya desde temprano en el desarrollo (Día 4) existe la tendencia de las células germinales de dirigirse hacia la cresta genital izquierda, independiente del futuro sexo del embrión, tendencia que se ve claramente hasta el establecimiento de la gónada ya diferenciada a partir del día 7 del desarrollo, donde en la gónada derecha de la hembra se encuentran una menor cantidad de células germinales y esta comienza a desaparecer. Además se observan asimetrías en otras estructuras como el mesogastrio que presenta un tejido mesenquimático muy laxo y con muchos espacios intercelulares al lado derecho y más denso al lado izquierdo. También el epitelio celómico presenta asimetrías en la altura de sus células, donde el esbozo gonádico derecho esta revestido por epitelio cúbico, mientras que el lado izquierdo presenta un epitelio cilíndrico. Esta tesis constituye un aporte al conocimiento de las asimetrías corporales de los cordados, y permite conocer el momento propicio (el día 6 de incubación) y el lugar adecuado (mesenterio dorsal) para el aislamiento de CGP y su posterior cultivo in Vitro, con los fines de obtener células pluripotenciales las cuáles presentan un interés para la investigación con fines productivos

Os transplantes de células germinativas e enxertos de testículo podem ser aplicados na reprodução de espécies comerciais e na conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, a maior limitação dos transplantes está na sua limitada eficiência, devido à baixa porcentagem de hospedeiros capazes de gerar gametas derivados do doador e da rejeição de enxertos de testículo alogênicos após poucas semanas de sua implantação. O sistema imunológico dos hospedeiros podem estar envolvidos na baixa de eficiência dos transplantes e na rejeição dos enxertos. Desta forma, este trabalho buscou verificar se a administração de drogas imunossupressoras como o tacrolimus e ciclosporina em emulsão poderiam ser utilizados para prolongar a viabilidade de enxertos de testículo em trutas arco-íris. Na primeira parte, experimentos in vitro com leucócitos do sangue periférico demonstraram que ambos o tacrolimus e a ciclosporina impedem a proliferação celular mesmo sob estímulo proliferativo da concanavalina. Nos ensaios in vivo, ambas as doses de tacrolimus (0,5 e 1,5 mg/kg) e a mais baixa de ciclosporina (20 mg/kg) inibiram significativamente a expressão de il2 no rim cefálico três dias após a injeção. Já a dose de 40 mg/kg de ciclosporina inibiu a expressão de il2 por até sete dias após a injeção. Na segunda parte, enxertos alogênicos de testículo foram realizados em animais tratados semanalmente com emulsões de tacrolimus. As análises histológicas (coloração H.E.) e as de RT-PCR (vasa e txdnc6) demonstraram a presença de espermatogônias na primeira semana e indicaram a presença de espermátides/espermatócitos na quinta semana, respectivamente, em alguns animais do grupo tratado com a dose de 0,5 mg/kg de tracrolimus. No grupo tratado com a dose mais alta de tacrolimus (1,5 mg/kg) e no grupo controle (sem imunossupressor), células germinativas ou marcadores destas não foram detectados. Estes resultados, portanto, fazem do tacrolimus um imunossupressor promissor para utilização em enxertos alogênicos e também em transplantes de células germinativas de truta arco-íris. A administração concomitante de um outro imunossupressor conjugado ao tacrolimus (na baixa dosagem) para inibir duas ou mais vias de ativação do sistema imunológico, conforme utilizado em transplantes de órgãos em humanos, pode ser uma alternativa para otimizar os efeitos imunossupressivos nos animais receptores. / Germ cell transplantation and testis graft can be applied for the reproduction of commercial or endangered species. However, mechanisms of rejection from the host immune system might limit the production of surrogate gametes and progeny after transplantation and induce rejection of testis allografts within few weeks. In this work, we aimed to administer immunosuppressants-containing emulsions in order to verify whether they are capable to prevent immune rejection and promote testis allograft survival in rainbow trout. In the first part of this study, it was demonstrated in vitro that tacrolimus and cyclosporine were able to inhibit leucocyte proliferation even under concanavalin-induced mitotic stimulation. In in vivo experiments, both dosage of tacrolimus (0,5 and 1,5 mg/kg) and a lower of cyclosporine (20 mg/kg) inhibited significantly the expression of il2 in head kidney at three days post-injection. A higher dosage of cyclosporine (40 mg/kg) was able to inhibit il2 expression for up to seven days post-injection. In the second part, testis allografts were conducted in fish treated weekly with tacrolimus-containing emulsions. Histological (H.E. staining) and RT-PCR (vasa and txdnc6) analysis demonstrated the presence of spermatogonias in the first week and indicated the presence of spermatids/spermatocytes in the fifth week, respectively, in some animals treated with 0,5 mg/kg of tacrolimus. In the group treated with the highest tacrolimus dose (1,5 mg/kg) and in the control group (without immunosupressant), no germ cells or their respective markers were detected. These results suggest that tacrolimus comprise a promising immunosuppressant, with applications to testis allografts or germ cell transplantation in rainbow trout. Co-administration combining tacrolimus (at lower dose) with other immunosuppressive drugs for inhibiting more than two activation pathways of the immune system, as done in human organ transplantation, can be an alternative to optimize the immunossupressive effects in host organisms.

Introdução: a alta prevalência do câncer e o aumento significativo da sobrevivência em longo prazo geraram interesse quanto à preservação da fertilidade em mulheres jovens expostas a quimioterapia e radioterapia. Neste sentido estudos de congelamento de tecido ovariano para posterior transplante, abriram uma nova perspectiva de aplicação no tratamento e prevenção da infertilidade feminina. Objetivos: comparar dois protocolos de congelamento de tecido ovariano, um lento não automatizado e um por vitrificação, com o intuito de avaliar a viabilidade dos tecidos para posterior transplante autólogo. Método: Foram utilizadas 30 camundongos fêmea CF1 com aproximadamente 8 semanas e pesando 29,29g±2,9. •Os ovários extraídos foram vitrificados ou congelados, mantidos em nitrogênio líquido por 30 dias e descongelados. Após o descongelamento, o ovário esquerdo foi destinado às análises histológicas e caracterização por imuno histoquímica para o marcador mouse vasa homologue (MVH) e o ovário direito foi utilizado para os testes de viabilidade celular com exclusão por azul de trypan. Resultados: Nas análises de Hematoxilina e Eosina (HE) foram contados folículos primordiais, primários, pré-antrais e antrais. Não houve diferença significativa na proporção de folículos primordiais, primários e pré-antrais após descongelamento entre os grupos testados. A contagem de folículos antrais foi significativamente maior no grupo de vitrificação (p = 0,004). No ensaio de imunohistoquímica para o marcador MVH, folículos MVH + e MVH- foram contados e comparados com o número total de folículos. O grupo congelamento lento apresentou maior número de células não marcadas (p = 0,012). Conclusão: Embora ambos os protocolos tenham apresentado resultados semelhantes na análise histológica das contagens foliculares, o protocolo de vitrificação foi significativamente melhor para preservar a população de células tronco ovarianas. / Introduction: The high prevalence of cancer and the significant increase in long-term survival have generated interest as the preservation of fertility in young women exposed to chemotherapy and radiotherapy. Experimental techniques have been tried in an attempt to reverse the ovarian failure induced by these treatments. In this regard studies of ovarian tissue freezing for subsequent transplantation disclose a new application perspective in the treatment and prevention of female infertility. Objective: two ovarian tissue freezing protocols were tested, a non-automated slow-freezing and by vitrification, in order to assess the viability of the tissues for subsequent autologous transplantation. Methods: as ovaries donors, were used 30 female CF1 mice approximately 8 weeks and weighing 29,29g±2,9. • The ovaries were vitrified or frozen, stored in liquid nitrogen for 30 days and thawed. After thawing, the left ovary was intended for histological and immunohistochemical characterization by histochemical marker for MVH and right ovary was used for the tests with cell viability by trypan blue exclusion. Results: In HE slides was counting primordial, primary, pre antral and antral follicles. No significant difference was found in the proportion of high-quality primordial, primary and pre antral follicles after thawing/warming in the slow-freezing and vitrification group, respectively. The antral follicle counting was significant higher in vitrification group (p=0,004). In immunohistochemistry assay for MVH Antibody , MVH+ and MVH- follicles were counted and compared with the total number of follicles and slow freeze group had a higher number of not marked cells (p=0,012). Conclusion: Although both protocols showed similar results in the histological analysis for follicular counts, the vitrification protocol was significantly better for preserve the ovarian stem cell population.

Introdução: a alta prevalência do câncer e o aumento significativo da sobrevivência em longo prazo geraram interesse quanto à preservação da fertilidade em mulheres jovens expostas a quimioterapia e radioterapia. Neste sentido estudos de congelamento de tecido ovariano para posterior transplante, abriram uma nova perspectiva de aplicação no tratamento e prevenção da infertilidade feminina. Objetivos: comparar dois protocolos de congelamento de tecido ovariano, um lento não automatizado e um por vitrificação, com o intuito de avaliar a viabilidade dos tecidos para posterior transplante autólogo. Método: Foram utilizadas 30 camundongos fêmea CF1 com aproximadamente 8 semanas e pesando 29,29g±2,9. •Os ovários extraídos foram vitrificados ou congelados, mantidos em nitrogênio líquido por 30 dias e descongelados. Após o descongelamento, o ovário esquerdo foi destinado às análises histológicas e caracterização por imuno histoquímica para o marcador mouse vasa homologue (MVH) e o ovário direito foi utilizado para os testes de viabilidade celular com exclusão por azul de trypan. Resultados: Nas análises de Hematoxilina e Eosina (HE) foram contados folículos primordiais, primários, pré-antrais e antrais. Não houve diferença significativa na proporção de folículos primordiais, primários e pré-antrais após descongelamento entre os grupos testados. A contagem de folículos antrais foi significativamente maior no grupo de vitrificação (p = 0,004). No ensaio de imunohistoquímica para o marcador MVH, folículos MVH + e MVH- foram contados e comparados com o número total de folículos. O grupo congelamento lento apresentou maior número de células não marcadas (p = 0,012). Conclusão: Embora ambos os protocolos tenham apresentado resultados semelhantes na análise histológica das contagens foliculares, o protocolo de vitrificação foi significativamente melhor para preservar a população de células tronco ovarianas. / Introduction: The high prevalence of cancer and the significant increase in long-term survival have generated interest as the preservation of fertility in young women exposed to chemotherapy and radiotherapy. Experimental techniques have been tried in an attempt to reverse the ovarian failure induced by these treatments. In this regard studies of ovarian tissue freezing for subsequent transplantation disclose a new application perspective in the treatment and prevention of female infertility. Objective: two ovarian tissue freezing protocols were tested, a non-automated slow-freezing and by vitrification, in order to assess the viability of the tissues for subsequent autologous transplantation. Methods: as ovaries donors, were used 30 female CF1 mice approximately 8 weeks and weighing 29,29g±2,9. • The ovaries were vitrified or frozen, stored in liquid nitrogen for 30 days and thawed. After thawing, the left ovary was intended for histological and immunohistochemical characterization by histochemical marker for MVH and right ovary was used for the tests with cell viability by trypan blue exclusion. Results: In HE slides was counting primordial, primary, pre antral and antral follicles. No significant difference was found in the proportion of high-quality primordial, primary and pre antral follicles after thawing/warming in the slow-freezing and vitrification group, respectively. The antral follicle counting was significant higher in vitrification group (p=0,004). In immunohistochemistry assay for MVH Antibody , MVH+ and MVH- follicles were counted and compared with the total number of follicles and slow freeze group had a higher number of not marked cells (p=0,012). Conclusion: Although both protocols showed similar results in the histological analysis for follicular counts, the vitrification protocol was significantly better for preserve the ovarian stem cell population.

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