Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-24T17:46:13Z No. of bitstreams: 2 Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T10:54:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T10:54:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) / Introdução: A marcação e o rastreamento de células-tronco in vivo são técnicas não invasivas que permitem visualizar o deslocamento das células dentro do organismo e o quanto efetivamente elas migram para locais patologicamente afetados, a fim de aperfeiçoar terapias celulares. Alguns materiais comumente usados como marcadores de células-tronco são nanopartículas metálicas; entretanto, sabe-se que estes componentes podem ser prejudiciais para as células receptoras, tornando-se importante a realização de estudos preliminares de biocompatibilidade antes de marcar e rastreá-las in vivo. Objetivo: Verificar se nanopartículas de óxido de ferro e de ouro, ambas funcionalizadas com ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA), podem atuar como traçadores para células-tronco mesenquimais de polpa dental (pdCTMs), sem afetar sua fisiologia e, ao mesmo tempo, permitindo a visualização e rastreamento destas por microtomografia computadorizada em um modelo murino de fibrose pulmonar. Métodos: a) A toxicidade de ambas as nanopartículas sobre as pdCTMs foi avaliada através de ensaios de viabilidade celular com MTT e Azul de Tripan; das análises morfológicas das células marcadas em microscopia de luz; e da análise em microscopia eletrônica de transmissão (MET). b) A visualização e mensuração da interiorização das nanopartículas Fe-DMSA foi realizada por meio da técnica de coloração "Azul da Prússia" e pela dosagem colorimétrica deste corante, respectivamente. A visualização e quantificação do uptake das nanopartículas Au-DMSA foi realizada por análise em microscopia confocal e por espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES), respectivamente. c) Verificou-se se houve alterações de parâmetros fisiológicos como: diferenciação osteogênica e adipogênica; taxas de proliferação; e supressão linfocitária nas pdCTMs marcadas com as nanopartículas. d) Empregou-se o modelo murino de fibrose pulmonar, induzida por bleomicina, para dar suporte teórico sobre a migração das pdCTMs marcadas quando inoculadas por duas vias de administração: intravenosa e intranasal. e) Testou-se o uso da Fe-DMSA e da Au-DMSA como traçadores de pdCTMs, verificando a eficiência de detecção destas, em microtomografia computadorizada. Após a inoculação de 5x10? células marcadas em camundongos, estes foram analisados diariamente no equipamento. Resultados: Não houve redução estatisticamente significativa da viabilidade das pdCTMs e não foram detectados, em microscopia de luz, sinais característicos de morte celular na presença do Fe-DMSA e Au-DMSA, em todas as concentrações testadas. Fotos obtidas por MET comprovaram a presença destas nanopartículas no citoplasma celular: observou-se as Au-DMSA e as Fe-DMSA associadas a algumas organelas, principalmente mitocôndrias, provocando alterações ultraestruturais nestas. Assim, estas imagens sugerem toxicidade mitocondrial e formação de corpos apoptóticos, principalmente nas pdCTMs expostas ao Fe-DMSA. Os testes de mensuração de interiorização indicaram uma quantidade média de 17 picogramas (pg) de Fe-DMSA em cada célula e4pg de Au-DMSA/célula. Também não houve alterações significativas das taxas de adipogênese e osteogênese; das curvas de crescimento e da inibição de proliferação linfocitária entre pdCTMs marcadas e nãomarcadas. Apesar da biocompatibilidade entre as nanopartículas e as células, tanto o Au- DMSA quanto o Fe-DMSA não puderam ser detectados no microtomógrafo, após serem incorporados pelas pdCTMs. Conclusões: Embora assegurado, em termos de biocompatibilidade, o uso de Fe-DMSA e Au-DMSA como marcadores de pdCTMs, estas nanopartículas metálicas mostraram não ser adequadas para visualização e rastreamento in vivo das células por microtomografia, tendo em vista que não foram detectadas pelo equipamento, nas concentrações testadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Labeling and Tracking stem cells in vivo are noninvasive techniques that allow visualizing the movement of cells within the body and how effectively they migrate to pathologically affected sites, in order to improve cellular therapies. Some materials commonly used as stem cells markers are metallic nanoparticles; however, it is known that these components can be prejudicial to receptor cells, hence it is important to perform preliminary biocompatibility studies before label and track them in vivo. Objective: Assess if iron oxide and gold nanoparticles, both functionalized with 2,3-dimercaptosuccinic (DMSA) acid, can act as tracers for mesenchymal stem cells from dental pulp (dpMSCs), without affecting their physiology and, at the same time, allowing the visualization and tracking of these in a computed microtomography apparatus, based on an experimental model of pulmonary fibrosis. Methodology: a) The toxicity of both nanoparticles on dpMSCs was assessed by MTT and Trypan Blue viability assays; by morphological analysis of labeled cells under light microscopy; and by analysis in transmission electron microscopy (TEM). b) The visualization and measurement of nanoparticles Fe-DMSA uptake were performed by "Prussian Blue" staining technique and by colorimetric dosage of this dye, respectively. Visualization and uptake quantification of Au-DMSA nanoparticles were performed by confocal microscopy and analysis by optical emission spectrometry with inductively coupled plasma (ICP-OES), respectively. c) Changes in physiological parameters, such as osteogenic and adipogenic differentiation; proliferation rates; and lymphocyte suppression, were checked in labeled dpMSCs. d) A murine model of pulmonary fibrosis, induced by bleomycin, was employed to give theoretical support about the labeled dpMSCs’ migration when inoculated by two routes of administration: intravenous and intranasal. e) After inoculation of 5x10 ⁵ labeled cells in mice, these were analyzed daily in the microtomograph in order to detect uptaken Fe-DMSA and Au-DMSA, checking their efficiency as tracers of dpMSCs. Results: There was no statistically significant reduction in the dpMSCs viability and characteristic signs of cell death were not detected by light microscopy analysis, after Fe-DMSA and Au-DMSA uptake, at all concentrations tested. Photos obtained by TEM confirmed the presence of these nanoparticles in the cytoplasm: Fe-DMSA and Au-DMSA were observed associated to some organelles, especially mitochondria, causing structural changes there. Hence mitochondrial toxicity and formation of apoptotic bodies was observed, especially in dpMSCs exposed to Fe DMSA. The uptake measurement tests indicated an average amount of 17 picograms (pg) of Fe-DMSA per cell and 4 pg of Au-DMSA per cell. There were also no significant changes in adipogenesis and osteogenesis; growth curves and inhibition of lymphocyte proliferation between labeled and unlabeled dpMSCs. Although the biocompatibility between both nanoparticles and cells was proved, Fe-DMSA as well as Au-DMSA could not be detected in microtomograph after being incorporated by dpMSCs. Conclusions: In terms of biocompatibility, the use of Fe-DMSA and Au-DMSA as tracers for dpMSCs was assured. However, these metal nanoparticles shown to be not suitable for visualization and tracking of these cells in vivo by computed microtomography, considering that they were not detected by the equipment, at the concentrations tested.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Bioética, 2012. / Submitted by Marília Freitas (marilia@bce.unb.br) on 2013-01-29T15:13:03Z No. of bitstreams: 1 2012_NatanMonsoresdeSa.pdf: 2634629 bytes, checksum: 64416fa9ad41de97cdc914bad9d7a25a (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2013-01-31T13:29:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_NatanMonsoresdeSa.pdf: 2634629 bytes, checksum: 64416fa9ad41de97cdc914bad9d7a25a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-31T13:29:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_NatanMonsoresdeSa.pdf: 2634629 bytes, checksum: 64416fa9ad41de97cdc914bad9d7a25a (MD5) / O objetivo desta tese é a investigação da circulação de conteúdos morais acoplados ao discurso biotecnocientífico, em particular, aqueles discursos sobre a utilização de células-tronco em pesquisas e terapias veiculados pela mídia televisiva. A partir da compreensão que a reflexão bioética é a análise das dimensões éticas dos discursos em/sobre biotecnociência, buscou-se avaliar o papel e as práticas argumentativas de diferentes interlocutores sociais, quando se manifestam publicamente sobre questões da biomedicina regenerativa. O pano de fundo conceitual para análise se baseia nas noções de discurso e de sua circulação por Foucault e Maingueneau, assim como na análise do papel da mídia por Bourdieu. O desenho metodológico do trabalho é documental e se deu em dois momentos centrais: análise de conteúdo, segundo Bardin; e análise de discurso, segundo a tradição francesa. Escolheu-se 317 matérias televisivas entre 1998 e 2010 dos quatro principais telejornais da Rede Globo de Televisão. Os programas selecionados tiveram seus roteiros transcritos e submetidos às análises. A análise de conteúdo demonstrou que há a utilização preferencial de termos que reforçam conflitos religiosos ou políticos, assim como pares de oposição (morte/vida; saúde/doença) que podem ser indícios de organização ideológica dos discursos midiáticos em prol da utilização de célula-tronco. A mítica de resultados, também frequente, pode induzir a sociedade a uma aceitabilidade maior das pesquisas sem uma avaliação imparcial de todas as consequências. Numa segunda etapa, realizou-se análise de discurso de uma subamostra do corpus, onde demonstrou-se que a abertura da estrutura comunicacional à diversidade moral não parece ser plena, já que parece haver um compromisso valorativo com o desenvolvimento das pesquisas com células-tronco (discurso biotecnofílico). A investigação evidenciou que a principal estratégia discursiva dos enunciadores do campo da biotecnociência no corpus foi a antecipação dos lucros pelo discurso de um saber já fechado e cheio de certezas, conduzindo a um fenômeno de alienação do risco. O modelo hipercrítico de bioética que foi adotado aponta para a necessidade de desenvolver-se atitude crítica em relação aos discursos morais circulantes, como caminho possível para desconstruir qualquer forma de biopolítica negativa, garantindo a autonomia em decidir de forma livre e esclarecida, que não pode ser sobrepujada por qualquer forma de lucro no mercado simbólico das moralidades. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this thesis is investigate the circulation of moral contents attached to biotechnoscientific discourse, in particular, the television mediated discourses on use of stem cells in research and therapies. From understanding that bioethical reflection is an analysis of discourses ethical dimensions in/on biotechnoscience, we evaluated the role and argumentative practices of different social actors, when they speech about regenerative biomedicine. The background to conceptual analysis is based on Foucault´s and Maingeneau´s notions of discourse, as well as Bourdieu´s notion of media role. The methodological design of study is documental and has two key moments: content analysis (Bardin), and discourse analysis (French tradition). We chose 317 TV reports between 1998 and 2010 from the four major newscasts of Globo TV. The selected programs have had their scripts transcribed and submitted to analysis. The content analysis showed that there is preferential use of terms that reinforce religious or political conflicts, as well as opposing pairs (life / death, health / disease) that may be evidence of ideological organization of media discourse in favor of stem cells. The mythology of results, also common, may lead society to a greater acceptance of research without an impartial assessment of all consequences. In a second step, a discourse analysis was performed for a subsample of corpus, where was showed that the opening of communicational structure to moral diversity is limited, was a preferential commitment to development of research on stem cells field (biotecnophilic discourse). We found that main discursive strategy of speakers from the field of biotechnology was an anticipation of profits, by discourse of a well established knowledge, leading to a risk transfer phenomenon. The hypercritical model of bioethics that was adopted led us to a need: to develop a critical attitude towards the circulation of moral discourses as a possible path to deconstruct any forms of negative biopolitics, ensuring the autonomy to decide in a free and enlightened way, which cannot be overcome by any form of profit in morals symbolic market.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-15T11:39:02Z No. of bitstreams: 1 Dissert_NatanMonsoresSa_parcial.pdf: 380585 bytes, checksum: 6fa4e76352040f88239a508b0e6d01dc (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-09T22:22:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_NatanMonsoresSa_parcial.pdf: 380585 bytes, checksum: 6fa4e76352040f88239a508b0e6d01dc (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-09T22:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_NatanMonsoresSa_parcial.pdf: 380585 bytes, checksum: 6fa4e76352040f88239a508b0e6d01dc (MD5) Previous issue date: 2007 / O propósito deste estudo é a discussão dos elementos que compõem o atual debate sobre a biomedicina regenerativa, apontando os avanços e fragilidades na pesquisa com células-tronco no mundo e, particularmente, no contexto brasileiro, a fim de delimitar as variáveis bioéticas implicadas neste campo das ciências biomédicas. Para tal, fez-se uma recursão ao estado de arte técnico da pesquisa, bem como ao panorama ético-epistemiológico em que se situa, de modo a facilitar a compreensão das nuances do debate no Brasil. A metodologia de escolha para realização deste trabalho baseia-se na análise, avaliação e integração de informações disponíveis sobre o tema, na tentativa de explicar o atual contexto brasileiro (metodologia analítica). A análise do material obtido permite situar os questionamentos sobre células-tronco em três esferas: os desafios biológicos, os problemas técnicos e as questões bioéticas. Destaca-se que a incipiência da pesquisa no Brasil torna necessária a discussão pública sobre as conseqüências das aplicações da biomedicina regenerativa, isto é, a urgência em se estabelecer com clareza protocolos de pesquisas em terapias celulares. Partindo de pressupostos da complexidade Bioética, isto é, considerando que o pensamento bioético complexo seja capaz de considerar a pletora de influências recebidas, conclui-se também a necessidade de discutir os aspectos bioéticos desta nova área através de uma abordagem baseada nos princípios de cautela e responsabilidade, a fim de salvaguardar os direitos dos sujeitos vulneráveis envolvidos nas pesquisas. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The purpose of this study is to discuss the elements of the current debate on the regenerative biomedicine, highlighting progress and fragilities in stem cells research around the world, particularly in Brazilian context, in order to define bioethical and biomedical variables. For this purpose, has been a recursion to the state of art of research, as well as the ethical and epistemological issues, to improve the Brazilian’s debate. The methodology of choice was based on analysis, evaluation and integration of available data, in an attempt to explain the current Brazilian context (analytical methodology). The analysis of the material allows locating the questions about stem cells in three spheres: the biological challenges, the technical problems and bioethical issues. The incipience of this research in Brazil become necessary public discussion about the consequences regenerative biomedicine use, ie, the urgency to establish clear protocols to cellular therapies. Whereas the bioethical complexity, that considering the complex bioethical thought is able to think the plethora of influences, is concluded that is necessary to discuss the bioethical aspects of this new area through an approach based on the principles of caution and responsibility, in order to safeguard the rights of vulnerable subjects involved in the research.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-06-03T16:23:15Z No. of bitstreams: 1 2010_FelipeFeitosaOliveira.pdf: 1843561 bytes, checksum: c6c6d374ac69e9591a81a33ec3a3d3b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-10T18:49:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_FelipeFeitosaOliveira.pdf: 1843561 bytes, checksum: c6c6d374ac69e9591a81a33ec3a3d3b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-10T18:49:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_FelipeFeitosaOliveira.pdf: 1843561 bytes, checksum: c6c6d374ac69e9591a81a33ec3a3d3b5 (MD5) / Este trabalho descreve a síntese, caracterização e aplicação de novos sistemas fluorescentes utilizando compostos do tipo 2-(2’-hidroxifenil) benzazóis acoplados com o núcleo 2,1,3-benzotiadiazola. Os novos sistemas fluorescentes foram sintetizados utilizando um acoplamento do tipo Buchwald-Hartwig e foram plenamente caracterizados. Suas características físico-físicas, com ênfase na foto-física, foram investigadas e suas propriedades como sondas fluorescentes foram determinadas. Para isso foram realizadas titulações espectrofotométricas e espectrofluorimétricas utilizando dsDNA e a proteína BSA. Além disso, estudos de variação de pH e de voltametria cíclica foram realizados para testar sua estabilidade em diferentes condições. Por fim, os sistemas foram aplicados em estudos de live-cell imaging, comprovando sua eficácia como marcadores seletivos de dsDNA nuclear em sistemas biológicos utilizando células-tronco humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work describes the synthesis, characterization and application of new systems using fluorescent compounds such as 2 - (2'-hydroxyphenyl) benzazoles coupled with 2,1,3-benzothiadiazole core. The new fluorescent systems were synthesized using Buchwald-Hartwig cross coupling reaction and were fully characterized. Physical chemical properties, especially photophysical properties, were investigated and the applications as fluorescent probes were investigated. To achieve this goal, it was performed spectrophotometric and spectrofluorimetric titrations using dsDNA and BSA protein. Moreover, studies of pH-dependence and cyclic voltammetry were conducted to test the stability under different conditions. Finally, the systems were applied in live-cell imaging experiments, proving the effectiveness and selectivity as nuclear dsDNA staining dyes for biological systems using human stem-cells.

Resumo não disponível

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres. / Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.

Células-tronco mesenquimais (CTMs) estão entre os tipos de células-tronco encontradas a partir da fase fetal até a vida adulta de um indivíduo. As CTMs caracterizam-se pela morfologia similar à de fibroblastos associada à presença das proteínas de superfície celular CD73, CD90 e CD105, não apresentando expressão de marcadores hematopoiéticos, tais como CD34 e CD45. As CTMs são consideradas multipotentes e capazes de diferenciarem-se em osteoblastos, adipócitos e condroblastos. Além de humanos, as CTMs já foram isoladas de uma série de organismos modelo, dentre eles o camundongo e o frango doméstico (Gallus gallus). Apesar de pouco difundido nesse campo de estudo, o modelo G. gallus apresenta uma série de características que o torna uma alternativa interessante ao modelo murino. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar molecularmente as CTMs deincubação. Como resultado, obtiveram-se células com as características esperadas para uma CTM clássica. As CTMs isoladas apresentaram morfologia característica, expressão das proteínas de superfície CD73, CD90 e CD105 e ausência de marcadores hematopoiéticos. Além disso, as células mostraram-se capazes de diferenciarem-se em osteoblastos e pré-adipócitos. No entanto, as células isoladas de coração, apesar de apresentarem características de CTMs, foram incapazes de diferenciarem-se em adipócitos. A análise do perfil transcricional destas células, em comparação às obtidas de medula óssea, revelou que as mesmas superexpressam genes relacionados a morfogênese cardíaca, a angiogênese, a diferenciação de células de músculo cardíaco e a coagulação sanguínea. Considerando as características apresentadas pelas células isoladas de músculo cardíaco, existe a possibilidade de ter havido o isolamento de um tipo específico de célula-tronco cardíaca denominada de células derivadas de epicárdio (EDPCs – do inglês Epicardium derived cells). Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho indicam que é possível isolar CTMs de medula óssea e músculo esquelético de fetos de frango. No entanto, as células obtidas de músculo cardíaco reúnem características de potenciais EPDCs e mais estudos são necessários para determinar a sua identidade. / Mesenchymal stem cells (MSC) are found in both fetal and adult individuals. MSC are characterized by their fibroblast-like morfology, the expression of the surface proteins like CD73, CD90 and CD105 and absence of hepatopoietic markers, such as CD34 e CD45. Besides, MSC are considered multipotent stem cells due to their capacity to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts. MSC have been already isolated from human being and several model organisms, as mice and chicken (Gallus gallus). Unfortunately, G. gallus is not widely applied for the study of MSC, but it can be an interesting alternative to the murine model. In this context, the aim of this work was to isolate and molecularly characterize MSC derived from bone marrow, cardiac and skeletal muscle of 18-19 days chicken fetuses. Cells isolated from bone marrow and skeletal muscle presented the expected characteristics for MSC. They expressed CD73, CD90 and CD105, but were negative for hematopoietic markers. Moreover, the cells were able to differentiate into osteoblastic and adipogenic lineages. Cells obtained from cardiac muscle presented the same molecular and morphological characteristics, except that they were not able to differentiate into adipocytes. Transcriptional profile analysis of cardiacderived cells revealed that they overexpress genes related to heart morphogenesis, angiogenesis processess, smooth muscle cells differentiation and blood coagulation. There is a possibility that cells isolated from cardiac muscle are of an specific type named epicardium derived cells (EPDCs). The results obtained in this work point that is possible to isolate MSC from bone marrow and skeletal muscle from chicken fetuses. Nevertheless, cells obtained from cardiac muscle gather characteristics of putative EPDCs and further studies are necessary to elucidate the real identity of cardicac muscle isolated cells.

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados. / As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-10T22:53:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gisely Juliane Barbosa de Albertim.pdf: 3413482 bytes, checksum: 3b7142ff44bc24f648147cb01ae4d8dc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T22:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gisely Juliane Barbosa de Albertim.pdf: 3413482 bytes, checksum: 3b7142ff44bc24f648147cb01ae4d8dc (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / CNPQ / FACEPE / A regulação do volume celular é importante em vários processos fisiológicos. A diminuição regulatória do volume (RVD) é o processo pelo qual as células recuperam o seu volume após terem sido submetidas a um choque hipoosmótico. Este processo se deve principalmente à liberação de K⁺ e Cl⁻ através de canais e transportadores iônicos. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação dos canais de potássio e canais de cloreto envolvidos na RVD e na proliferação das células-tronco mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical humano (hWJ-MSCs). As hWJ-MSCs foram isoladas de acordo com a técnica de migração espontânea do explante. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 15 % soro fetal bovino, 10 % F-12, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina e mantidas em atmosfera de 5% de CO₂ a 37 °C. Nos experimentos da RVD, as hWJ-MSCs foram depositadas em uma cubeta acoplada a um microscópio invertido com um sistema de vídeo imagem, sendo submetidas inicialmente a um choque hipoosmótico (300 mOsm→200 mOsm) por perfusão. A dinâmica de variação do volume foi monitorada por 30 min e as imagens antes (300 mOsm) e durante o choque hipoosmótico (200 mOsm) foram obtidas a cada minuto e analisadas usando o software ImageJ. As hWJ-MSCs foram submetidas aos seguintes inibidores de canais: tetraetilamônio (TEA) 10 mM, (canal de Kv); glibenclamida (GB) 100 µm, (canal de Kir6.x); 4-aminopiridina (4-AP) 5 mM, (canal de Kv1, KCNA), Iberiotoxina (IBTX) 10 nM (canal BKca), (ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino) benzóico (NPPB), (canal de Cl⁻ ), ácido disulfônico di-isocianatoestilbeno (DIDS) 100 µm e Tamoxifeno (TAM) 10 µm. Posteriormente, as células foram submetidas aos ensaios de MTT, curva de crescimento, quantificação do conteúdo de DNA e RT-PCR. A técnica de patch clamp na configuração Whole-cell foi empregada para caracterização das correntes iônicas. Os dados foram analisados usando o teste t Student’s ou ANOVA, com pós-teste de Tukey ou de Bonferroni. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A RVD presente nas hWJ-MSCs foi suprimida na presença dos inibidores de canais de potássio e de canais de cloreto. As hWJ-MSCs apresentaram três perfis de corrente iônica: Maxi K (BK ou Kca); corrente de potássio transiente de saída (Ito) e uma corrente de retificação tardia (Kᴅʀ). As hWJ-MSCs na presença dos inibidores de canais iônicos reduziram a proliferação permanecendo na fase G0/G1 do ciclo celular. As hWJ-MSCs expressaram os canais de potássio (MaxiK, KCND2, KCND3, KCNS1, KCNH2 e KCNH1) e os canais de cloreto (pl-VDAC e CLCN3). Deste modo, conclui-se que os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv), canais de potássio dependentes de ATP, ativados por cálcio de alta condutância (Kca) e canais de cloreto participam no mecanismo da RVD e consequentemente interferem na proliferação das hWJ-MSCs. / Cell volume regulation is one of the most fundamental homeostatic mechanisms and essential for normal cellular function. The phenomenon of shrinkage and / or cell swelling caused by osmotic changes are called regulatory volume increase (RVI) and regulatory volume decrease (RVD), respectively. The RVD is the process by which cells recovery its volume after being subjected to hypoosmotic environment. This process occurs due to release K⁺ and Cl⁻ through ion channels and transporters. The aim of this study was to investigate the involvement of ionic channels involved in RVD and proliferation of mesenchymal stem cells from Wharton's Jelly of the human umbilical cord (hWJ-MSCs). The hWJ-MSCs were isolated according to the spontaneous migration of the explant technique. Cells were grown in DMEM supplemented with 15% fetal bovine serum, 10 % F-12, 100 U / ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin and maintained in an atmosphere of 5 % CO₂ at 37 °C. In the experiments the RVD, the hWJ-MSCs were placed in a chamber coupled to an inverted microscope with a video image system and initially subjected to shock hypo-osmotic (300 mOsm → 200 mOsm) perfusion. The dynamics of volume change was monitored for 30 minutes before (300 mOsm) and during hypo-osmotic shock (200 mOsm) and the images (every min) analyzed using the ImageJ software. Specific cation channel inhibitors such as tetraethylammonium (TEA) 10 mM (Kv channel); glibenclamide (GB) 100 μm (Kir6.x channel); 4-aminopyridine (4-AP) 5 mM (Kv1 channel KCNA), iberotoxin (IBTX) 10 nM (BKCa channel) and cellular anion inhibitors (5-Nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB) (Cl⁻channel), disulfonic acid di-isocianatoestilben- (DIDS) 100 μm (Cl⁻ channel) and tamoxifen (TAM) 10 μm (Cl- channel) were used as molecular tools to evaluate the influence of ion channels in regulate mechanism RVD and cell proliferation. Subsequently, the cells were subjected to MTT assay, growth curve, flow cytometer to quantify the DNA content and RT-PCR. The patch clamp technique in Whole-cell configuration was employed to characterize the ionic currents. For statistical analysis, one-way ANOVA followed Tukey's or Bonferroni post hoc test were performed. A p-value less than 0.05 were considered statistically significant. The RVD in hWJ-MSCs was abolished in the presence of ionic channels inhibitors (potassium and chloride). The electrophysiological recording presents, at least, three different profiles compatible with: noisy current as a Maxi K current (BK or Kca), transient outward K+ current (Ito) and a slower activating delayed rectifier (Kᴅʀ). Also showed that hWJ- MSCs in the presence of the ionic channel inhibitors reduced the cell proliferation and arrest cells in G0/G1 cell cycle stage. As hWJ-MSCs expressed of the potassium channels (MaxiK, KCND2, KCND3, KCNS1, KCNH2 and KCNH1) and chloride channels (pl-VDAC and CLCN3). The results showed that there are a relationship of cell cycle progression and membrane permeability. Thus, we concluded that there is participation of KATP, BKCa Kv and Cl⁻ channels in the mechanism of RVD and proliferation of hWJ-MSCs.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Celulas tronco mesenquimais (CTM) de suinos tem sido isoladas previamente da medula ossea e do tecido adiposo. Tem sido demonstrado que essas celulas sao capazes de se diferenciar em osso, cartilagem e gordura, mas o potencial de diferenciacao muscular e cardiomiogenica das CTM de suinos ainda nao foram demonstrados. As celulas tronco (CT) derivadas do tecido adiposo podem ser bons candidatos para a engenharia tecidual cardiaca, uma vez que podem ser obtidas de pacientes atraves de um metodo simples e minimamente invasivo e em grandes quantidades. O porco e um modelo animal comum em pesquisas pre-clinicas usando CTM humanas devido a similaridade entre as duas especies em anatomia, fisiologia e manifestacao de doencas. Objetivos: o objetivo deste estudo foi realizar o isolamento e caracterizacao as CTM de tecido adiposo da especie suina e realizar diferenciacao muscular e cardiomiogenica. Metodologia: fragmentos de tecido adiposo foram usados para isolar progenitores e CT de porcos adultos saudaveis. As CT de tecido adiposo de suino foram isoladas de acordo com o protocolo estabelecido para CTM de tecido adiposo humano. Celulas isoladas foram caracterizadas quanto a expressao de marcadores de CT e progenitores. Alem disso, ensaios de diferenciacao e avaliacao do potencial teratogenico tambem foram realizados. Resultados: Nas primeiras passagens do cultivo foi possivel distinguir duas populacoes distintas compostas por celulas epitelial-simile e fibroblast-simile. Contudo, na quarta passagem a cultura de CTM de tecido adiposo de suinos era composta apenas por celulas fibroblast-simile. Nas primeiras passagens as celulas foram positivas para oct-4, sox2, nanog, CD44, CD90, CD105, vimentina, fibronectina, nestina citoqueratina-pan, e-caderin e conexin- 43. Adicionalmente, em passagens altas as celulas fibroblast-simile foram imunopositivas para oct-4, CD44, e-caderin e PCNA e negativas para citoqueratinapan. Estas celulas foram capazes de diferenciar-se em celulas de origem mesodermal como: osso, cartilagem e gordura. Alem disso, as CTM de tecido adiposo de suinos sob condicoes de cultivo miogenico foram capazes de se diferenciar em celulas musculares e cardiomiocitos. Os cardiomiocitos expressaram marcadores especificos como gata-6 e cardiotin. E finalmente, as CTM de tecido adiposo de suino, quando injetadas em camundongos imunossuprimidos nao formaram teratomas. Conclusao: nossos dados sugerem que as celulas tronco isoladas do tecido adiposo de suinos apresentam caracteristicas semelhantes as mesmas humanas com capacidade de se diferenciar em varios tecidos mesodermais incluindo cardiomiocitos / BV UNIFESP: Teses e dissertações