O estudo investigou a influência do fator de transformação de crescimento beta1 (TGFb1) sobre células osteogênicas induzidas com fatores mineralizantes (dexametasona Dex), comparando a viabilidade e a proliferação celular, a mineralização, e a expressão de proteínas não colágenas da matriz osteopontina (OPN), sialoproteína óssea (BSP) e fibronectina (FN). A morfologia foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (MET). O TGFb1 diminuiu a viabilidade e a proliferação celular, mesmo com Dex. A mineralização da matriz foi positivo apenas no grupo tratado com Dex, e negativo nos grupos tratados TGFb1 e TGFb1+Dex. OPN e BSP não foram imunoreativas apenas para o controle negativo, já a FN foi imunoexpressa em todos os grupos. A mineralização foi confirmada, tanto no controle positivo quanto no tratado com Dex, e alterações morfológicas foram observadas nas células tratadas com TGFb1 e TGFb1+Dex, através da MET. Esse estudo mostrou que TGFb1 inibe a mineralização, alterando a viabilidade e proliferação, bem como a morfologia celular, mesmo quando tratadas com Dex. / The study investigated the influence of transforming growth factor beta1 (TGFb1) on osteogenic cells induced with mineralizing factors (dexamethasone Dex), comparing the viability and proliferation cellular, the formation of mineral nodules in vitro, and the expression of the noncollagenous matrix proteins osteopontin (OPN), bone sialoprotein (BSP), and fibronectin (FN). The morphology was examined by transmission electron microscopy (TEM). The TGFb1 decreased the viability and proliferation cellular, even when combined with Dex. The mineralization of matrix was positive only in the group treated with Dex, and negative in the groups treated with TGFb1 and TGFb1+Dex. OPN and BSP were not immunoreactive only negative, already the FN was immunoreactive in all groups.The mineralizing was confirmed in the positive control and Dex, through TEM. Some morphological changes were seen in cells treated with TGFb1 and TGFb1+Dex. This study showed that TGFb1 inhibits the mineralization, changing the viability, proliferation and cell morphology, even when treated with Dex.

Tese de doutoramento. Ciências de Engenharia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Université Victor Segalen Bordeaux 2. 2008

O estudo investigou a influência do fator de transformação de crescimento beta1 (TGFb1) sobre células osteogênicas induzidas com fatores mineralizantes (dexametasona Dex), comparando a viabilidade e a proliferação celular, a mineralização, e a expressão de proteínas não colágenas da matriz osteopontina (OPN), sialoproteína óssea (BSP) e fibronectina (FN). A morfologia foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (MET). O TGFb1 diminuiu a viabilidade e a proliferação celular, mesmo com Dex. A mineralização da matriz foi positivo apenas no grupo tratado com Dex, e negativo nos grupos tratados TGFb1 e TGFb1+Dex. OPN e BSP não foram imunoreativas apenas para o controle negativo, já a FN foi imunoexpressa em todos os grupos. A mineralização foi confirmada, tanto no controle positivo quanto no tratado com Dex, e alterações morfológicas foram observadas nas células tratadas com TGFb1 e TGFb1+Dex, através da MET. Esse estudo mostrou que TGFb1 inibe a mineralização, alterando a viabilidade e proliferação, bem como a morfologia celular, mesmo quando tratadas com Dex. / The study investigated the influence of transforming growth factor beta1 (TGFb1) on osteogenic cells induced with mineralizing factors (dexamethasone Dex), comparing the viability and proliferation cellular, the formation of mineral nodules in vitro, and the expression of the noncollagenous matrix proteins osteopontin (OPN), bone sialoprotein (BSP), and fibronectin (FN). The morphology was examined by transmission electron microscopy (TEM). The TGFb1 decreased the viability and proliferation cellular, even when combined with Dex. The mineralization of matrix was positive only in the group treated with Dex, and negative in the groups treated with TGFb1 and TGFb1+Dex. OPN and BSP were not immunoreactive only negative, already the FN was immunoreactive in all groups.The mineralizing was confirmed in the positive control and Dex, through TEM. Some morphological changes were seen in cells treated with TGFb1 and TGFb1+Dex. This study showed that TGFb1 inhibits the mineralization, changing the viability, proliferation and cell morphology, even when treated with Dex.

Tem sido sugerido que um adequado reparo ósseo pode ser obtido por biomateriais híbridos, produzidos pela combinação de células e materiais substitutos ósseos macroporosos. O objetivo geral do presente estudo foi avaliar a aplicação do biomaterial híbrido formado pelo arcabouço de PLGA/CaP e células-tronco mesenquimais e osteoblastos derivados de medula óssea na engenharia de tecido ósseo. Para verificar qual o tamanho de poro deste arcabouço é mais adequado para este fim, foram realizados experimentos in vitro, que avaliaram a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e expressão quantitativa de genes marcadores do fenótipo osteoblástico em células cultivadas sobre os arcabouços; e in vivo, que avaliaram a formação óssea após implantação do arcabouço em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. Também foi avaliado o efeito do tamanho dos poros sobre o carreamento celular através da força centrifuga. Para avaliar o efeito do soro fetal bovino, utilizado na suplementação do meio de cultura celular, na resposta tecidual in vivo, arcabouços expostos ao soro foram implantados em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. O efeito da retirada do soro fetal bovino do meio de cultura sobre osteoblastos foi analisado através da proliferação celular, atividade de ALP, conteúdo de proteína total e mineralização. Para avaliar o efeito do estágio de diferenciação celular sobre a formação óssea, células em diferentes estágios de diferenciação osteoblástica associadas ao arcabouço de PLGA/CaP foram implantadas de forma autóloga em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. Arcabouços com tamanhos de poros de aproximadamente 1000 µm promovem maior diferenciação osteoblástica e melhor carreamento celular, enquanto arcabouços com poros de aproximadamente 500 µm promovem maior formação óssea e vascular in vivo. O soro fetal bovino influenciou negativamente a resposta tecidual e a formação óssea. A retirada do soro fetal bovino do meio de cultura reduziu a proliferação celular e a atividade de ALP sem afetar o conteúdo de proteína total e a formação de matriz mineralizada. Células-tronco mesenquimais indiferenciadas e em fase inicial de diferenciação osteoblástica (7 dias) promoveram maior formação óssea, portanto permitiriam a obtenção de um biomaterial híbrido com maior potencial osteogênico. / It has been suggested that an adequate bone repair can be obtained by hybrid biomaterials, produced by combining osteoprogenitor cells and macroporous bone substitutes. The aim of this study was to evaluate the application of hybrid biomaterial formed by PLGA/CaP scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts in bone tissue engineering. The effect of scaffold pore size was evaluated in vitro assessing cell growth, alkaline phosphatase (ALP) activity, and quantitative gene expression of osteoblastic phenotype markers in osteoblasts cultured on scaffolds; and in vivo assesseing bone formation after implantation of scaffolds in critical size rat calvaria defects. It was also evaluated the effect of pore size on cell seeding by centrifugal force. To evaluate the effect of fetal calf serum used to supplement the cell culture medium on in vivo tissue response, scaffolds exposed to serum were implanted in critical size rat calvaria defects. The effect of withdrawal of fetal calf serum in the culture medium on osteoblasts was analyzed by cell growth, ALP activity, total protein content and mineralization. To evaluate the effect of cell differentiation stage on bone repair, cells either undifferentiated or in different stages of osteoblast differentiation associated with the PLGA/CaP were implanted autologously in critical size rat calvaria. Scaffolds with pore sizes of around 1000 µm would favor the osteoblast differentiation and display a better cell seeding, while the scaffolds with pore sizes of around 500 µm would favor increased bone and vascular formation. The fetal calf serum influenced negatively the in vivo tissue response and bone formation. The withdrawal of fetal calf serum in the culture medium reduced cell growth and ALP activity without affecting the total protein content and the formation of mineralized matrix Mesenchymal stem cells and osteoblats at the early stage of differentiation (7 days) promoted greater bone formation, therefore they would allow the obtention of a hybrid biomaterial with higher osteogenic potential.

Tem sido sugerido que um adequado reparo ósseo pode ser obtido por biomateriais híbridos, produzidos pela combinação de células e materiais substitutos ósseos macroporosos. O objetivo geral do presente estudo foi avaliar a aplicação do biomaterial híbrido formado pelo arcabouço de PLGA/CaP e células-tronco mesenquimais e osteoblastos derivados de medula óssea na engenharia de tecido ósseo. Para verificar qual o tamanho de poro deste arcabouço é mais adequado para este fim, foram realizados experimentos in vitro, que avaliaram a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e expressão quantitativa de genes marcadores do fenótipo osteoblástico em células cultivadas sobre os arcabouços; e in vivo, que avaliaram a formação óssea após implantação do arcabouço em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. Também foi avaliado o efeito do tamanho dos poros sobre o carreamento celular através da força centrifuga. Para avaliar o efeito do soro fetal bovino, utilizado na suplementação do meio de cultura celular, na resposta tecidual in vivo, arcabouços expostos ao soro foram implantados em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. O efeito da retirada do soro fetal bovino do meio de cultura sobre osteoblastos foi analisado através da proliferação celular, atividade de ALP, conteúdo de proteína total e mineralização. Para avaliar o efeito do estágio de diferenciação celular sobre a formação óssea, células em diferentes estágios de diferenciação osteoblástica associadas ao arcabouço de PLGA/CaP foram implantadas de forma autóloga em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. Arcabouços com tamanhos de poros de aproximadamente 1000 µm promovem maior diferenciação osteoblástica e melhor carreamento celular, enquanto arcabouços com poros de aproximadamente 500 µm promovem maior formação óssea e vascular in vivo. O soro fetal bovino influenciou negativamente a resposta tecidual e a formação óssea. A retirada do soro fetal bovino do meio de cultura reduziu a proliferação celular e a atividade de ALP sem afetar o conteúdo de proteína total e a formação de matriz mineralizada. Células-tronco mesenquimais indiferenciadas e em fase inicial de diferenciação osteoblástica (7 dias) promoveram maior formação óssea, portanto permitiriam a obtenção de um biomaterial híbrido com maior potencial osteogênico. / It has been suggested that an adequate bone repair can be obtained by hybrid biomaterials, produced by combining osteoprogenitor cells and macroporous bone substitutes. The aim of this study was to evaluate the application of hybrid biomaterial formed by PLGA/CaP scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts in bone tissue engineering. The effect of scaffold pore size was evaluated in vitro assessing cell growth, alkaline phosphatase (ALP) activity, and quantitative gene expression of osteoblastic phenotype markers in osteoblasts cultured on scaffolds; and in vivo assesseing bone formation after implantation of scaffolds in critical size rat calvaria defects. It was also evaluated the effect of pore size on cell seeding by centrifugal force. To evaluate the effect of fetal calf serum used to supplement the cell culture medium on in vivo tissue response, scaffolds exposed to serum were implanted in critical size rat calvaria defects. The effect of withdrawal of fetal calf serum in the culture medium on osteoblasts was analyzed by cell growth, ALP activity, total protein content and mineralization. To evaluate the effect of cell differentiation stage on bone repair, cells either undifferentiated or in different stages of osteoblast differentiation associated with the PLGA/CaP were implanted autologously in critical size rat calvaria. Scaffolds with pore sizes of around 1000 µm would favor the osteoblast differentiation and display a better cell seeding, while the scaffolds with pore sizes of around 500 µm would favor increased bone and vascular formation. The fetal calf serum influenced negatively the in vivo tissue response and bone formation. The withdrawal of fetal calf serum in the culture medium reduced cell growth and ALP activity without affecting the total protein content and the formation of mineralized matrix Mesenchymal stem cells and osteoblats at the early stage of differentiation (7 days) promoted greater bone formation, therefore they would allow the obtention of a hybrid biomaterial with higher osteogenic potential.